ISSN 1516-8840 Dezembro, 2010

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa Clima Temperado Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Documentos 307

cido Abscsico e o Estresse Abitico

Ariano Martins de Magalhes Jnior

Embrapa Clima Temperado Pelotas, RS 2010

Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na: Embrapa Clima Temperado Endereo: BR 392 Km 78 Caixa Postal 403, CEP 96010-971- Pelotas, RS Fone: (53) 3275-8199 Fax: (53) 3275-8219 - 3275-8221 Home page: www.cpact.embrapa.br E-mail: sac@cpact.embrapa.br Comit de Publicaes da Unidade Presidente: Ariano Martins de Magalhes Jnior Secretria- Executiva: Joseane Mary Lopes Garcia Membros: Mrcia Vizzotto, Ana Paula Schneid Afonso, Giovani Theisen, Luis Antnio Suita de Castro, Flvio Luiz Carpena Carvalho, Christiane Rodrigues Congro Bertoldi e Regina das Graas Vasconcelos dos Santos Suplentes: Beatriz Marti Emygdio e Isabel Helena Vernetti Azambuja Superviso editorial: Antnio Luiz Oliveira Heberl Reviso de texto: Brbara Chevallier Cosenza Normalizao bibliogrfica: Fbio Lima Cordeiro Editorao eletrnica e Arte da capa: Srgio Ilmar Vergara dos Santos Foto da capa: Ariano Martins de Magalhes Jnior 1a edio 1a impresso (2010): 50 exemplares Todos os direitos reservados A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei no 9.610). Dados Iinternacionais de Catalogao na Publicao (CIP) Embrapa Clima Temperado cido abscsico e o estresse abitico / editor tcnico, Ariano Martins de Magalhes Jnior; autores, Antonio Costa de Oliveira .., [et al.] Pelotas: Embrapa Clima Temperado, 2010. 30 p. (Embrapa Clima Temperado. Documentos, 307). ISSN 1516-8840 1. Acido abscsico. 2. Estresse abitico. I. Magalhes Jnior, Ariano Martins de, Ed. II.Oliveira, Antonio Costa. III. Srie. CDD 581.1

Embrapa 2010

Autor

Antonio Costa de Oliveira Eng. Agrn., Dr., professor do Depto de Fitotecnia, FAEM - UFPel, Pelotas, RS, acosta@ufpel.tche.br Ariano Martins de Magalhes Jnior Eng. Agrn., Dr. , pesquisador da Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS, ariano.martins@cpact.embrapa.br Carla Ferreira Silveira Bacharel em Qumica, Mestranda em Biotecnologia do Centro de Desenvolvimento Tecnolgico UFPel, Pelotas, RS, csilveira_iqg@ufpel.tche.br Eugenia Jacira Bolacel Braga Biloga, Dra., professora do Depto de Botnica, Instituto de Biologia UFPel, Pelotas, RS, eugenia@ufpel.edu.br

Gabriela de Magalhes da Fonseca Eng. Agrn., Doutoranda em Agronomia do Depto de Fitotecnia, FAEM UFPel, Pelotas, RS, gabrieladafonseca@hotmail.com Letcia Carvalho Benitez Biloga, M.sc., Doutoranda em Fisiologia Vegetal, do Depto de Botnica, Instituto de Biologia UFPel, Pelotas, RS, lecbenitez@gmail.com Luciano Carlos da Maia Eng. Agrn., Dr. Professor do Depto de Fitotecnia, FAEM UFPel, Pelotas, RS, lmaia.faem@ufpel.edu.br Viviane Kpp da Luz Eng. Agrn., M.sc., Doutoranda em Agronomia, do Depto de Fitotecnia, FAEM UFPel, Pelotas, RS, vivikp05@hotmail.com

Apresentao

Um dos principais problemas na agricultura a presena de condies ambientais desfavorveis para a sobrevivncia e produtividade dos vegetais. Essas condies indesejadas, tais como a deficincia de gua, alta concentrao de sais no solo, temperaturas supra e infra-timas e ainda nveis elevados de radiao, podem causar efeitos que diminuem, significativamente, a produtividade de vrias espcies de importncia agrcola e caracterizando o chamado estresse abitico. O cido abscsico (ABA) o hormnio de maior importncia na relao estabelecida entre as plantas e as vrias classes de estresse. Sistemas de sinalizao constituem redes de comunicao entre rotas metablicas distintas que interagem atravs de elementos promotores e fatores de transcrio, ativando a expresso de genes e resultando em alteraes fisiolgicas para tolerncia ao estresse. Diferentes caminhos de transduo de sinais foram postulados para rotas que apresentam interao com ABA, caminhos independentes da presena de ABA e um caminho onde esto presentes genes responsivos s duas condies (crosstalk). Mudanas bioqumicas e fisiolgicas tm uma relao de causa-efeito com as caractersticas morfolgicas em plantas e, primordialmente, o funcionamento desses mecanismos tem base gentica e molecular. A

partir desse pressuposto, possvel prever que gentipos com tolerncia a determinado estresse apresentem diferenas qualitativas ou quantitativas em sua base gentica. Desta forma, compreender as bases bioqumicas, fisiologias e a integrao desses conhecimentos com a biotecnologia e genmica poder resultar na principal ferramenta para o avano no entendimento sobre a tolerncia das plantas frente a essas condies.

Waldyr Stumpf Junior Chefe-Geral Embrapa Clima Temperado

Sumrio

Introduo......................................................................

A evoluo sob condies de estresse............................. 10 Melhoramento gentico de plantas.................................. 10 cido abscsico............................................................. 11 Funes fisiolgicas do ABA........................................... 13 O ABA como hormnio do estresse................................. 15 Genes ABA-dependentes e ABA-independentes................. 15 Transduo de sinais ABA-dependente............................. 16 Fatores de transcrio ABA-dependentes.......................... 17 Transduo de sinais ABA-independente.......................... 20 Cross-talk..................................................................... 22 Mensageiros secundrios relacionados ao ABA e ao estresse abitico........................................................... 23 Expresso de produtos relacionados ao ABA e ao estresse abitico........................................................................ 25 Regulao de genes ABA............................................... 25 Consideraes Referncias Finais..................................................... 26 Bibliogrficas............................................... 27

cido Abscsico e o Estresse Abitico

Ariano Martins de Magalhes Jnior

1. Introduo
O arroz, um dos cereais mais cultivados no mundo, ocupa posio de destaque do ponto de vista econmico e social. Est presente principalmente em pases em desenvolvimento, servindo como alimento bsico. Alm de ser uma cultura extremamente verstil, pois se adapta a diferentes condies de solo e clima, considerada a espcie com maior potencial no aumento de produo para o combate fome no mundo (GOMES; MAGALHES JUNIOR, 2004). O programa de melhoramento gentico da Embrapa, em arroz irrigado (Oryza sativa L.), tem como objetivo principal o desenvolvimento de gentipos que proporcionem alto potencial de produtividade, entretanto busca, concomitantemente, caracteres como qualidade industrial, resistncia a pragas e molstias (estresses biticos) e tolerncia ao frio, salinidade, toxidez por alumnio ou cidos orgnicos (estresses abiticos), caractersticas fundamentais para o ganho gentico na espcie e resistncia a molstias. A produtividade expressa em funo da interao do gentipo da cultivar com o ambiente da regio onde cultivada. Estresses abiticos durante as fases crticas da planta predispem queda de rendimento, alm disso, so os principais responsveis por provocar mudanas morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e moleculares afetando adversamente o crescimento e desenvolvimento vegetal (WANG et al., 2001).

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A evoluo sob condies de estresse

Algumas teorias indicam que as primeiras estruturas de membranas fosfolipdicas tenham ocorrido h 1,5 bilhes de anos aps o surgimento do planeta, entretanto, estimativas indicam que o mais antigo ancestral dos vegetais demorou mais de trs bilhes de anos para surgir (LEHNINGER et al., 1995). Certamente, o grande espao evolutivo entre a primeira membrana e o primeiro ancestral das plantas devido ao tempo necessrio para a criao do aparato estrutural que constitua essas membranas celulares. Somente a partir do desenvolvimento dessas estruturas, da capacidade em receber e transferir sinais intra e extracelulares vinculados a fatores externos e da capacidade de reagir contra essas adversidades que se iniciou o processo de migrao das espcies do ambiente marinho para as regies litorneas. As grandes alteraes que a Terra sofreu, como alteraes de temperatura, presena ou ausncia de altas e baixas concentraes de sais, diferentes nveis de radiao e alteraes nas concentraes de gases na atmosfera, supostamente dirigiram a criao e seleo de genes relacionados a esses fatores de estresse. Considerar esses possveis fatos evolutivos pode ser um caminho para explicar a estreita relao existente entre os mecanismos atuais que as plantas utilizam frente a situaes extremas com a converso em rotas metablicas e sistemas de sinalizao de molculas em comum, como o cido abscsico, presente em grande quantidade em todas as classes de estresse abitico.

Melhoramento Gentico de plantas

Do ponto de vista prtico, a seleo de gentipos que apresentem mutaes ou recombinaes nos genes envolvidos na tolerncia a estresses abiticos de grande valia, pois se estas diferenas forem expressas em melhoria, possivelmente esses genes podem ser transferidos

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para cultivares comerciais, possibilitando a obteno de gentipos mais produtivos. Entretanto, em programas de melhoramento convencional, onde grandes quantidades de cruzamentos so realizados em busca de novas formas desses genes, a deteco dessas diferenas nas grandes populaes segregantes, oriundas desses cruzamentos, muitas vezes ineficiente, porque pode ocorrer um mascaramento dos dados fenotpicos pela no ocorrncia do fator estresse ou, ainda, por vrios outros fatores genticos que dificultam a identificao desses genes ou alelos. Atualmente, bastante rotineiro o uso de marcadores moleculares associados a caracteres de interesse em programas de melhoramento, sendo uma importante estratgia, uma vez que possibilita a identificao das formas alternativas de genes ou alelos, excluindo o efeito do ambiente e constituindo a chamada seleo assistida. Desta forma, identificar genes ou alelos alternativos em populaes de plantas, ou ainda buscar em bancos de dados genmicos informaes atualizadas sobre genes relacionados ao cido abscsico e estresse abitico, pode prover a incluso de novos marcadores moleculares a serem utilizados na seleo gentica assistida.

cido abscsico
O cido abscsico um fitormnio encontrado em todas as plantas vasculares, sendo tambm detectado em musgos. encontrado na maioria dos tecidos vegetais e sintetizado em todas as clulas que possuem cloroplastos (TAIZ; ZEIGER, 2004). um hormnio de extrema importncia, pois est relacionado com a regulao de vrios processos celulares, tais como a superao da dormncia de sementes, transio do estado embrionrio para o estado de dormncia e crescimento vegetativo, alm de exercer funes nas respostas a estresses abiticos e biticos. O cido abscsico (ABA) sintetizado pela via dos terpenos ou terpenoides (considerado maior grupo de produtos secundrios), derivado da rota do cido mevalnico, que gerado a partir de trs molculas de acetil-CoA ou em uma segunda rota denominada MEP (metileritritol fosfato). Uma

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explicao mais detalhada mostrada na Figura 1, onde a sntese dos carotenoides acontece a partir do 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato, o qual, atravs das enzimas piruvato e gliceraldedo-3-fosfatosintase, produz isopentenildifosfato (IPP). A molcula de IPP convertida em um produto de 20 carbonos, geranilgeranil pirofosfato (GGPP). O GGPP, mediado pela enzima fitoeno sintase (PSY), transformado em um carotenoide de 40 carbonos, subsequentemente, at formar fitoeno. Atravs da fitoeno desaturase (PDS) este convertido em caroteno, licopeno, -caroteno e ento a zeaxantina (SEO; KOSHIBA, 2002).

Figura 1. Rota de biossntese do ABA. Embrapa Clima Temperado, PelotasRS, 2010. Fonte: Seo e Koshiba, 2002.

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Funes fisiolgicas do ABA

No fechamento dos estmatos
Sob condies de estresse hdrico o fechamento dos estmatos o mecanismo primordial para evitar que as plantas fiquem desidratadas pela transpirao. Um modelo bastante difundido aponta o ABA como principal fator para o desencadeamento de uma srie de eventos que resultam no fechamento de estmatos e, consequentemente, na tolerncia ao estresse hdrico. Em condies de estresse hdrico, alguns tecidos apresentam um acrscimo, de at 50 vezes, na concentrao de ABA (TAIZ; ZEIGER, 2004). O processo de translocao do cido abscsico ainda no est bem elucidado, porque no se sabe quais partes das plantas so as maiores responsveis pela taxa de incremento nas concentraes de ABA nem como essas molculas so translocadas de forma to rpida.

Na formao das sementes

Durante o desenvolvimento das sementes existe um momento no qual o embrio paralisa a diviso celular e inicia o acmulo de reservas. Esta transio de fases correlata com um aumento na concentrao de ABA. Durante a maturao da semente ocorrem dois picos no acmulo de ABA. O primeiro est associado ao tecido embrionrio materno que ocorre aos 10 dias aps a polinizao, e o segundo, num perodo mais avanado, na fase de maturao, onde o aumento de ABA provido pela semente ocasionando a desidratao do tecido (FINKELSTEIN; ROCK, 2002). Na maturao da semente ocorre um acmulo abundante de protenas LEA (Late Embryogenesis Abundant proteins) e carboidratos. O acmulo de diferentes cadeias de carboidratos e a expresso de genes LEA so controlados pela ao de fatores regulados pela presena de cido abscsico. Em Arabidopsis thaliana foram identificados trs mutantes insensveis ABA, designados ABI1, ABI2 e ABI3. Quando ABI3 cruzado com ABI1 os resultados de deficincias sofrem elevao, sugerindo que nestes

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fentipos a mutao de ABI3 aumenta a exigncia de um limiar para ao de ABA. Nestas plantas foram observadas sementes de cor verde e uma srie de defeitos relacionados ao desenvolvimento de sementes, tais como: o acmulo de protenas LEA foi drasticamente reduzido, os embries permaneceram verdes ao longo do desenvolvimento, intolerantes a dessecao e sem dormncia. Esses resultados sugerem que o gene ABI3 essencial para a sntese de protenas de armazenamento, regulao da perda de gua e maturao da semente (NAMBARA et al., 1992). O sequenciamento dos genes ABI1 e ABI2 os indicou como codificantes para duas protenas fosfatases (serina e treosina) e do ABI3, como um fator de transcrio, sendo todos trs envolvidos na transduo de sinais. Alm de reduo na sntese das protenas LEA, os mutantes ABA insensveis tambm mostraram alteraes no contedo de carboidratos acumulados durante a formao das sementes, sendo que esta alterao na relao entre monossacardeos e polissacardeos pode alterar os mecanismos de perda de gua e, consequentemente, a dormncia das sementes (OOMS et al., 1993).

Na germinao das sementes

O segundo pico no acmulo de ABA (origem do prprio tecido da semente) responsvel pela dormncia, pois, com o acmulo das protenas LEA, ocorre perda de cerca de 80% da gua, reduzindo todos os processos metablicos, sendo este basicamente o mecanismo que induz as sementes ao estado de dormncia. A relao entre a concentrao ABA e o cido giberlico nas sementes o principal fator para a manuteno do estado de dormncia, pois o aumento na proporo de cido giberlico nas sementes responsvel por induzir os processos iniciais da germinao. A ocorrncia de diferentes mecanismos de germinao prematura, em vrias espcies, chamada de viviparidade. Foi observado em milho (Zea mays) que plantas mutantes, com deficincia na produo de ABA, apresentaram germinao precoce na espiga (vivparo). O gene Viviparous1 (VP1), identificado em milho (Zea mays), e o ABI3,

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identificado em Arabidopsis, foram sequenciados e caracterizados como fatores de transcrio homlogos, contendo multidomnios que funcionam como ativadores e repressores, implicando diretamente na sinalizao de ABA (SUZUKI et al., 2003).

O ABA como hormnio do estresse

O ABA est intimamente relacionado com a tolerncia a vrias condies de estresse (choque trmico, seca, salinidade e frio) e a alterao dos padres de expresso gnica durante o estresse. Muitos genes expressos durante diferentes condies de estresse abitico so dependentes da presena de ABA, alguns desses, porm, no respondem aplicao de ABA exgeno. A partir da manipulao de plantas mutantes, com diferentes repostas ao estresse e ao ABA exgeno, foram obtidos grandes avanos na elucidao das rotas metablicas e dos sistemas de sinalizao envolvidos no estresse abitico. Anlises genmicas e de transcritos indicam que h diferentes sistemas responsveis pelo controle da expresso gnica durante o estresse, sendo identificadas diferenas nas regies e/ou nas estruturas dos fatores de transcrio envolvidos na regulao destes genes. Muitos genes induzidos pelo estresse abitico so controlados pelo cido abscsico, contudo outros parecem ser regulados por outros fatores (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).

Genes ABA-dependentes e ABA-independentes

Vrios estudos, a partir de genes com expresso induzida pelo estresse hdrico e por frio, possibilitaram anlises em que comparaes entre as regies promotoras (promoter) desses genes evidenciaram a presena de diferentes elementos reguladores (descritos como cis-atuantes ou ciselementos). Os cis-elementos presentes na regio promotora dos genes so reconhecidos por protenas, chamadas fatores de transcrio, as quais interagem de forma especfica com esses elementos, criando a estrutura necessria para o incio da transcrio do gene.

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Foram identificados quatro sistemas independentes de regulao gnica, dois sistemas ABA-dependentes e dois sistemas ABA-independentes. Muitos desses genes so induzidos por diferentes estresses abiticos, sugerindo que existe um sistema de comunicao cruzada (cross-talk) entre estes caminhos (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).

Transduo de sinais ABA-dependente

Vrios genes ABA-dependentes tiveram suas regies promotoras comparadas entre si, sendo que, em alguns desses genes, foi encontrada uma regio conservada apresentando a sequncia PyACGTGGC. Esta sequncia apresenta homologia com dois genes sequenciados. O primeiro a ser descrito foi o gene Em, o qual foi identificado no trigo e expresso na fase final da maturao das sementes. O segundo gene, RAB16, foi identificado em arroz e expresso em tecidos vegetativos desidratados e nos estgios finais de maturao das sementes. Entretanto, somente aps ter sido identificado em Arabdopsis que recebeu o nome de ABRE (ABAResponsive Element) (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 1997). A sequncia em comum nesses genes descrita como um cis-elemento e est presente na regio promotora de vrios genes responsivos ao ABA. Esses elementos apresentam uma sequncia de 8 -10 pares de bases (pb) com um ncleo central ACGT, que forma a regio conhecida como G-box (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005). A presena apenas do elemento ABRE no promotor no suficiente para ativao da transcrio do gene, sendo necessria a presena de uma segunda estrutura. Em trigo, a presena de elementos CE1 e CE3 tornam os genes HVA1 e HVA2 responsivos ao ABA. Em Arabdopsis, duas sequncias ABRE so necessrias para a expresso do gene RD29B em sementes e tecido vegetativo (UNO et al., 2000). O segundo grupo de ciselementos ABA-dependentes foi nomeado CE (Coupling Element). Dois desses elementos foram identificados e, apesar de receberem o mesmo nome, no apresentam similaridades entre suas sequncias. O primeiro elemento descrito foi o CE1 (TGCCACCGG), distante a -44 pb no promotor do gene HVA22 em cevada (Hordeum vulgare). Em anlises

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posteriores, a partir do gene HVA1, foi identificado o segundo elemento, nomeado CE3 (ACGCGTGTC) (SHEN; HO, 1995; HOBO et al., 1999). Aparentemente, uma dessas sequncias pode funcionar como elemento de juno, pois a maioria dos elementos de juno conhecidos semelhante a ABRE e contm um motivo de A/GCGT. Uma cpia adicional de ABRE, ou outro elemento de juno, necessria para expresso de genes ABAdependentes (Figura 2).

Figura 2. Regio promotora em trigo, interao de elementos ABRE e CE3. Embrapa Clima Temperado, Pelotas-RS, 2010. Fonte: Hobo et al., 1999.

Fatores de transcrio ABA-dependente

Protenas que se ligam nas regies cis-elemento, no promotor de um gene, so chamadas de fatores de transcrio. Um grupo desses fatores denominado zper de leucina (bZIP-Leucine zipper motif) e foi caracterizado primeiramente em animais. Em trigo, o gene EmBP1 foi a primeira sequncia caracterizada com domnio bZIP e que se liga a elementos do tipo ABRE.

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A partir de cDNAs isolados em Arabdopsis, foram caracterizadas trs protenas que se ligam a elementos ABRE. Estas protenas foram denominadas AREB1, AREB2 e AREB3 (ABA-Responsive Element Binding Protein) e apresentam homologia com as protenas contendo domnio bZIP (UNO et al., 2000). Estudos de expresso gnica confirmaram que AREB1 e AREB2 so expressos durante estresse hdrico, tratamento com sal e tratamento com ABA exgeno. Entretanto, para AREB3 no foram obtidos dados conclusivos. Apesar de as protenas AREB, ou ainda ABF (ABRE-Binding Factors), serem consideradas como principais fatores de transcrio nas rotas de transduo de sinais ABA-dependente, outros fatores, conhecidos como MYB e MYC, tambm fazem parte desta classificao, entretanto estes apresentam interao com outros cis-elementos na regio promotora dos genes. Um gene denominado rd22 (dehydration-responsive), isolado de Arabdopsis, responsivo desidratao e induzido pela aplicao de ABA exgeno (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI,1994). Porm, no foi encontrado, em sua regio promotora, sequncias de elementos AREB, encontradas nos genes responsivos ao ABA, sugerindo a existncia de outros reguladores diferentes do AREB e bZIP. Em estudo da regio promotora desse gene foi encontrado na posio -67pb stios de reconhecimento dos fatores de transcrio MYC e MYB (ABE et al., 2003). MYC (Myelocytomatosis Oncogene) e MYB (Myeloblastosis Oncogene) so protenas com estruturas hlice-volta-hlice (helix-turn-helix) encontradas em animais e transcritas durante a proliferao celular. Em plantas, vrias protenas MYB esto associadas regulao de diversos processos, tais como metabolismo secundrio, respostas a hormnios e regulao de morfognese celular (BUCK; ATCHLEY, 2003). Em bibliotecas de cDNA, obtidas a partir de Arabdopsis induzidas ao estresse por desidratao, foram identificados fatores de transcrio cujas sequncias apresentaram

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homologia ao grupo de protenas MYB e MYC. A resposta desse grupo de fatores de transcrio ao ABA est bem esclarecida, entretanto existem dvidas quanto expresso dessas protenas por elas tambm estarem associadas expresso do cido jasmnico (URAO et al., 1993). Na Figura 3 so mostrados trs cis-elementos na rota de sinalizao ABAdependente: ABRE, CE1 e CE2, reconhecidos por fatores de transcrio AREB, alm dos elementos MYBR (MYB recognition sequence) e MYCR (MYC recognition sequence) reconhecidos por fatores MYB e MYC.

Figura 3. Rede regulatria de fatores de transcrio e cis-elementos envolvidos na resposta ao estresse osmtico e por frio. Embrapa Clima Temperado, Pelotas-RS, 2010. Fonte: Yamaguchi-Shinozaki e Shinozaki, 2006.

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Transduo de sinais ABA-independente

Estresse ao Frio - ABA-independente
Genes expressos sob condies de estresse, contendo em suas regies promotoras sequncias de cis-elementos conservadas, denominadas DRE, CRT e LTRE, so considerados os principais genes do sistema de transduo ABA-independente (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005). Alguns genes, como RD29A, COR78 e LTI78, so induzidos pelo dficit de gua, pelo frio e por ABA. Esses genes tambm so induzidos em plantas mutantes ABA-deficientes ou ABA-insensveis por falta de gua e frio. Anlises da regio promotora desses genes em plantas transgnicas, atravs de vrias alteraes em suas sequncias, como deleo e insero de bases, mostraram que uma sequncia conservada, de 9 pb, DREDrought Responsive, responsvel pela regulao do gene RD29A nas condies de ABA-independente para desidratao e frio (YAMAGUCHISHINOZAKI; SHINOZAKI, 1994). Um cis-elemento semelhante ao elemento DRE foi encontrado em genes expressos durante estresse por frio em Arabdopsis. Esse elemento apresentou homologia de cinco nucleotdeos em relao ao elemento DRE, sendo nomeado DRE/CRT (Dehydration-Responsive Element/C-repeat) (SAKUMA et al., 2006). Em bibliotecas de cDNA de Arabidopsis sob estresse, foram identificadas trs sequncias que codificam fatores de transcrio descritos como CBF1 (C-Repeat Binding Factor), DREB1A e DREB2A (Dehydratation Responsive Element Binding Factor), os quais se ligam aos cis-elementos DRE/CRT (LEE et al., 2005). Um fator de transcrio denominado ICE1 (Induced of CBF expression 1) foi caracterizado em Arabidopsis. A cascata de sinalizao do ICE1 est um nvel acima (upstream) do fator CBF3, sendo o responsvel por ativar sua expresso durante tratamento ao frio. Mutantes ice1 bloqueiam a

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sinalizao do CBF3, entretanto no bloqueiam os homlogos CBF1 ou CBF2 (LEE et al., 2005). Aps a regulao de CBF/DREB1, o qual sinaliza para DRE/CRT, ocorre regulao na expresso de AP2/ERF (fatores de transcrio Zinc-Finger), os quais regulam a expresso em um nvel abaixo na cascata de sinais. Embora as etapas de sinalizao que acionam o ICE1 acima do grupo dos fatores CBF ainda no estejam esclarecidas, muitos estudos esto sendo realizados devido ao grande efeito que ele promove na sinalizao.

Estresse hdrico - ABA- independente

O grupo de genes expressos durante estresse hdrico, no responsivo ao frio e tratamento com ABA exgeno, evidencia a existncia de uma segunda via de transduo ABA-independente. Esse grupo inclui o gene ERD1 (Early Responsive Dehydration 1), homlogo a uma subunidade proteoltica de uma protena CLP (Caseinolytic Protease) (SIMPSON et al, 2003). O gene ERD1, alm de ser induzido atravs de desidratao, tambm sofre sub-regulao durante a senescncia natural e/ou na senescncia induzida pela falta de luz (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005). A anlise da regio promotora do ERD1 revelou a presena de quatro cis-elementos, sugerindo que dois elementos podem ser responsveis pela expresso dos genes durante desidratao, e os outros dois elementos, durante a senescncia natural ou senescncia induzida pela falta de luz.

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Figura 4. Modelo hipottico para induo do gene ERD1 durante estresse por desidratao ou durante a senescncia. Embrapa Clima Temperado, Pelotas-RS, 2010. Fonte: Simpson et al., 2003. Foram isoladas sequncias de cDNAs: ANAC019, ANAC055 e ANAC072, homlogas a fatores de transcrio MYC-like. Anlises em plantas transgnicas revelaram que ANAC019, ANAC055 e ANAC072 sofrem aumento da expresso durante estresse hdrico, e que as plantas aumentam significativamente sua tolerncia seca, porm a expresso do gene ERD1 no sofre alterao. Em estudos posteriores foram isolados cDNAs que codificam protenas ZFHD (Zinc-Finger Homeodomain) e NAC NAM/ATAF1/2/CUC). A sobre-expresso dessas protenas aumentou a expresso de ERD1, indicando que esses cis-elementos so necessrios para expresso do gene ERD1.

Cross-Talk
A interao entre genes com diferentes elementos reguladores nos promotores, expressos durante as diferentes classes de estresse, responsivos ao ABA, aos demais fitormnios e durante a presena de espcies reativas de oxignio (ROS) , denomina-se cross-talk (conversa cruzada), pois vrios desses genes so regulados por diferentes rotas de transduo de sinais, sinalizados em resposta tenso das diferentes classes de estresse. O termo cross-talk usado para descrever situaes em que a sinalizao de diferentes redes gnicas e rotas metablicas compartilha um ou mais componentes intermedirios, ou quando h

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produo em comum (CHINNUSAMY et al., 2003). Foram observadas interaes no promotor do gene RD29A, no qual foram encontrados elementos DRE e ABRE. Outro exemplo de cross-talk foi observado durante estresse hdrico, na rota de expresso do gene RD22, o qual controlado por fatores de transcrio com domnio MYB, induzido por ABA, porm tambm envolvidos em resposta ao cido jasmnico (YAMAGUCHI- SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).

Mensageiros secundrios relacionados ao ABA e ao estresse abitico

Clcio (Ca++)
Alm das rotas, j elucidadas, da ao do Ca++ no fechamento de estmatos, o clcio considerado o ponto de partida na sinalizao em cascata e cross-talk em todas as classes de estresse abitico, pois a ao do ABA est vinculada s alteraes na concentrao de clcio no citosol das clulas. Considerado mensageiro secundrio, estudos sobre o clcio mostram que a fluidez da membrana e a reorganizao do citoesqueleto so alteradas em conjunto com a oscilao de Ca++ no citosol de alfafa durante estresse por frio.

Inositol 1,4,5-Trifosfato (IP3)

A expresso de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), mensageiro responsvel pela sinalizao da abertura dos canais de clcio durante estresse osmtico, alterada com a presena de ABA (TAIZ; ZEIGER, 2004). A funo do IP3 foi primeiramente descrita como modelo de sinalizao, baseado em clulas animais. Entretanto, em estudos com Arabdopsis, o gene FRY1, que codifica para inositol polifosfato 1-fosfatase (altera o acmulo de IP3), gerou oscilaes na concentrao de Ca++ citoslico em funo da aplicao de ABA, e de estresses por salinidade e por frio (CHINNUSAMY et al., 2003).

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Salt-Overly-Sensitive (SOS)
Durante a sinalizao sob estresse salino em Arabdopsis, foram identificadas sequncias de genes SOS1, SOS2 e SOS3 responsivas ao estresse inico, descritas como Salt-Overly-Sensitive (SOS). Essas sequncias apresentaram homologia com protenas que contm stio cataltico serina/treonina e esto envolvidas na homeostase da clula durante estresse osmtico e por frio (CHINNUSAMY et al, 2003).

Calcium-dependent protein kinases (CDPK)

Protenas kinases dependentes de clcio (CDPK - Calcium-Dependent Protein Kinases) compem uma grande famlia de protenas, presentes nos vegetais, envolvidas na transduo de sinais em vrias rotas durante o estresse abitico e alteraes na concentrao de ABA.

Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)

Protenas MAPK esto envolvidas em vrias rotas do metabolismo vegetal, como hormnios, estresses biticos e abiticos. Em Arabdopsis, dois genes MAPK (AtMPK4 e AtMPK6) tm expresso alterada pelo frio, salinidade e estresse hdrico, indicando a importncia dessas protenas durante situaes de estresse. Alm disso, MAPKK e MAPKKK tambm so ativadas em cascata pela MAPK em resposta a estresses (BOUDSOCQ; LAURIERE, 2005).

SNRK2
Genes SnRK2 isolados em Arabdopsis, expressos durante estresse hdrico, foram preditos com funo Kinase e apresentam sequncias homlogas a protenas SPK presentes em soja. A expresso dos genes SnRK2 tambm foi comprovada com a aplicao de ABA exgeno. Foi sugerido que, durante o estresse, protenas SnRK2 so expressas a partir da percepo de ABA e espcies reativas de oxignio (ROS-Reactive oxygen species) (BOUDSOCQ; LAURIERE, 2005).

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Expresso de produtos relacionados ao ABA e ao estresse abitico

Vrios genes esto descritos como transcritos durante estresse abitico ou tratamento com ABA exgeno. Os produtos desses genes so classificados em dois grupos: funcionais e regulatrios. Dentre as protenas funcionais esto: aquaporinas (canais de gua), enzimas necessrias na biossntese de vrias substncias de proteo osmtica (carboidratos, prolina e betana); protenas protetoras de macromolculas, LEA (Late Embryogenesis Abundant) e chaperonas; proteases, responsveis por eliminar protenas indesejadas durante o estresse (CLP protease e ubiquitina); alm de enzimas necessrias para a desintoxicao do citosol (glutationa S-transferase, superxido dismutase e ascorbato peroxidase). Chaperonas e LEA so famlias proteicas envolvidas nas respostas tolerncia a estresses abiticos em plantas, como altas temperaturas, salinidade e estresse hdrico, que podem causar a desnaturao e perda de funo de muitas protenas, pois a perda de gua do citosol promove aumento na concentrao de sais e alteraes de pH. As chaperonas e outras HSP (Heat-shock protein) so protenas menores que interagem com a superfcie de protenas maiores, impedindo que a alterao osmtica do meio altere as caractersticas dessas protenas, caracterizando um mecanismo de defesa perante o estresse. As protenas LEA foram caracterizadas primeiramente durante a fase final do desenvolvimento do embrio. A expresso dessas protenas sob estresse ou presena de ABA est associada a mecanismos de tolerncia (TAIZ; ZEIGER, 2004; VINOCUR; ALTMAN, 2005). No grupo das protenas regulatrias encontram-se genes que codificam fatores de transcrio envolvidos na transduo de sinais em resposta ao estresse, tais como as famlias kinase mencionadas, fosfolipases e enzimas para a sntese de ABA (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 1997).

Regulao de genes ABA

O aumento das concentraes de ABA em plantas durante a exposio ao

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estresse est relacionado diretamente com o incremento na expresso de genes que codificam protenas e enzimas envolvidas na rota de biossntese do ABA. Vrios estudos comprovam esse fato. A partir de plantas mutantes foi possvel identificar paralisaes em vrios pontos da rota biossinttica do ABA. Muitos exemplos de mutaes envolvendo genes que participam da biossntese do ABA foram publicados. O gene ZEP (Zeaxantina epoxidase) foi o primeiro a ser estudado. Esse gene foi isolado de algumas plantas mutantes de Arabidopsis, Nicotiana plumbaginifolia e Oryza sativa, as quais apresentaram acmulo de zeaxantina e reduo no contedo de ABA (NAMBARA; MARION-POLL, 2005). Em algumas plantas de milho ocorrem mutaes descritas como viviparidade. Nestes casos as sementes no apresentam dormncia, podendo germinar ainda na espiga, e as plantas no toleram estresse hdrico. No mutante vp14 (viviparous14) foi observado que a mutao provocou perda na funo da enzima NCED (9-cis-epoxicarotenoidedeoxidase), responsvel pela formao de precursores do cido abscsico na rota dos carotenoides.

Consideraes Finais
O conhecimento do impacto de estresses abiticos em plantas e o envolvimento do hormnio cido abscsico na interao com esses fatores um dos principais focos da biotecnologia vegetal moderna. Progressos em genmica e biologia molecular caracterizam uma poderosa ferramenta para incrementar esse conhecimento. Em projetos de melhoramento gentico vegetal, os quais envolvem grande quantidade de gentipos, o uso de algumas tcnicas de biologia molecular invivel. A utilizao de seleo assistida por marcadores moleculares derivados destes estudos pode aumentar a eficincia na identificao de diferenas associadas aos genes envolvidos na tolerncia ao estresse abitico. A busca de mutaes nas diversas rotas metablicas associadas s sinalizaes dependentes do ABA certamente resultam em gentipos com

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diferentes comportamentos em relao ao estresse, contudo a reviso da literatura citada neste trabalho mostra que possivelmente indivduos ABAmutantes apresentem perdas de caractersticas importantes associadas a outros caminhos sinalizados pelo hormnio.

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