Vitales Simples: azul de metileno, fucsina bsica, violeta de genciana.

Compuestas o Especiales: Wirtz, Anthony, Leifson, Giemsa, Feulgen, Macchiavello, Castaeda, Gram o Diferenciales: Gram, Acido-Alcohol-Resistente (Ziehl Neelsen)

Coloraciones especiales:

Esporas: Tcnica de Wirtz (Verde de Malaquita, lavado con Safranina) Cpsulas: Tcnica de Anthony (sin fijar, Cristal Violeta, lavado con sulfato de cobre) Flagelos: Tcnica de Leifson (Fucsina bsica, ac. tnico) Membrana plasmtica: Giemsa, Solucin iodo-iodurada, etc. Pared celular: Ac. tnico, azul Victoria. Ncleo: Feulgen RICKETTSIAS: Gram (son negativas), Giemsa, Macchiavello, Castaeda MICOPLASMAS: Gram (son negativas), Giemsa, Romanowsky

7) Cul es el fundamento de la coloracin de Gram?

Se fundamenta en que, luego de ser teidas con Cristal Violeta, al lavar con alcohol hay un tipo de bacterias que decoloran y otras que se mantienen coloreadas. Las que mantienen el cristal violeta en su interior se observarn de color violeta, y las otras se observarn rosadas gracias a un coloreado de contraste con Safranina.

8) Cules son las teoras que tratan de explicar la coloracin de Gram?

Teora qumica: cristal violeta + iodo + protenas bacterianas = Protena-iodoPararosaanilina Teora del Ribonucleato de Magnesio: protena propia de las bacterias Gram(+) Punto isoelctrico: cristal violeta = pH 7. Mayor afinidad a Gram(+) que tienen pH mas bajo. Permeabilidad: las Gram(-) poseen ms lpidos en sus parades que son solubilizados por el alcohol, permitiendo que escape el colorante en el lavado.

9) Cul es el fundamento de la coloracin de Z. Neelsen?

Algunas bacterias son difciles de colorear, pero una vez coloreadas son resistentes a la decoloracin por alcohol-cido. Estas bacterias poseen en su pared celular Acido Miclico. El colorante (fenol) es ms soluble en stos lpidos que en el decolorante.

10) Cules son los datos que obtiene con cada una de las coloraciones aprendidas?

Vitales*: o Entre porta y cubre: movilidad, morfologa, agrupaciones, densidad o Gota colgante: movilidad Simples: morfologa y agrupaciones Compuestas especiales: estructuras especficas Compuestas diferenciales: diferenciacin de tipo de microorganismo

* Se mencionan las tcnicas de observacin en fresco con el agregado de un colorante vital.

11) En qu casos se usan las coloraciones simples?

Cundo slo se desea observar morfologa y agrupaciones.

12) Utilizando un buen microscopio ptico compuesto, con un poder de resolucin de 0,3 um, un ocular de 10X y un objetivo de inmersin de aceite de 100X, discernira objetos separados por qu distancia?

13) Qu tcnicas permiten colorear Rickettsias y Clamidias?

RICKETTSIAS: Gram (son negativas), Giemsa, Macchiavello, Castaeda CLAMIDIAS: Giemsa, Macchiavello, Castaeda

14) Para visualizar Micoplasmas, utilizo....

MICOPLASMAS: Gram (son negativas), Giemsa, Romanowsky

15) Qu coloraciones se utilizan para observar mohos y levaduras? Por qu las tcnicas de observacin de hongos no deben fijarse?
Coloraciones para mohos y levaduras:

Azul de lactofenol Azul de algodn Azul de metileno alcalino

No deben fijarse porque las clulas fngicas tienen un gran volumen, y con la fijacin la forma se distorsionara.

16) Con qu tcnicas de microscopa electrnica visualiza los virus? Qu caractersticas se aprecia en cada una de ellas?

PREPARACION Y OBSERVACION DE CELULAS SANGUINEAS

Enviado por martin26, mayo 2013 | 10 Pginas (2301 Palabras) | 27 Visitas |

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PREPARACION Y OBSERVACION DE CELULAS SANGUINEAS Martin Berrocal prof. MELISA NUEZ

Universidad de Crdoba. Facultad de ciencias bsicas. Programa de Biologa. Grupo de Biologa Celular 01. Montera Colombia.

RESUMEN Objetivo: Observar e identificar en una muestra de sangre los tipos de clulas que lo conforman y las principales organelas. Materiales y mtodos: mediante una muestra sangunea y empleando la tcnica de May Grwald Giemsa en la cual se hizo un frotis secndose al aire, se empleo alcohol metlico y se dejo 5 min, se cubri con azul de metileno y se dejo durante 10min y sin lavar se verti Giemsa y se dejo por 10 min y se observo, y en la tcnica de Wright el frotis se seco al aire, se le agrego 10 gotas de agua destilada y se agito por 30 seg, se cubri con Wright se lavo con agua y se observo. Resultados: Se logro observar en el tejido sanguneo las clulas que lo conforman y organelas como neutrofilos, linfocitos y monocitos. Conclusin: la tcnica de May Grwald Giemsa y la tcnica de Wright son eficientes para la observacin de las clulas que componen el tejido sanguneo. PALABRAS CLAVES Eritrocitos, leucocitos, plasma, colorantes, tejido sanguneo.

INTRODUCCION

La sangre es un lquido viscoso que circula por todo el cuerpo humano a travs de vasos cerrados y contiene como pigmento respiratorio la hemoglobina. La sangre est formada por: El plasma, es lquido y est formado en el 90 por ciento de agua y en el 10 por ciento de otras sustancias como azcares, protenas, grasas y sales minerales; y por Clulas que flotan en el plasma, comnmente llamados elementos figurados de la sangre: Glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas ( 1 ). Los Glbulos rojos Conocidos tambin como eritrocitos o hemates. Son el componente ms abundante de la sangre, y actan transportando el oxgeno. Como su nombre lo indica, son clulas de color rojo por su contenido de hemoglobina. Se fabrican en la mdula roja de algunos huesos largos, y la disminucin en el nmero normal de glbulos rojos produce anemia. Glbulos blancos o leucocitos Son clulas que no tienen color, tienen un tamao mayor que los glbulos rojos. Cumplen la funcin de defender al cuerpo de los microorganismos infecciosos ya que tienen ciertas caractersticas que hacen posible esta accin (2). Los glbulos blancos poseen la capacidad de responder frente a los rganos daados; cuando captan la fuente infecciosa, pueden atravesar las paredes de los vasos sanguneos y dirigirse al sitio de la infeccin. Esto lo hace deformando su "cuerpo" y desplazndose, y al llegar a la infeccin envuelven al agente patgeno (o lo comen) y de esta manera lo destruyen. Se fabrican en la mdula sea (3). Los glbulos blancos de la sangre son de dos tipos principales: los granulosos, con ncleo multilobulado, y los no granulosos, que tienen un ncleo redondeado. Los granulocitos incluyen: Neutrfilos, que fagocitan y destruyen bacterias; Eosinfilos, que aumentan su nmero y se activan en presencia de ciertas infecciones y alergias, y Basfilos, que segregan sustancias como la heparina, de propiedades anticoagulantes, y la histamina que estimula el proceso de la inflamacin. Los linfocitos desempean un papel importante en la produccin de anticuerpos y en la inmunidad celular. En algunos aspectos, los linfocitos son las clulas ms importantes del sistema inmunolgico. Los monocitos constituyen un pequeo porcentaje de la totalidad de las clulas sanguneas; cuando se encuentran localizados en los tejidos, fuera de la circulacin sangunea, experimentan cambios fsicos y morfolgicos, y reciben el nombre de macrfagos. (4)

MARCO TEORICO La sangre es un tejido lquido que recorre el organismo, a travs de los vasos sanguneos, transportando clulas, todos los elementos necesarios para realizar

sus funciones vitales (respirar, formar sustancias, defenderse de agresiones). La cantidad de sangre de una persona est en relacin con su edad, su peso, sexo y altura. Una persona adulta tiene entre 4,5 y 6 litros de sangre, el 7% de su peso corporal. La sangre transporta los nutrientes desde el aparato digestivo hasta las clulas, de donde se recogen tambin las sustancias de desecho para eliminarlas a travs de los riones, hgado y otros rganos de excrecin. Tambin es la encargada de regular el transporte del oxgeno y la eliminacin del anhdrido carbnico. Tiene un papel importante en funciones como la coagulacin, la inmunidad y control de la temperatura corporal. MATERIALES Y METODOS Tipo de estudio. Se realizo una prctica de laboratorio de tipo descriptiva, el da 9 de abril entre las 6 am y las 8 am. Sitio de estudio. El rea de estudio estuvo ubicada dentro del laboratorio de biloga general de la universidad de crdoba. Mtodos aplicados. se emplearon segn la manipulacin de la muestra a observar y con la orientacin del profesor diferentes tcnicas para observar las clulas sanguneas, procedimientos tales como la tcnica de May-Gruwald y la tcnica de Wright, en las cuales se utilizaron reactivos como colorante de Wright, colorante de Giemsa, alcohol metlico y objetos como la lanceta estril que se uso para realizar la extraccin de la sangre en la cual se prepararon en los respectivos portaobjetos y a su vez montados en los microscopio para ser observados.

PROCEDIMIENTOS 1.) Tecnica de May-Gruwald. 1.1) Realizamos un frotis sanguneo, depositando una gota de sangre en un extremo del portaobjetos y con ayuda de un cubre objeto hicimos el extendido de la muestra deslizando suavemente el cubre objeto hacia el otro extremo.

1.2) Se hizo la fijacin de la muestra de la siguiente manera: tomamos la laminilla y la cubrimos con alcohol metlico durante 10 minutos aproximadamente. 1.3) Se le agrega el azul de metileno a la muestra, dejamos secar durante 5 minutos. 1.4) Sin lavar, agregamos el colorante Giemsa y dejamos secar 10 min aprox. 1.5) Lavamos la laminilla con agua destilada inclinando la placa hasta eliminar el exceso de colorante. 1.6) Observamos en el microscopio.

2.) Tcnica de Wright. 2.1) Realizamos el frotis sanguneo, dejamos secar al aire libre, agregamos 10 gotas de agua destilada y agitamos suavemente durante minuto y medio. 2.2) Cubrimos la preparacin con colorante de Wright y dejamos actuar por 5 minutos. 2.3) Lavamos con agua destilada hasta que desaparezca la coloracin, dejamos secar al aire libre y observamos al microscopio.

RESULTADOS Y ANALISIS DE DATOS. Para la tcnica de May-Gruwald Giemsa: Se realizo un conteo de leucocitos tomados en 3 diferentes sitios de la muestra dando los resultados de la siguiente manera: Toma 1: se identificaron 6 linfocitos, 5 neutrofilos, 4 monocitos. Toma 2: se identificaron 5 linfocitos, 3 neutrofilos, 2 monocitos. Toma 3: se identificaron 6 linfocitos, 4 neutrofilos, 3 monocitos. Para un conteo general de la muestra en total 17 linfocitos, 12 neutrofilos, 9 monocitos, concluyendo una predominancia de linfocitos en la muestra. No se registraron ningn basofilo, ni eosinofilos ESQUEMA CORRESPONDIENTE.

Para la tcnica de wrigth: De igual manera para esta tcnica tambin se tomaron 3 sitios especficos de la muestra para realizar el conteo de leucocitos. Dando los resultados as: Toma 1: identificndose 3 neutrofilos, 2 linfocitos. Toma 2: identificndose 3 linfocitos, 2 neutrofilos. Toma 3: identificndose 2 neutrofilos, 2 linfocitos. Para un total de 7 neutrofilos y 7 linfocitos, dndose un reparto equitativo de clulas en la muestra. No se registraron basofilos, monocitos, ni eosinofilos. ESQUEMA CORRESPONDIENTE

PREGUNTAS COMPLEMENTARIA.

1.) Describa el fundamento de cada una de las tcnicas empleadas en este laboratorio. R/ Fundamento de la tcnica de Giemsa Se basa en el agregado de la solucin de May Grwald formada por eosinato de azul de metileno en alcohol metlico, la que fija el extendido y tiene afinidad por los citoplasmas. Luego se agrega el colorante Giemsa diluido (en el momento de realizarse la coloracin), Est constituido por Azures que son derivados por oxidacin del azul de metileno. Tiene afinidad por los ncleos y ciertas granulaciones. La eosina es un colorante cido por lo tanto tie los componentes acidfilos de las clulas. El azul de metileno es un colorante bsico por lo tanto se une a las fracciones basfilas. Es importante respetar las condiciones de la coloracin ya que variaciones de pH pueden alterarla. En esta coloracin se trabaja a pH neutro o ligeramente alcalino. Si se trabaja a pH cido, habr mayor cantidad de sustancias cargadas positivamente y se absorber mayor cantidad de eosina. Los extendidos adquieren una tonalidad rojiza. Si el pH es muy bsico, habr mayor fijacin de azul de metileno y se exagerarn los colores azules. Fundamento de la tcnica de Wright El colorante utilizado es una solucin de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B del (10 al 25%) junto con otros componentes del alcohol metlico. Dada la presencia de metanol en la composicin del colorante, no es necesario un paso previo de fijacin antes de la coloracin. Solo si se van a guardar las extensiones sin teir de un da para otro procederemos a su fijacin para evitar el deterioro del frotis. 2.) Escriba el color de los ncleos de los leucocitos con cada una de las tcnicas empleadas. R/. Para las dos tcnicas empleadas, los ncleos se tieron de un azul oscuro.

3.) Explique Qu tipo de tcnica de coloracin emple? R/ En la prctica de laboratorio empleamos las tcnicas de tincin simple y tincin diferencial por ejemplo en la tcnica de Wright utilizamos solamente el colorante de Wright mientras que en la coloracin de May-Grwald Giemsa se empleo eosinato de azul de metileno y luego se le aplico el colorante de Giemsa. 4.) Cul es la razn por la cual durante una infeccin se incrementa el nmero de leucocitos en la sangre? R/ Para poder responder esta pregunta tenemos que tener en cuenta que los

leucocitos forman parte de los sistemas de defensa celular e inmunolgico de los vertebrados esto quiere decir que el sistema inmunitario de nuestro cuerpo produce anticuerpos cuando detecta elementos dainos, llamados antgenos. Un antgeno es una sustancia ajena al cuerpo que el sistema inmunolgico reconoce como una amenaza. Algunos ejemplos de antgenos son las toxinas de las bacterias y los virus, as como los agentes qumicos externos perjudiciales para la salud. Cuando el cuerpo detecta antgenos se induce una respuesta inmunitaria con la formacin de anticuerpos, como forma de defensa. Los anticuerpos, tambin denominados inmunoglobulinas, son usados por el sistema inmunolgico para identificar y neutralizar estas sustancias extraas al cuerpo. Los anticuerpos los sintetizan un tipo de leucocito llamado linfocito B. 5.) Qu tipo de clulas sanguneas estn ms implicadas en la inmunidad de los organismos? R/Neutrfilos, que fagocitan y destruyen bacterias; Eosinfilos, que aumentan su nmero y se activan en presencia de ciertas infecciones y alergias. Basfilos, que segregan sustancias como la heparina, de propiedades anticoagulantes, y la histamina que estimula el proceso de la inflamacin.

6.) Cules clulas de la sangre son las primeras en atacar las bacterias en una infeccin? R/ Los leucocitos ya que tienen funciones bactericidas, fagocitan a las bacterias y luego las degradan con sustancias enzimticas lipolticas y proteolticas en este caso hablamos de los neutrofilos 7.) Por qu los eritrocitos no poseen ncleo? Cul es el contenido del eritrocito que se combina fcilmente con el O2 y CO2? R/ Porque no lo requieren, la funcin de un glbulo rojo, no es reproducirse, sino ser parte de un sistema de transporte, por consiguiente, son las clulas que mas deben estar sujetas, a el cuerpo, ayudando a las clulas, a reproducirse y alimentarse, si tuvieran ncleo, la individuacin que tiende la naturaleza provocara su duplicacin, consumiendo oxigeno, y alimento, impidiendo la funcin para la que fueron creadas. -Cul es el contenido del eritrocito que se combina fcilmente con el oxigeno y dixido de carbono? La hemoglobina Esta molcula est formada por cuatro subunidades idnticas, cada una de las cuales consta de una protena, la globina, unida a un grupo hemo. Este ltimo tie de rojo la sangre y est formado por cuatro ncleos que se unen adoptando la forma de un trbol de cuatro hojas. En el centro se halla anexionada una molcula

de hierro, que es la encargada de unirse al oxgeno. Efectivamente, mediante la oxidacin y desoxidacin del hierro, cada molcula de hemoglobina capta cuatro molculas de oxgeno de los alvolos pulmonares. Con esta preciada carga el eritrocito viaja, pasando por la parte izquierda del corazn, hasta las clulas de todo el cuerpo, donde el oxgeno debe ser liberado. El dixido de carbono, por el contrario, no se une con la hemoglobina sino que se disuelve directamente en el plasma con gran facilidad. En cambio, el monxido de carbono, el gas que sale por los tubos de escape de los coches, s se une con la hemoglobina, y con ms facilidad que el oxgeno. As, cuando en el aire que respiramos hay oxgeno y monxido de carbono, esta ltima gana la competicin por unirse con la hemoglobina y la persona que lo absorbe puede morir.

8.) Por qu cree usted que el hombre tiene un mayor nmero de eritrocitos por mm3 de sangre que la mujer? Explique. R/ El rango general es como sigue: Hombre: de 4.7 a 6.1 millones de clulas por microlitro (clulas/mcL) Mujer: de 4.2 a 5.4 millones de clulas/mcL En las mujeres se presenta el fenmeno mensual de la menstruacin la cual disminuye notablemente el nmero de eritrocitos. 9.) Para qu otro tipo de clulas se pueden emplear las tcnicas anteriormente sealadas? R/ La tincin de Wright es un tipo de tincin usada en histologa para facilitar la diferenciacin de los tipos de clulas de la sangre. Se usa principalmente para teir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogentica se usa para teir cromosomas, para facilitar el diagnstico de sndromes y enfermedades. La tincin de giemsa tambin es utilizada para observar bacterias y parsitos.

CONCLUSION. Al finalizar la prctica se pudo analizar el tejido sanguneo con sus respectivas clulas que lo constituyen y sus principales estructuras, conocer y aplicar adecuadamente los distintos reactivos como los colorantes aplicados en esta prctica.

BIBLIORAFIA. 1. J.B. MIALE, Hematologa Medicina de Laboratorio, sexta edicin, editorial revelte. 2. HERNAN VELEZ, WILLIAM ROJAS, JAIME BORRERO, JORGE RESTRPO, Fundamentos de medicina, Hematologa, corporacin para las investigaciones biolgicas, sexta edicin, 2004

3. WELSCH, Histologa, segunda edicin, editorial panamericana. 4. http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/sangre.htm

PRCTICA N 2: OBSERVACIN DE LAS CLULAS DE LA SANGRE Y DE LAS DIFERENTES ETAPAS DE LA MITOSIS

1.- ESTUDIO DE LAS CLULAS DE LA SANGRE Material Microscopio Portaobjetos Sangre Dip Quik Fixative, Dip Quik Stain Solutio, Dip Quik Stain Counter Papel Mtodo Depositar una gota de sangre en el borde de un portaobjetos limpio. Seguidamente, con un porta de borde esmerilado, se hace un frotis o extensin de la sangre. El porta con el que se hace la extensin debe deslizarse bien colocado y lo ms perfectamente aplicado en su borde contra el otro porta sobre el que se efecta la extensin, solo debe pasarse una vez de forma continua e ininterrumpida. Estas extensiones o frotis deben secarse al aire lo ms rpidamente posible. La desecacin se facilita con movimientos en forma de abanico, nunca soplando o por el calor. La rpida desecacin evita la deformacin de los glbulos. Tincin: Introducir dicha preparacin en Dip Quik Fixative durante 20 segundos. Tras este tiempo, se saca, se escurre ligeramente sobre el papel y se introduce en Dip Quik Stain Solution durante 20 segundos al cabo de los cuales se vuelve a escurrir suavemente sobre el papel y se mete finalmente en Dip Quik Stain Counter durante 20 segundos. Posteriormente, se lava, se seca la base del porta y se observa al microscopio.

Observacin A pocos aumentos explorar la preparacin para localizar la zona en la que el frotis es ms perfecto. Consideramos como ms apta, aquella en la que los glbulos estn en una sola capa, bien teidos y no se han producido precipitados de colorantes. Si los glbulos presentan formas irregulares, bordes dentados, aspecto erizado, etc., ser indicio de que el secado del frotis fresco no fue todo lo rpido que se requiere. Localizada la zona adecuada se cambia a mayor aumento. En la extensin predominan los glbulos rojos, hemates o eritrocitos, teidos de color rojo. Son ms delgados por el centro que por los bordes. Los de mamferos no pposeen ncleo pero los del resto de los animales si lo tienen. Los glbulos blancos o leucocitos se identifican fcilmente por la presencia del ncleo. Hay dos clases de leucocitos. A) Granulocitos o Polimorfonucleares: con ncleo fragmentado o arrosariado y granulaciones en el citoplasma. Se dividen en: - Neutrfilos : con granulaciones de color salmn. Con ncleo multilobulado. - Eosinfilos : con granulaciones abundantes teidas en rojo. Con ncleo bilobulado. - Basfilos: con granulaciones violetas que eclipsan al ncleo bilobulado. B) Agranulocitos: sin granulaciones en el ciptoplasma. Se dividen en: - Linfocitos : con un solo ncleo que ocupa casi toda la clula de manera que solo se observa un pequeo anillo de citoplasma. - Monocitos : son los de mayor tamao y poco frecuentes, ncleo bilobulado y excntrico, son los ms mviles y su funcin principal es la fagocitosis.

Las plaquetas son fragmentos de clulas que participan en la coagulacin. Todo este conjunto de clulas constituye el tejido sanguneo

2.-ESTUDIO DE LAS DIFERENTES PREPARACIN DE MERISTEMO. Material

ETAPAS

DE

LA

MITOSIS

EN

Microscopio
Portaobjetos y cubreobjetos Agujas enmangadas

Pinzas Cuchilla
pices radicales de cebolla

Papel de filtro

Orcena actica Mtodo Se introduce con unas pinzas un fragmento de unos 3 4 cm del pice de raz de cebolla en un tubo "Eppendorf" con cido clorhdrico 1 N durante tres o cuatro minutos. Se saca y se coloca sobre un porta limpio. Se corta con una cuchilla un trozo de unos 2 3 mm. Este trozo se trata de colocar hacia la mitad del porta. Con otro se presiona el pice de la raz fuertemente. De esta forma las clulas se aplastan y los cromosomas aparecern separados. Se separan los dos portas con cuidado, nos quedar parte de la raz en uno y parte en otro; con los los portas se puede hacer lo que se indica a continuacin. Se deja secar al aire, se le aade una gota de orcena actica y se deja actuar durante unos cinco minutos. Con un trozo de papel de filtro presionando suavemente se absorbe la orcena. Se coloca un cubre encima y con el pulgar se presiona ligeramente la muestra. Observacin Con el objetivo de mayor aumento escoger una regin poco coloreada en la que los cromosomas destacan en rosa-malva sobre un fondo incoloro. Se distinguen fcilmente ncleos en interfase, as como en diversas fases de mitosis. En el ncleo en reposo la cromatina aparece repartida en una fina red roja, mientras que los nucleolos son incoloros. Los ncleos al principio de la profase, parecen contener una red ms grosera que los ncleos en interfase y solamente al final de la profase tiene lugar la aparicin clara de los cromosomas. La metafase y anafase se ven con claridad. La escisin de los cromosomas se puede observar a menudo en la metafase, pero los centrmeros no se distinguen nunca. Los ncleos de telofase se distinguen de los de la profase porque estn dispuestos por parejas.

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