Biology of Prions

Vernica Ins Cacace Instituto de investigaciones cardiologicas, Universidad de Buenos Aires-Conicet Buenos Aires Argentina Jun, 2011 Corresponding autor: veroinesc@yahoo.com.ar

Abstract
In this paper we will review various aspects of the biology of prions and focused on what is currently known about the mammalian PrP prion. Also briefly describe the prions of yeast and other fungi. Prions are infectious proteins behaving like genes, ie proteins that not only contain genetic information in its tertiary structure, ie its shape, but are also able to transmit and replicate in a manner analogous to genes but through very different mechanisms. The term prion is derived from "proteinaceous infectious particle" and arose from the Prusiner hypothesis that the infectious agent of certain neurodegenerative diseases was only in a protein, without the participation of nucleic acids. Currently there are several known types of prion, in addition to the originally described, which are pathogens of mammals and they has found in yeast and other fungi too. Prion proteins are ubiquitous and not always detrimental to their hosts. This vision of the prion as a causative agent of disease is changing, finding more and more evidence that could have important roles in cells and contribute to the phenotypic plasticity of organisms through the mechanisms of evolution.

Keybords: prion protein, neurodegenerative disease, protein conformation Resumen

En presente trabajo se hara una revision sobre diversos aspectos de la biologa de priones, haciendo incapie en lo que actualmente se conoce acerca del prion PrP de mamiferos. Ademas se describiran brevemente los priones de levaduras y otros hongos. Los priones son protenas infecciosas que se comportan como genes, esto es, protenas que no solo contienen informacin genetica en su estructura terciaria, es decir en su conformacin, sino que tambin son capaces de transmitirla y replicarla en forma anloga a los genes pero por medio de mecanismos muy distintos. El termino prion proviene de "proteinaceous infectious particle" y surgio a partir de la hiptesis de Prusiner de que el agente infeccioso de ciertas enfermedades enfermedades neurodegenerativas consista unicamente en una

protena, sin participacin de acidos nucleicos. Actualmente se conocen varios tipos de prion, ademas de los descriptos originalmente, que son patgenos de mamferos y tambien se los ha encontrado en levaduras y en otros hongos. Se trata de protenas ubicuas y no siempre perjudiciales para sus hospedadores. Esta vision del prion como un agente causante de enfermedad esta cambiando, al encontrarse cada vez mas evidencia de que pueden cumplir funciones importantes en las clulas y contribuir a la plasticidad fenotipica de los organismos a traves de los mecanismos de la evolucin.

Introduccin:
Los priones son protenas infecciosas que existen en ms de un estado conformacional, es decir, pueden adoptar distintas conformaciones en distintas condiciones, por lo cual, son excepciones a la teora clsica del plegamiento de las proteinas, que afirma que la secuencia de aminocidos determina un nico plegamiento de la protena, es decir,su conformacin o estructura terciaria . Ademas, los priones llevan informacin en dicha conformacin, de manera anloga a los genes. Cada conformacin tiene una informacin distinta que es heredable. Se comportan no solo como agentes infecciosos sino tambin como genes. Pueden transmitir, replicar y expresar en forma de algun fenotipo la informacin que contienen. Se conocen varios tipos de prion, en mamferos se encuentra el prion prp, responsable de las encefalopatias espongiformes transmisibles (TSEs), que son enfermedades neurolgicas invariablemente letales y que actualmente no tienen tratamiento. Este prion puede existir en dos conformaciones: prpsc y prpc. Prpsc es la version infecciosa, que causa TSE, mientras que prpc es la versin normal de la proteina y no produce enfermedad, al contrario cumpliria funciones celulares normales. Este prion esta altamente conservado en la evolucin y estara presente no solo en mamferos sino tambin en la mayora de los grupos de vertebrados, por ejemplo se lo encontro en el pollo y en reptiles (1,2). Hasta donde se conoce, solo en mamferos produce enfermedad. Los demas priones conocidos actualmente son los de levaduras y hongos filamentosos. Adems, recientemente se detect un nuevo prion en un molusco marino (genero Aplyssia) que cumple funciones relacionadas con la formacin y mantenimiento de la memoria, lo cual es muy novedoso (3). En Saccharomices cerevisiae se encuentran los priones que forman amiloides, denominados URE3, PSI y PIN (4,5). Adems, actualmente, la proteasa vacuolar beta de levadura tambin es considerada un prion. La versin normal de esta protena es simplemente una proteasa que degrada protenas innecesarias. La versin infecciosa es denominada simplemente beta y activa a su propio precursor, de esta forma se autorreplica comportndose como prion (6). Por otra parte, en el hongo filamentoso Podospora anserina se encuentra el prion Het-s (7). Los priones Het-s y beta cumplen funciones celulares: Het-s interviene en la incompatibilidad citoplasmtica mientras que beta como fue indicado, participa

de la degradacin de protenas innecesarias. URE3 y PSI son infecciosos, se comportan en forma anloga al prp de mamferos. Aparentemente, PIN es neutral (no cumple funciones celulares ni produce enfermedad) (4,5,6,7). Todos los priones son protenas codificadas en el genoma del organismo hospedador. Invariablemente presentan ms de una conformacin y cada una de ellas otorga una caracterstica fenotpica distinta. Tienen la capacidad de autopropagarse en forma infecciosa y de ser heredables. Adems, en todos los casos (excepto en el prion beta), la conformacin infecciosa es capaz de formar agregados del tipo amiloide proteasa resistentes (6). En cuanto a la nomenclatura, se denomina prion a la conformacin infecciosa de una dada proteina, la que tiene caractersticas autorreplicativas y se nombra con otro nombre a la conformacin considerada normal de la misma. Por ejemplo, en el caso de la proteina prp, se toma como prion a la conformacin prpsc y a prpc se lo considera simplemente una protena normal no prionica. De esta manera, es comun encontrar en la bibliografa frases como por ejemplo que prpsc es un prion de prpc o que Psi es un prion de la proteina Sup35. No hay que olvidar que aunque se utilice esta nomenclatura, en realidad las conformaciones son versiones distintas de una misma protena (con una nica secuencia de aminocidos). Por esto, en principio se podran considerar como prionicas a todas ellas y la diferencia estaria dada por el hecho de que algunas conformaciones son autorreplicativas comportndose como priones clsicos y otras cumplen otra funcion. De esta forma, por ejemplo prp es un prion mientras que prpsc y prpc son las posibles conformaciones que puede tener. En sentido amplio, tal vez se deberia definir como prion a cualquier proteina con distintas conformaciones cada una con diferente funcion y capaz de cambiar de una conformacin a otra. En presente trabajo se hara una revision sobre diversos aspectos acerca de la biologa de priones, haciendo incapie en lo que actualmente se conoce acerca del prion PrP de mamiferos. Ademas se describiran brevemente los priones de levaduras y otros hongos.

El prion prp
La proteina prp fue identificada por primera vez en experimentos que intentaban demostrar la presencia de cidos nucleicos virales como componentes del agente infeccioso de las encefalopatias espongiformes transmisibles (TSEs). El agente causante de las mismas, purificado parcialmente del cerebro de animales enfermos de TSE result ser una protena insoluble de 33 kD que fue denominada prpsc que significa prion del scrapie por el nombre de la TSE estudiada que era el scrapie, que afecta al ganado ovino. Pronto se observo que el tratamiento de esta protena con proteinasa K generaba un fragmento de 27-30 Kd que fue identificado como el principal componente del agente infeccioso. Este fragmento resulta ser infectivo cuando es inoculado en animales de laboratorio (8). Con tcnicas de secuenciacion se obtuvo la secuencia aminoacdica de la porcin N-terminal de la proteina prpsc y con esta fue posible sintetizar la secuencia de nucletidos correspondiente que se utiliz como sonda para

encontrar el supuesto gen de origen viral. Este gen se encontro donde menos se lo esperaba: en el genoma del hospedador y no correspondia a un gen viral sino a un gen cromosomal copia unica ubicuo en las distintas especies de vertebrados (1,2) independientemente de la existencia o no de infeccin por prpsc (9). Dicho gen fue denominado PRP (tambien conocido como PRNP) y su producto genico es la proteina prp, mayormente la versin normal (denominada prpc, por cellular prion protein. Esta proteina puede originar una isoforma patognica (denominada prpsc) de forma espontanea si su gen PRP presenta alguna mutacin puntual que favorezca un cambio de conformacin. La presencia de prpc es totalmente necesaria para que la infeccin por priones ocurra. Los ratones knockout para el gen PRP son resistentes a la infeccin con priones prpsc inoculados por diversas vias como la periferica o la intracerebral (9). La secuencia de aminocidos de prpc y de prpsc por supuesto es la misma, como ya fue indicado anteriormente, ambas son la misma proteina pero con distinta conformacin. Se las puede llamar confrmeros o isoformas. Las diferencias entre ambas isoformas radican en el hecho de que prpc presenta un 40% de -helices y menos del 10% de lminas en su estructura terciaria mientras que prpsc tiene alrededor de un 50% de lminas (figura 1). La capacidad de prpsc de ser infecciosa radica en su conformacin (8,10), se trata de una versin alterada de prp que perdio su funcion fisiolgica normal pero gano la capacidad de autorreplicarse mediante la conversin de molculas de prpc (que utiliza como molde) en mas molculas de si misma. Otra caracterstica que permite distinguir a prpc de prpsc es la resistencia al tratamiento con proteasas: prpc es totalmente degradada pero prpsc resulta ser parcialmente resistente a estas enzimas. El tratamiento de prpsc con proteinasa K produce un peptido de 142 aa denominado prp 27-30 que tiene la capacidad de polimerizar en amiloides y es neurotxica (10). Prpc est altamente conservada en la evolucin. La similitud entre la Prpc de distintas especies de mamferos oscila de un 85% al 97%, mientras que al comparar la secuencia entre primates y humanos la similitud es del 92,9 -99,6 % (11).

Figura1.Estructurasproteicas obtenidas con Rasmol. A la derecha se muestra la estructura de prpc, mientras que la imagen de la izquierda corresponde a prpsc. Se observa el mayor contenido de lminas en prpsc, mientras que en prpc predominan las -helices.

Prpc es una protena celular normal que se expresa en las neuronas y clulas de la gla en el cerebro y mdula espinal. Tambin est presente en otros tejidos, principalmente tejido linfoide como el bazo y en las clulas del sistema inmune tales como clulas dendrticas y linfocitos B (12,13,14,15). El mensajero de prpc aparece en el cerebro de raton y de pollo en etapas tempranas del desarrollo embrionario y su nivel aumenta en el transcurso de la embriognesis (13,14). En el cerebro adulto, el mRNA de prp esta amplimente distribudo y se concentra en zonas tales como las clulas de Purkinje del cerebelo, neuronas hipocampales, neocorticales y motoras (16).

Estructura de prpc:
El gen humano PRP est situado en el brazo corto del cromosoma 20. Posee un solo exn a diferencia de los correspondientes a ratones, vacas y ovejas que tienen 2 exones. Los promotores de los genes de hamster y de ratn poseen varias copias de secuencias repetidas ricas en G+C pero carecen de TATA box (17,18). El gen PRP codifica a prpc, que posee alrededor de 250 aminoacidos segn la especie. El transcripto primario de prpc no presenta splicing alternativo (19). La protena prpc consta de dos dominios: una porcion N-terminal flexible capaz de unir iones cobre, con una serie de 5 repeticiones de octapeptidos ricos en prolina y glicina y una porcion C-terminal con un segmento hidrofbico central altamente conservado que posee tres -helices (denominadas H1, H2, H3 ) (20). Adems en el extremo C-terminal posee una secuencia para la adicin de un ancla de fosfatidilinositol (GPI) mientras que en el extremo N-terminal posee un pptido seal de 22 aa (KDEL) para dirigir la biosntesis de la protena al retculo endoplsmico. Dicho pptido es clivado una vez que prpc es translocada al retculo (21). Por otra parte, en lo que respecta a la conformacin prpsc, como se indic, presenta mayor porcentaje de lminas que prpc. El cambio conformacional principal que distingue a prpsc de prpc es la ausencia de la -helice H1 de prpc que esta transformada en lamina en prpsc (20), esto afecta las propiedades fisicoqumicas de la proteina y su funcionalidad. Prpsc presenta escasa solubilidad en detergentes no ionicos, capacidad de formar agregados y resistencia parcial a la digestin con proteinasa K (20). La digestin de prpsc con dicha enzima produce un fragmento truncado en el extremo N-terminal denominado prp27-30 o prpres (por resistente in vitro). Adems, en condiciones fisiolgicas est favorecida la conformacin rica en -helice de prpc siempre y cuando el gen PRP no este mutado. Muchas enfermedades causadas por priones se deben a mutaciones en el gen PRP que resultan en la sntesis de prpc con conformaciones alteradas ricas en laminas como la de prpsc. Se trata de autenticas molculas de prpsc obtenidas en ausencia de infeccin por prpsc exogena. En la figura 2 se muestra la estructura de prpc basada en la informacin de (21).

Fig 2. Estructura y procesamiento posttraduccional de prpc. En la parte superior se muestra la protena recin sintetizada. Abajo se muestra la estructura de prpc madura. A y B son las posiciones de clivaje, C es la posicin de clivaje que ocurre en la conformacin prpsc cuando se la trata con proteinasa K, generando el fragmento prp37-30. B esta cercano al aa 110, C al aa 89 y A se encuentra en el GPI entre el motivo de diacilglicerol y el residuo de etanolamina.

Funcion de prpc:
Esta protena se localiza en la superficie celular (es una glicoprotena de membrana) esto sugiere que podra tener alguna funcin relacionada con la transduccin de seales, uptake de ligandos, adhesin celular y reconocimiento celular. Prpc se vera imposibilitada de cumplir su funcin normal en presencia de prpsc, que le hace cambiar su conformacin y esto sera responsable en parte de los sntomas que aparecen durante las encefalopatias espongiformes. Sin embargo, en experimentos con ratones en los que se hace knock out genico del gen PRP no aparece ningun cambio fenotpico, ni anormalidad visible (22), aunque otros autores encuentran efectos sobre el ritmo circadiano y el patron de sueo (23), anormalidades fisiolgicas y estructurales en el hipocampo (24,25,26), prdida de celulas de Purkinje en el cerebelo (27) y cambios en los patrones de aprendizaje y memoria (28,29). Aun asi, otros investigadores no encuentran estas anormalidades (22, 30, 31). Esto estara

relacionado con diferencias entre las lneas de ratn utilizadas que pueden tener diferencias en las regiones del gen PRP que se mutagenizan o se reemplazan, siendo mas o menos susceptibles a la ausencia de prpc funcional. Por otra parte, diferencias ambientales tambien pueden influir en el fenotipo. En ciertas condiciones, prpc podra ser necesaria, evidencindose entonces una anormalidad fenotipica en los mutantes nulos, Por ejemplo un ratn mutante nulo para prpc expuesto a factores ambientales que aumenten su nivel de estrs oxidativo probablemente presente anormalidades en el fenotipo relacionadas con la ausencia de prpc ya que esta protena interviene en la defensa antioxidante. Otra posibidad es que simplemente, prpc sea una protena redundante, es decir, tiene una funcion que tambin poseen otras protenas, de modo tal que la ausencia de prpc esta siendo suplida total o parcialmente por otras proteinas, resultando en la ausencia de un cambio fenotipico visible. La realidad es que actualmente no existe una sola funcin de prpc de la cual haya podido determinarse inequvocamente que ocurre en las celulas in vivo salvo permitir la infeccin por parte de prpsc. Entre las funciones que se cree posee prpc se pueden destacar: El posible papel en el metabolismo del cobre y defensa antioxidante: Como anticip en el apartado anterior, prpc cumplira funciones relacionadas con la defensa frente a los radicales libres. Esta defensa la ejercera mediante su capacidad de secuestrar iones cobre libres del medio celular (estos iones participan en reacciones de Fenton involucradas en la produccin de especies oxidantes) y mediante su asociacin con superoxido dismutasas (SODs) que son enzimas que participan de la defensa antioxidante convirtiendo el radical libre anin superxido en perxido de hidrgeno, a las cuales prpc les proporcionaria el cobre. Adems existe evidencia de que la propia prpc tendra funcion enzimtica de superoxido dismutasa. Evidencia experimental a favor de dicha funcion de prpc: Ratones nulos para PRP tienen menor contenido de cobre asociado a membrana plasmtica y una menor actividad de superxido dismutasas que requieren cobre como cofactor por lo que son mas propensos a extres oxidativo(32,33, 34, 35). Ademas, tanto prpc recombinante como tambin pptidos derivados de prpc son capaces de unir iones cobre a traves de las repeticiones ricas en histidina presentes en la mitad N-terminal de la proteina. La regin con repeticiones contiene 5 motivos en tandem de octapeptidos cuya forma general es P(H/G) GGGWGQ y est altamente conservada en las distintas especies de mamferos, mientras que en la prpc aviar existe una region similar que consta de ocho repeticiones en tandem de octapptidos (32). El cobre parece ser importante para mantener la conformacin de prpc ya que estabiliza las -helices de la protena al unirse a esta en forma cooperativa. Esto se vio en estudios de espectroscopa que muestran que se unen cuatro iones cobre por molcula de prpc en las histidinas (37, 38). Adems, como es necesario como cofactor de enzimas e interviene en la produccin de radicales

libres cuando esta en forma libre, es necesario su unin a protenas (como por ejemplo prpc) y compartimentalizacin para minimizar sus efectos negativos. El contenido de cobre en extractos de tejido cerebral enriquecidos en membrana de ratones knock out para el gen PRP es de 10 a 15 veces menor que en ratones control (que expresan prpc) mientras que no se observan variaciones en el contenido de otros metales. Esto sugiere que prpc es una protena de union a cobre, importante para el metabolismo de este in y podra controlar la actividad de otras protenas asociadas a membrana que requieren cobre como cofactor (33). Adems, mediante el empleo de cultivos primarios de clulas cerebelares expresando diferentes cantidades de prpc se encontro que las clulas con alta expresin de la misma tienen mayor resistencia al extres oxidativo en comparacin a clulas prpc- (29). Esto sugiere que la capacidad de prpc de unir cobre es capaz de regular la actividad de enzimas involucradas en la defensa antioxidante, en particular superoxido dismutasas que requieren cobre como por ejemplo la SOD-1 y en consecuencia modular la respuesta al extres oxidativo. Si se sobreexpresa prpc en ratones wild type no se observa aumento de expresin de estas enzimas en ensayos de Northern, pero si su actividad. Los niveles de enzimas SOD son los mismos en ratones wild type, knock out para PRP y en los que sobrexpresan el gen, lo que varia es la actividad (29). Ademas segn algunos autores, prpc podria funcionar como un receptor para la endocitosis de cobre (30), mientras que para otros, la misma prpc tendra dicha actividad de superoxido dismutasa y uniria iones cobre para emplearlos como cofactor (32,33). Interaccion con otras proteinas: supervivencia, diferenciacin y transduccion de seales: Aunque est demostrada la union de prpc a diversas protenas, la importancia fisiolgica de cada una de dichas interacciones aun no esta del todo clara y no siempre las interacciones encontradas en estudios in vitro se corresponden con lo que ocurre in vivo. Se requieren mas estudios para aclarar este punto. Ciertas caractersticas estructurales de prpc permitiran su interaccin con otras protenas. Entre los sitios potenciales para las interacciones se encuentra una de las -helices ubicada en el centro de la molcula y el ancla de GPI (32). Prpc es capaz de unirse a heparinas y compuestos similares a esta. La heparina es un polianin sulfatado similar a los glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos forman parte de la composicin de las placas amiloides que se forman en presencia de prpsc. Aparentemente, las moleculas de heparina secuestran prpc impidiendo que se una a los glicosaminoglicanos por competencia. En un ensayo de union de prpc a los polianiones mediante la tcnica de surface plasmon resonance muestra que la afinidad de prpc recombinantes por los polianiones esta correlacionada con una menor capacidad de interactuar con prpsc (36).

En un trabajo del grupo de Edenhofer (37) se utilizo el sistema de doble hbrido de levadura para buscar posibles protenas que interactuan con prpc. En este estudio se encontro que una chaperona celular (Hsp60) es un ligando especfico de prpc. El sitio de interaccin fue mapeado entre los aa 180 y 210 de prpc. Posteriormente se encontro que la protena Bip (otra chaperona) se asocia a prpc (32). Dicha protena normalmente interacta con protenas mal plegadas o no ensambladas y media su translocacin a los proteasomas donde son degradadas (38). Prpc tambin se une a la protena NCAM , una molcula de adhesin neuronal (39), al factor 2 relacionado a NF-E2 (Nrf2) que es un factor de transcripcin (40), a Bcl-2 (una protena antiapopttica (32,41) y a la apolipoproteina E (ApoE), protena de membrana que esta involucrada en la enfermedad de Alzheimer. Prpc se une al extremo N-terminal de ApoE a traves de su region N-terminal. Adems esto ocurre en los hoyos revestidos de clatrina de la membrana plasmtica. No se conoce que funcin cumple en la clula esta interaccin y algunos autores incluso proponen que podria tener relacin con la conversin de prpc a prpsc (42,43). Otra protena caracterizada como ligando de prpc es el precursor del receptor de laminina de 37Kda (44). Se encontr que existe interaccin de este receptor y prpc tanto in vitro como in vivo y adems est sobreexpresado en organos que acumulan prpsc (45) Actualmente se cree que ste es el receptor de prpsc en las clulas de mamfero in vivo, aunque muy probablemente no sea el nico. Prpc tambin se une a la laminina, y el complejo laminina-prpc favorece la neuritognesis de clulas en cultivo tratadas con factor de crecimiento neuronal (NGF)(46), por esto se piensa que prpc podra estar involucrada en el reconocimiento de ligandos y adhesin celular, mediante los cuales se disparan seales de proliferacin y supervivencia en las celulas (32,47). La laminina es una glicoproteina de 880 kD compuesta por dos polipptidos grandes y uno mas corto dando un heterotrmero. Cumple funciones relacionadas con migracin celular, adhesin celula-celula, apoptosis, diferenciacin y proliferacin celular, mediante su interaccin con receptores de membrana. En el sistema nervioso central, la laminina participa de la diferenciacin celular a traves de su interaccin con integrinas y tambien de la migracin de clulas y regeneracin axonal. Tambin evita la apoptosis de neuronas . Adems, la laminina es degradada por la plasmina, que se produce a partir del plasmingeno por accin del activador de plasmingeno. La deplecin de laminina en las neuronas es seal de apoptosis (47). En ausencia de prpc la degradacin de la laminina se encuentra aumentada, haciendo a las neuronas mas sensibles a la apoptosis. Prpc acta como receptor de la laminina de alta afinidad y saturable. Prpc se une a la cadena de la laminina (que es la mas conservada en todos los tipos de laminina) a traves de su extremo C-terminal (32) adems puede interactuar con el plasmingeno (48).

PrPc y transducin de seales A travs de su localizacin en la membrana, prpc podra participar en vas de transduccin de seal. Segn algunos autores, la infeccin por priones afecta la funcin de canales de calcio. Por ejemplo, se vio que en clulas infectadas estimuladas con bradikinina (un estimulante de la funcin de los canales de calcio) presentaron una menor respuesta de los mismos en comparacin a clulas control no infectadas (32). Adems, un fragmento de prpsc de 21 kD (el prp 106-126) es txico para cultivos primarios de clulas del hipocampo de rata. Este pptido es capaz de formar canales permeables a iones Ca y Na en membranas plasmticas (32, 49). Tambien se observ que el pptido incrementa la concentracin de calcio en clulas de microglia en cultivo obtenidas de ratones prp-/- lo cual activa vias de sealizacin (50). Dicho pptido permite la activacin de las kinasas Lyn y Syk que participan de una cascada de transduccin que resulta en la liberacin de calcio intracelular y activacin de la kinasa C y de una tirosin kinasa dependiente de calcio denominada PYK2. Luego ocurre la activacin de MAP kinasas (ERK-1 y 2) (32). Prpc dispara la cascada de sealizacin mediante el aumento del nivel de fosforilacin de la tirosin kinasa fyn y la caveolina-1 es el factor intermediario entre prpc que esta del lado extracelular de la membrana y Fyn que es citoplasmtica (32,43). Por otra parte, la unin de prpc a la laminina aparentemente dispara la cascada de cAMP y la liberacin de calcio (32). Migracin celular: Prpc en celulas endoteliales que forman parte de la barrera hematoenceflica se acumula en las uniones celula-celula y participa de la transmigracin de monocitos de los tejidos perifricos hacia el cerebro (51) posiblemente mediante reconocimiento especfico de ciertas molculas de la superficie de los monocitos.

Biosintesis de prpc:
Prpc es sintetizada por ribosomas asociados al retculo endoplasmico. Al ser translocada al lumen del retculo, se cliva el peptido seal N-terminal, se aade un core de oligosacaridos con union N en dos sitios (sitios A y B en la fig2), se forma un puente disulfuro y se adiciona el GPI. La protena es transportada entonces en vesculas al golgi donde se procesa el oligosacarido, y se agrega acido sialico al GPI y tambien al oligosacarido (21). Como resultado se obtiene la protena madura prpc que es transportada a la membrana plasmtica donde queda anclada por medio del GPI. La cadena de oligosacaridos que se agrega inicialmente en el retculo es del tipo alta manosa y es sensible a la digestin con endoglicosidasa H. Esta

cadena de oligosacarido es modificada en el golgi y queda como un oligosacarido complejo que contiene acido silico y resulta resistente a la endoglicosidasa H (35). El ancla de GPI se agrega en el retculo luego del clivaje del segmento hidrofbico C- terminal y posee una porcin central que es comun a otros GPIs, presentes en otras glicoprotenas, este esta compuesto de un residuo de etanolamina unido al aa C-terminal por una union amida, tres residuos de manosa, un residuo de glucosamina no acetilado y una molcula de fosfatidilinositol (PI) que se encuentra insertada en la membrana plasmtica. El GPI de prpc (y de prpsc ) es poco comun porque posee acido silico en la porcin central, (52). La cadena de oligosacarido y el ancla de GPI de prpc es totalmente idntica a la de prpsc, ambas isoformas son sintetizadas de la misma manera y sufren las mismas modificaciones posttraduccionales, existen diferencias en el oligosacarido entre las distintas cepas de prion (53). La modificacin experimental de la glicosilacin de prpc altera el transporte de la misma. La mutacin de los dos sitios consenso de glicosilacin existentes en el gen PRP de raton o en la region N-terminal producen plegamiento anmalo de la protena y su acumulacin en un compartimiento proximal al golgi medio (54), Pero la glicosilacin correcta no es totalmente necesaria para el transporte ya que la mutacin del sitio consenso C-terminal o la sntesis de prpc en presencia de tunicamicina (un inhibidor de la glicosilacion) no impide que algunas molculas lleguen a la superficie celular (54). Adems, en ausencia de inhibidores es posible encontrar pequeas cantidades de prpc no glicosilada en la membrana (35,54). Por otra parte, las molculas de prpc con alguno de los sitios de glicosilacin mutados presentan caractersticas que las asemejan a prpsc, al igual que las que son sintetizadas en presencia de inhibidores de la glicosilacion (54). En conclusin puede decirse que prpc tiene tendencia a adoptar la conformacin de prpsc en condiciones fisiolgicas durante su biosntesis y transporte, pero las cadenas de glicano que posee ayudan a impedir este cambio conformacional. Adems, esto es coherente con el hecho de que existen distintas cepas de priones y estas presentan diferentes patrones de glicosilacin, que las distinguen entre s (21). Parece que en la mayoria de los casos, lo que diferencia una cepa de otra es precisamente el patron de glicosilacin. Procesamiento postraduccional de prpc: Una vez sintetizada, prpc es clivada en dos sitios distintos. Esto se vio a partir de experimentos con clulas transfectadas y en muestras de tejido cerebral y fluido cerebroespinal (35,55,56). Unos de los clivajes ocurre en el ancla de GPI liberando la protena en el medio extracelular, pero no a todas, el resto queda anclada en la membrana. Una fosfolipasa de membrana plasmtica seria la responsable de catalizar el corte del GPI (57). El otro clivaje consiste en el corte proteoltico en un segmento de 16 aminocidos muy conservado en las distintas especies que libera un pptido de prpc de 10kD que es un fragmento N-terminal de la

protena. Este clivaje ocurrira en dominios ricos en colesterol presentes en la membrana plasmtica (56). Se sabe adems, que ambos tipos de procesamiento ocurren en forma relativamente lenta en comparacin con la vida media de prpc, de modo que en el estado estacionario de la reaccin, existe una poblacin de prpc en distintos estados del procesamiento, es decir, existen todas las especies posibles: prpc intactas unidas a membrana por GPI, prpc libres en el espacio intercelular con y sin el corte en el dominio de 16 aminocidos. No se sabe bien que funciones cumple cada producto proteico. Probablemente, la forma de 10 kD sea un ligando. Existen factores de crecimiento que se encuentran en forma de precursor unidos a la membrana plasmtica y son liberados de la membrana por proteasas, dando el factor activo. Tal vez prpc se comporte de forma anloga. Otra posibilidad, es que prpc sea realmente un receptor de membrana (tal como gran parte de la evidencia experimental sugiere). Este receptor, podra en teora existir en dos formas principales: anclado a membrana por el GPI o libre en el medio extracelular. (Adems se pueden agregar como variantes de este modelo hipottico el estado clivado o no clivado en el dominio de 16 aminocidos y la topologa de la proteina, esto ultimo se explicara ms adelante). En forma anclada, prpc se unira a un ligando desconocido y participara en alguna cascada de transduccin de seales. La forma libre tambin unira el ligando pero no podra transducir la seal. Esto es similar a lo que ocurre con receptores de factores de crecimiento y de citoquinas, que pueden existir en dos formas (soluble y anclada). La forma soluble es regulatoria, secuestra ligandos compitiendo con la forma anclada. Pareceria que en el caso de prpc ocurriria algo similar.

Localizacin de prpc en la celula y transporte: En las molculas de prpc ancladas a membrana, la unin a la misma consiste exclusivamente en el ancla de GPI (salvo para las formas transmembrana que son isoformas topolgicas y seran tratadas posteriormente), por esta razn, prpc puede liberarse de la membrana por tratamiento con fosfolipasa C dependiente de fosfatidilinositol (PI-PLC), que es una enzima bacteriana que corta el GPI en el diacilglicerol (58). En las neuronas, prpc es transportada por los axones hacia las terminaciones nerviosas (59), En estudios de inmunocitoqumica combinada con microscopa se vio que prpc se encuentra en terminaciones nerviosas de bulbo olfatorio y estructuras lmbicas (21) por lo que podra tener alguna funcin relacionada con la sinapsis. Mucho de lo que se sabe acerca del trfico subcelular de prpc proviene de estudios con clulas transfectadas que expresan la protena. En experimentos con prpc aviar (que es muy similar en estructura a la de mamferos, comparten homologia), se vio que una vez sintetizada y anclada a la membrana plasmtica no se queda alli sino que es endocitada, pasando al compartimiento endosomal. De hecho hay un reciclaje de prpc de la membrana hacia los endosomas(21,60). Esto es coherente con la posible funcion de prpc en el metabolismo del cobre, facilitaria la endocitosis del mismo mediada por

receptor (la propia prpc actuaria como receptor del in). Luego, los iones incorporados se disociaran de prpc debido al ph acido del endosoma y sera transferido a otras protenas transportadoras de cobre. Dicho transporte de prpc se vio a partir de estudios en los que se utilizaron anticuerpos contra prpc marcados con un fluorforo en cultivos celulares transfectados con el gen PRP. En estos estudios se sigui la marca del fluorforo, que desapareca de la membrana apareciendo en los endosomas(21). Adems, los iones cobre en concentracin fisiolgica estimulan en forma rpida y reversible la endocitosis de prpc (30). El papel de las Caveolas y vesiculas revestidas de clatrina: Muchos receptores celulares (como por ejemplo el receptor de LDL) se ubican en dominios de la membrana plasmtica recubiertos de clatrina (chlatrin coated pits) La clatrina es es una protena oligomrica de alto peso molecular formada por tres cadenas pesadas y tres cadenas livianas que se ensamblan formando una estructura llamada triskelion que polimeriza en la cara citoslica de la membrana plasmtica. Esto produce la invaginacin de la membrana que cuando es endocitada origina vesculas recubiertas de clatrina. Entre las estructuras celulares responsables de la endocitosis de prpc se encuentran estos dominios de membrana plasmtica recubiertos de clatrina (21, 61). Mediante microscopa electrnica se localiz prpc marcada con oro en las vesculas recubiertas de clatrina. Adems, la incubacin de clulas que expresan prpc en medio hipertnico con sucrosa (esto lleva a la disrupcin de las uniones entre molculas de clatrina) inhibe la endocitosis de prpc y en preparaciones purificadas de vesculas recubiertas de clatrina de tejido cerebral es posible encontrar prpc mediante anticuerpos especficos. El segmento N-terminal de prpc es esencial para la endocitosis. Si se deleciona esta regin, la internalizacin de la protena disminuye considerablemente (62). Se sabe que los receptores transmembrana que son internalizados por mecanismos dependientes de las vesculas recubiertas de clatrina en general poseen residuos de tirosina que se unen a la clatrina a traves de protenas adaptadoras. Resulta extrao que prpc sea internalizada por dicho mecanismo ya que es una protena anclada a membrana mediante GPI y este tipo de protenas no posee dominios citoplasmticos que puedan interactuar con la clatrina a traves de las protenas adaptadoras (21). Algunos autores proponen que por esta razon prpc no puede ser endocitada en vesculas recubiertas de clatrina sino que en realidad lo haria mediante un mecanismo alternativo que involucra caveolas (63). Las caveolas tambin son dominios de membrana que presentan cierta invaginacion, pero estan recubiertos de una protena denominada caveolina del lado citoplasmtico en lugar de clatrina. Estas estructuras estan involucradas en sealizacin celular y uptake de ligandos. Son abundantes en fibroblastos, celulas musculares lisas y clulas endoteliales. Sin embargo, clulas neuronales que expresan prpc y que no expresan caveolina son capaces de internalizar prpc esto sugiere que o bien prpc es endocitada a traves de la via endocitica clsica dependiente de clatrina a pesar de ser una proteina con GPI o lo hace por medio de otro mecanismo en dichas clulas. Aparentemente, en las neuronas prpc se ubica en microdominios de membrana que poseen otras protenas y cierta composicin

de lpidos particular. Estas regiones se denominan lipid Rafts (balsas lipdicas) y actualmente el modelo aceptado para la endocitosis de prpc involucra a estos dominios mas que a la clatrina (21). Por otra parte, el mecanismo via clatrina podria ser correcto si prpc interactuara en la membrana con alguna protena receptora en los hoyos recubiertos de clatrina. Esta protena aportara el dominio citoslico que se une a las protenas adaptadoras que esta ausente en prpc y ademas poseera un dominio extracelular capaz de unirse a la porcion N-terminal de prpc. La unin de iones cobre a prpc estimulara la unin de sta a su receptor y en consecuencia se favorecera la endocitosis del complejo cobre-prpc unido al receptor. Dicho receptor aun no fue identificado inequvocamente, mas bien se encontraron varios posibles candidatos, por ejemplo laminina, NCAMs,etc. Una aproximacin experimental para encontrar el receptor es la bsqueda de sitios de union en prpc para proteinas conocidas. En un estudio de este tipo realizado con proteinas de fusion conteniendo el fragmento N-terminal de prpc se encontr que dicha regin posee sitios de unin para glicosaminoglicanos (GAGs), en especial heparan sulfato (21). Prpc se asocia a lipid rafts ricos en colesterol y glicoesfingolpidos a traves de la union de su ancla de GPI con lpidos saturados presentes en estos dominios de membrana y tambin mediante la interaccin de su extremo N-terminal con protenas presentes en los rafts como por ejemplo la caveolina-1. Dichos dominios lipdicos son resistentes a detergentes y presentan diversas protenas ancladas por GPI (21). En algunas clulas, prpc es endocitada a traves de caveolas, pero en las neuronas, una vez que une cobre en las repeticiones de octapptidos de la region N-terminal, se transloca fuera de los rafts y va a regiones de membrana que se solubilizan cuando son tratadas con detergentes desde donde accede a los hoyos recubiertos de clatrina, donde es endocitada. La region N-terminal de prpc es importante para la union de la protena adaptadora ubicada en las regiones recubiertas de clatrina. La asociacin de prpc a los rafts ocurre a traves de diversas molculas involucradas en la sealizacin celular, entre las que puede destacarse la caveolina-1 y las tirosinkinasas Fyn y Scr. El agrupamiento de prpc en los rafts dispara procesos relacionados con la tranduccin de seales, entre ellos, el reclutamiento de molculas de adhesin celular que promueven el crecimiento de las clulas neuronales. Ademas, los lipid rafts funcionaran como un microambiente favorable para la conversin de prpc en la forma patolgica prpsc (64). En cuanto a la localizacin de prpsc en las clulas, en estudios con tcnicas de inmunofluorescencia en celulas N2A infectadas con prpsc se encontro que parte de las moleculas de prpsc se encuentran en el interior celular, donde colocalizan con marcadores de aparato de Golgi (65), ademas tambin se encontr que colocaliza con protenas marcadoras de endosomas y lisosomas (66,67) y tambin aparecen en la membrana plasmtica, donde son observables mediante microscopa electrnica (66). En base a estos resultados, es evidente que prpsc sigue las mismas vias de localizacin celular que prpc, lo cual es de esperarse ya que al igual que prpc posee ancla de GPI, lo cual restringe su localizacin a la membrana plasmtica y ademas esto le

permite acceder a la via endoctica, con lo cual va sufrir transporte hacia endosomas y lisosomas. Por otra parte, las molculas de prpsc sintetizadas de novo en las clulas tienen la seal de translocacin al retculo y de adicin de oligosacridos que posee prpc. Se sintetizan y procesan de la misma manera descripta para prpc. Topologia de prpc en la membrana plasmtica Normalmente, la topologa de una protena (esto es, su ubicacin y orientacin en el espacio) es nica y est determinada por elementos topognicos en su secuencia de aminocidos (68). De esta manera, todas las molculas de una misma protena no solo se sintetizan de la misma manera y tienen el mismo procesamiento sino que se ubican de la misma forma en el espacio, por ejemplo todas con el N-terminal del lado del citosol. En el caso de prpc, esto no se cumple. Esta protena posee tres elementos de secuencia con funcion topogenica: el peptido seal N-terminal que la destina al reticulo, un segmento de a-helice hidrofbico como el que poseen los dominios transmembrana de otras protenas, y la secuencia seal para adicion del GPI en el extremo C-terminal (68). Por alguna razon desconocida, los elementos topognicos fallan en determinar una unica topologia para prpc, de esta manera, en condiciones normales, la poblacin de moleculas de prpc se divide en tres subpoblaciones cada una con una topologia particular y se las puede denominar isoformas topolgicas (68). Por lo general cuando una protena tiene ms de un elemento topognico, predomina uno de ellos, se dice que hay secuencias seal mas fuertes que otras, las secuencias llamadas dbiles, por ejemplo pueden ser aquellas que estan ubicadas en regiones de la protena cuya conformacin interfiere con que sean reconocidos por las protenas que participan del transporte y translocacin. En el caso de prpc dicha secuencia debil sera la regin hidrofbica, predominando la secuencia del GPI. La protena del prion es especial en cuanto a su capacidad de variar su conformacin, probablemente, la region hidrofbica que est funcionando como seal transmembrana dbil, se pliega de una forma que esconde los aa hidrofbicos del medio y resulta bastante estable en esa forma, (pero no tanto como para que toda la poblacin de prpc se pliegue asi) con lo cual no se inserta en la membrana y se le aade el GPI. Las isoformas topolgicas de prpc son: Una forma de secrecin denominada secprpc, esta es la isoforma mayoritaria y se trata simplemente de la prpc clsica anclada por GPI del lado extracelular de la membrana plasmtica descripta en el apartado de biosntesis. Esta isoforma es transportada en vesculas de secrecin a la superficie exterior celular donde queda anclada a travs del GPI en dominios de membrana caveolas o invaginaciones recubiertas de clatrina segn se detallo anteriormente. Una vez all, algunas molculas son liberadas al espacio extracelular por escisin del GPI mientras que la mayora es internalizada en el compartimento endoctico y realiza ciclos entre este compartimiento y la membrana (69).

Una forma transmembrana con el extremo N-terminal del lado del lumen del retculo (igual que secprpc) y el C-terminal del lado citosolico denominada NTMprpc por prpc transmembrana (TM) con N-terminal luminal (N). Otra forma transmembrana con el C-terminal del lado del lumen del retculo y el N-terminal del lado citoslico (denominada CTMprpc anlogamente a NTMprpc) La isoforma secprc se considera normal y no produce neurodegeneracion. En cambio, CTMprpc es una proteina transmembrana que se acumula en el Golgi y se comporta como un intermediario neurotoxico (69). Existen mutaciones en el gen PRP que favorecen la capacidad de prpc de adoptar la forma CTMprpc. Dichas mutaciones se asocian a encefalopatias espongiformes en humanos y ratones. Por ejemplo una mutacin denominada prp A117V produce la enfermedad GSS en humanos (detallada mas adelante en el apartado de enfermedades) y presenta aumento de la concentracin de CTMprpc (19,68,69,70). Dicha isoforma es la menos estable de las tres y presentara una flexibilidad conformacional mayor con lo cual aumenta la probabilidad de convertirse en prpsc en forma espontanea. Esto sera al menos en parte responsable de la aparicin de encefalopatia espongiforme en individuos con mutaciones en PRP. Otras mutaciones que afecten otras regiones de la protena tambin pueden resultar en la sintesis de prpc con conformacin alterada patolgica. Asimismo, variaciones en el ambiente celular debidas a diversos motivos pueden estabilizar en mayor o menor grado alguna de las formas topolgicas de prpc favoreciendo segn el caso la aparicin de una encefalopatia espongiforme espordica en ausencia de mutaciones en el gen. El mecanismo responsable de originar las isoformas topolgicas es desconocido (70). Segn un modelo (70), el primer paso es la translocacin cotraduccional del pptido de prpc que se esta sintetizando mediante el reconocimiento del peptido seal N-terminal por parte de protenas asociadas al translocn (canal del retculo por donde ingresan proteinas cotraduccionalmente). Una vez dentro del translocn, la poblacin inicial de prpc que era homognea hasta ese momento es particionada en dos subpoblaciones (una formada por prpc con extremo N-terminal del lado del lumen del retculo y otra con el Cterminal del lado del lumen. La sntesis prosigue y entonces, cuando aparece la porcin hidrofbica de prpc se produce un segundo evento de particin que separa la subpoblacin de prpc con N-terminal luminal en formas transmembrana (NTMprpc) y forma secprpc. Esto ocurrira porque durante la translocacin, hay molculas que acceden al translocn en distintos estados de sntesis, algunas se translocan cuando solo tienen el peptido seal Nterminal entonces empiezan a plegarse con ayuda de als chaperonas del retculo un poco antes de que se sintetice la region hidrofobica. De esta manera, cuando aparece dicha region hidrofbica, el grado de plegamiento es tal que queda desfavorecida la insercin a la membrana entonces se obtienen la forma secprpc.

Si en cambio la protena se empieza a translocar cuando se esta sintetizando la regin hidrofbica o un poco antes de eso, las chaperonas no tienen tiempo de plegar tanto al peptido de prpc y se establece una competencia entre el segmento hidrofobico y la region N-terminal de la protena. Si gana la regin hidrofbica, se obtiene la forma transmembrna NTMprpc, de lo contrario se obtiene secprpc pues la porcion N-terminal no favorece la insercin en la membrana. En el caso de la forma CTMprpc, como tiene el extremo C-terminal del lado del lumen del retculo y el N-terminal del lado contrario, el segmento hidrofobico no puede competir con el N-terminal, entonces gana y se inserta en la membrana, obtenindose la forma transmembrana CTMprpc.

Modelos para la propagacin de prpsc El proceso de propagacin del prion es un proceso exponencial que se inicia con la interaccin de la prpsc exgena con prpc o con alguna forma de prpc parcialmente desnaturalizada a traves del reconocimiento de la region 96-167 por parte de prpsc en forma dependiente de la identidad de secuencia. Una vez que la interaccin ocurre, la formacin de mas molculas de prpsc se vuelve exponencial y la velocidad conversin es directamente proporcional al nivel de expresin de prpc (32). La presencia de prpc es absolutamente necesaria para que prpsc se propague. Ratones knock out para el gen prp son incapaces de desarrollar enfermedad cuando son inoculados con prpsc (20). Prpsc interactua con prpc durante la reaccion de replicacion de prpsc y esta interaccin es ms eficiente cuando las dos isoformas comparten la misma secuencia de aminocidos. Esta es la base de la barrera de especie que existe para la transmisin de priones de una especie a otra. La secuencia de aa de prpc vara en algunas posiciones de una especie a otra y la reaccin de conversin es ms eficiente cuanto mayor sea la similitud entre las dos isoformas interactuantes (8,18).
Existen dos modelos que explican como ocurre el cambio conformacional de prpc en presencia de prpsc, que se muestran en la figura 5 (32, 68):

Modelo del replegamiento de prpc Segn este modelo, la aparicin de una molcula de prpsc cataliza la conversion de las molculas de prpc en prpsc, para esto, prpc se desnaturaliza parcialmente y lugo vuelve a plegarse bajo la influencia de prpsc, tomando la conformacin de esta. Asi, prpsc actuaria como molde en esta reaccion, posiblemente asistida por otras proteinas, especialmente chaperonas. Las molculas de prpsc, producto de la reaccin a su vez pueden actuar como molde para convertir mas moleculas de prpc.

El cambio conformacional es la etapa limitante del proceso y en ausencia de prpsc no se produce debido a la alta barrera de energia de activacin. se requiere para bajar la energia de activacion necesaria para producir el cambio conformacional de prpc La reaccin de conversin segn este modelo ocurre mediante un mecanismo similar al de las reacciones catalizadas enzimticamente: 1) Prpc se comporta como sustrato y prpsc es el producto de la reaccin. 2) La velocidad de la reaccin depende de la concentracin del sustrato. 3) Prpsc exogena funciona como un efector alostrico que regula la conversin de prpc en prpsc. 4) la presencia de anlogos del sustrato, por ejemplo molculas de prpc distintas provenientes de distinta especie, puede inhibir la reaccin comportndose como inhibidores competitivos. La reaccin entre una molcula de prpsc con una de prpc da como producto dos molculas de prpsc. Cada una se une a una molcula de prpc con lo cual se obtienen cuatro molculas de prpsc (dos por reaccion) y asi sucesivamente. De esta forma la cantidad de prpsc crece exponencialmente. Modelo de la semilla (seeding model): Segn este modelo, prpc y prpsc se encuentran en equilibrio, con la conformacin prpc favorecida. La forma patolgica prpsc se estabiliza mediante su agregacin. La velocidad de asociacin de las moleculas de prpsc en agregados es muy lenta y esta desfavorecida, pero una vez que se forma un agregado o ncleo este actua como semilla en la polimerizacin con lo cual la velocidad de union de mas moleculas de prpsc aumenta y entonces el sistema es perturbado con lo cual se desplaza el equilibrio hacia la formacin de mas prpsc. Este modelo en principio no explica el aumento exponencial de la concentracin de prpsc que se observa durante una infeccin, pero si se supone que los agregados formados una vez que llegan a cierto tamao se rompen originando nuevos ncleos, entonces el aumento de prpsc puede ser exponencial (68). Ambos modelos justifican las tres variantes que existen de las enfermedades producidas por priones (infecciosas, familiares y espordicas) (32). Las patologas infecciosas seran el resultado de la presencia de Prpsc exgena, que cataliza la conversin de prpc segn el modelo de replegamiento o altera el equilibrio a favor de si misma segn el modelo de polimerizacin nucleada.

En las patologas hereditarias ocurre una desestabilizacin de la estructura de prpc o una estabilizacin de la estructura de prpsc favoreciendo la poblacin del estado patolgico. Por ltimo, las enfermedades espordicas, podran surgir por alteraciones metablicas o bien mutaciones espontneas que conlleven la formacin de prpsc. Las chaperonas celulares pueden intervenir en la conversin de prpc en prpsc tanto en forma positiva como negativa: En diversos estudios se observo que ciertas chaperonas son capaces de favorecer la conversin de prpc en prpsc en presencia de prpsc exogena. En ausencia de chaperonas, la conversion de prpc en prpsc es lenta e ineficiente. In vitro, las chaperonas reconocen y se unen molculas de prpc nativas y desnaturalizadas por ejemplo mediante tratamiento con medio acido, alterando su conformacin, esto facilita el reconocimiento de prpc por parte de prpsc, con lo cual se asocian y la reaccin de conversin ocurre con alta eficiencia. De esta manera, las chaperonas facilitan el primer paso de la reaccin que es la interaccin entre ambas conformaciones del prion (32, 71). En estudios in vitro con prpc marcada radiactivamente, se observ que las chaperonas celulares aumentan la eficiencia de dicho paso lento de reaccin mediante la union a prpc, cuando la chaperona se une a prpc, le produce un cambio conformacional que origina un intermediario de prpc que es proteasa sensible pero puede recuperarse por centrifugacin en forma de agregados en el pellet. El intermediario de prpc es reconocido por prpsc mas que la prpc nativa con lo cual se favorece su conversin en prpsc. En el segundo paso de la reaccin, prpsc produce un cambio conformacional en el intermediario de prpc que entonces se vuelve proteasa resistente y adquiere la conformacin de prpsc. Por otra parte, otras chaperonas interfieren con la reaccin mediante la union a prpc. En este caso, la unin de la chaperona estabiliza una conformacin de prpc que no resulta favorable a la interaccin con prpsc. Esto constituye una especie de sistema de defensa de la celula infectada con prpsc que desfavorece la propagacin de esta, se cree que este es uno de los motivos por los cuales las enfermades de origen prionico presentan tiempos de incubacion tan prolongados. Entre las chaperonas que interfienen con la conversin se encuentra Bip, en cambio, las chaperonas Hsp60 y Hsp104 facilitan la reaccin (38).

La barrera de especies Existe especificidad de especies para la transmisin de priones, lo que se conoce como la barrera de especie, propuesta por Pattison (17, 18,32,72), que se manifiesta como un periodo de incubacin ms prolongado que lo esperado al pasar de una especie a otra. Este efecto se observa an entre especies muy cercanas, esto fue demostrado con ratones y hamsters (18, 73).

La transmisin de priones entre distintas especies es un proceso estocstico. En el caso de ocurrir, este proceso es muy poco eficaz y sucede con una prolongacin del tiempo de incubacin que tras pases subsiguientes, o adaptacin, se acorta y estabiliza y la transmisin deja de ser un proceso probabilstico. Los priones sintetizados de novo reflejan la secuencia del gen PRP del husped. En los primeros estudios al respecto se puso de manifiesto que la barrera de especie era la manifestacin de las restricciones de secuencia de un proceso de reconocimiento molecular. As, la infeccin ocurre a travs de un complejo prpc-prpsc, cuya formacin est gobernada por el grado de identidad de secuencia entre la protena endgena y la exgena. La identidad en el segmento 96-167 es necesaria pero insuficiente la interaccin de prpc con prpsc es ms eficaz cuanto mayor es la identidad de secuencia en la regin 96-167. Se requiere adems la presencia de una proteina adicional que reconoce la region C-terminal de prpc. Dicha proteina es una chaperona, originalmente denominada proteina X. La interaccin de prpc con la chaperona es ms eficiente cuando ambas son de la misma especie (32). La existencia de distintas cepas de priones: Una de las caractersticas de los priones es su multiplicidad, es decir, la existencia de multiples cepas, (tambien denominadas inculos o strains) similar a lo que ocurre con los virus y bacterias. Las cepas se diferencian en el tiempo de incubacin y en los patrones de lesion en el sistema nervioso cuando son inoculados en lineas de raton o hamster estandarizadas (32, 74). En esto se basa un ensayo en animales de laboratorio de valor diagnostico y confirmatorio de TSEs (ver seccion diagnostico). Todas las cepas de prpsc tienen la misma secuencia de aminocidos pero se diferencian en el patron de glicosilacion y en el tamao de los fragmentos que se originan cuando son incubadas con proteasas, esto se debe a que presentan variaciones en su conformacin que hacen que ciertas regiones de la proteina esten ms o menos expuestos a la accion de las proteasas. Las caractersticas propias de cada cepa de prpsc son transferibles a prpc durante la reaccion de cambio conformacional, pues prpc adquiere la conformacion exacta de prpsc. Ademas, para que la conversin ocurra, la secuencia aminoacdica de prpc no solo debe ser lo mas similar posible a la de prpsc segn el postulado de la barrera de especie sino que el patron de glicosilacin tambin debe coincidir (32, 74). El hecho de que las distintas cepas de priones produzcan distintos patrones de lesiones cerebrales permite distinguirlas y tiene valor diagnostico. Mediante anlisis computarizado de imgenes de cortes de tejido se puede distinguir cada cepa, pues el patron de lesiones funciona como un sello de identidad util en el diagnostico (18). Metodos de inactivacion de priones: Muchas de las caractersticas biolgicas de los priones son similares a aquellas correspondientes a los virus. Sin embargo, se distinguen de los mismos debido

a la marcada resistencia que presentan frente a los agentes inactivantes como el calor y las radiaciones. Dicha resistencia frente a la mayora de los agentes inactivantes que se utilizan contra virus y bacterias plantea un grave problema a la hora de decidir qu procedimientos pueden asegurar la destruccin de la infectividad (18).
Caractersticas fsicoqumicas y biolgicas de los priones prpsc:

Propiedades fsico - qumicas: Filtrables (tamao de poro: 0.22 m) No presentan estructuras de partculas (como los virus) definidas al microscopio electrnico Resistentes a: autoclavado, formol, radiaciones, etanol, agua oxigenada, nucleasas, parcialmente resistentes a proteasas. Propiedades biolgicas: Prolongado perodo de incubacin No inducen respuesta inmune en el hospedador infectado Existencia de cepas (strains) Composicin proteica exclusivamente: protena del prin (PrP) Presentan barrera de especie Los procedimientos que logran reducir el ttulo de la infectividad a valores razonables incluyen: hipoclorito de sodio 10% (1hora), hidrxido de sodio 2 M, permanganato de potasio 0,002 M, fenol 90%, autoclavado a 134C, 30 min, cloroformo, ter, acetona y urea 6 M (9,18). Los procedimientos mencionados aseguran la disminucin de la infectividad de materiales contaminados por priones, pero aun asi existen evidencias de que materiales sometidos a una temperatura de 600C, a la cual la materia orgnica ya se ha descompuest, conservan restos de infectividad. Este hecho podra explicarse considerando que debido a la carbonizacin que sufre la materia orgnica a esa temperatura, se podran formar moldes de carbn sobre las molculas de PrPSc y esos moldes inorgnicos seran los que induciran a PrPc a plegarse de manera incorrecta (18).

Aproximaciones experimentales para el estudio de priones:

En un principio, los priones se empezaron a estudiar mediante inoculaciones de material infectado en ovinos, caprinos y monos. El empleo de estos animales

tenia desventajas obvias que impedan el rpido avance en las investigaciones por lo que fue necesario obtener ratones y hamsters transgenicos con los cual surgieron los primeros modelos experimentales de encefalopatias espongiformes. Estos modelos incluyen animales sin el gen que codifica la proteina del prion, animales quimricos y otros que expresan fracciones de Prnp que originan versiones de Prpc truncadas en alguno de sus dominios. En distintas investigaciones se obsero que los ratones desprovistos del gen PRP (y por lo tanto sin Prpc) no podian contraer enfermedades de origen prionico y generaban anticuerpos contra los priones cuando estos eran inoculados. Ademas, como estos ratones eran viables se llego a la conclusin de que Prpc no era una protena esencial , tal vez se trataba de un producto gnico redundante. An asi, diversos estudios demostraron que si bien los animales carentes de Prpc aparentan ser normales, pueden presentar fallas en su ciclo circadiano, algunos cambios leves de comportamiento, problemas de aprendizaje y muy raramente, alteraciones en su desarrollo. Sin embargo, esto podra depender de la cepa de ratn y de condiciones experimentales mas que de la ausencia de prpc . En cuanto a la generacin de anticuerpos anti priones por los ratones sin el gen PRP (denominados ratones Tg 0/0, donde Tg indica transgenico) se debe a que al estar ausente Prpc, no se genera tolerancia inmunolgica frente a esta protena en etapas tempranas del desarrollo, entonces las clulas del sistema inmune al encontrarse con los priones inoculados no los reconoce como propios del organismo y generan una respuesta inmune tpica (en cambio, si el animal expresa Prpc, la tolerancia se establece normalmente y el sistema inmune frente a una infeccin por priones exogenos es incapaz de diferenciarlos de la isoforma celular Prpc) (21).

Modelos de raton empleados en el estudio de los priones: (74)

(Mo)Prn-P +/+ : Ratn (Mo) con ambos genes propios. Los animales infectados con PrPsc enferman tras incubacin corta. (Mo)Prn-P o/+ : Ratn con ablacin de un gen. Los animales infectados enferman tras larga incubacin. (Mo)Prn-P o/o : Ratn desprovisto de ambos genes. Los animales infectados no enferman de EE, pero presentan ataxia a partir de los 490 das de edad Ratn Tg Prn-P Hu/Mo : Ratn transgnico con una quimera del gen Prn-P humano/ratn. Tg(MHu2M)Prn-P :Es una quimera formada por 2 pares de genes: un par ratn/humano y otro par ratn/ratn. Esta quimera es altamente susceptible a priones humanos y presenta un perodo corto de incubacin. Ratn Tg Prn-P SHa/Mo :Quimera hmster sirio/ratn. Inoculada con priones hmster sirios (SHa) produce muchas placas de amiloide, pero no si se inocula con priones de ratn. Con estos Tg tambin se han obtenido priones PrPsc quimricos SHa/Mo.

Ratn Tg(GSS MoPrP : Quimera de gen humano con mutacin que produce la enfermedad de GSS y gen normal de ratn; produjo espontneamente procesos neuro-degenerativos. Ratn Tg mltiple : Quimera con 7 juegos de Prn-P de SHa. En homocigosis el ratn enferma espontneamente despus de 400 a 600 das, y en hemicigosis despus de 650 das.
(Nota sobre la nomenclatura empleada: Mo indica gen de raton (mouse), Ha indica

gen de hamster y Hu indica que la copia del gen es humana).

Para definir el mecanismo por el cual prpsc convierte a prpc en copias de si misma se pueden utilizar diversos mtodos experimentales, entre los que se destacan: Anlisis estructurales de las isoformas prpc y prpsc mediante tcnicas de espectroscopia NMR, cristalografia de rayos x , (8,72,75). Ensayos de unin mediante la tcnica de surface plasmon resonance. Sistemas in vitro con pptidos del prion purificados y prpc, con los cuales se realiza la conversin de prpc en prpsc in vitro. En estos modelos se varian parmetros tales como por ejemplo la secuencia del pptido y sirvieron para encontrar las regiones de prpsc responsables del cambio conformacional (21). Tambin se utilizan mucho tcnicas tipicas de biologa celular como por ejemplo tcnicas de marcado metablico, cultivos celulares y fraccionamiento subcelular entre otras tcnicas para determinar cual es la va de biosntesis de prpc, ubicacin dentro de la celula, procesamiento posttraduccional. Este abordaje tiene la ventaja de que permite estudiar los priones dentro del contexto fisiolgico normal, en presencia de protena nativa y los cofactores necesarios para la reaccion de conversin. Lneas celulares empleadas comunmente en la investigacion de los priones: Se desarrollaron diversas lneas celulares derivadas de neuronas para el estudio de los priones. Entre estas se destaca la linea N2A derivada de clulas de neuroblastoma de ratn, que es una de las ms utilizadas (21). Otras lineas son: la PC12 de feocromocitoma de rata (76), HaB de hamster (clulas inmortalizadas espontneamente), celulas GT1 (neuronas hipotalamicas ) (77) Todas estas lineas producen continuamente prpsc luego de ser infectadas y si bien en general no muestran signos patolgicos, las clulas GT1 infectadas pueden entrar en apoptosis (77) y las N2A infectadas presentan alteraciones en la fluidez de la membrana y en la respuesta a bradikinina siendo por lo demas viables (21, 78). Actualmente se dispone de lneas celulares que expresan genes PRP con cualquiera de las mutaciones conocidas que producen enfermedad por priones en humanos, ratones y hamsters.

Enfermedades causadas por priones: Las encefalopatias espongiformes Las encefalopatias espongiformes transmisibles (TSEs), son enfermedades neurodegenerativas fatales, con periodo de incubacin lento, pueden tardar aos o decadas en manifestar sintomas, y actualmente no tienen tratamiento. Se producen debido a la acumulacin de priones prp (especficamente la conformacin prpsc de dicho prion) en el sistema nervioso. Esto desencadena la muerte neuronal por apoptosis. Este tipo de enfermedad incluye la enfermedad de Creutzfeldt- Jacob (CJD), el sndrome de Gerstmann-Strausler (GSS), el insomnio fatal (FFI) y el kuru entre las que afectan a los humanos, pero se conocen muchas ms que son propias de otras especies animales (Tabla 1), como por ejemplo la enfermedad del cansancio crnico de los cervidos, el scrapie del ganado ovino y la renombrada encefalopatia espongiforme bovina (BSE), tambien conocida como el mal de la vaca loca. Esta ltima tiene una variante surgida recientemente que es capaz de infectar al ser humano dando los que se conoce como nueva variante de CJD y se cree que la via de transmisin es a traves de carne vacuna contaminada con el prion de la BSE. El conocimiento del origen infeccioso de las TSEs tiene larga data: En 1939 se logro transmitir el scrapie a cabras mediante inyeccin intraocular (74,79). En 1950, Carleton Gajdusek describio el kuru, que es endmico de una tribu de Nueva Guinea y se transmite entre los miembros de la misma a traves del canibalismo ritual. Posteriormente el veterinario William Hadlow noto las similitud neuropatologica entre el kuru y el scrapie. En trabajos siguientes se demostro que el kuru y el CJD son transmisibles a primates. Estos trabajos despejaron toda duda acerca de la naturaleza infecciosa de estas enfermedades (21, 74). A principios de los aos 80, Stanley Prusiner propuso la hiptesis del prion (72), esta establece que el agente infeccioso responsable de las encefalopatias espongiformes esta compuesto exclusivamente por un nico tipo de protena a la cual denomin prion y actualmente se la conoce en la literatura como prpsc (por proteina del prion del scrapie) En trabajos posteriores se demostr que prpsc es una versin alterada de una proteina celular normal, codificada por el hospedador, prpc (por proteina del prion celular) y que ademas es una proteina altamente conservada que se encuentra en todas las especies analizadas hasta la actualidad. Actualmente se sabe que prpsc propaga su conformacin entre las molculas de prpc con lo cual todas quedan con la misma conformacin que prpsc. La reaccion es autocatalitica. Asi, los priones presentan un novedoso sistema de propagacin que contradice el dogma central de la biologa pues se trata de transmisin de informacin a traves de los cambios conformacionales de una proteina y no a traves de un acido nucleico.

Por otra parte, las enfermedades producidas por los priones son nicas porque pueden ser tanto de origen genetico (debido a mutaciones en el gen PRP en la linea germinal ), espordico (por mutacin somatica al azar no determinada) o transmisible. Son las nicas enfermedades conocidas que pueden ser a la vez geneticas (familiar) e infecciosas (80,81). Dado que el agente que las produce tiene la misma secuencia de aa que prpc, en estas enfermedades no aparecen procesos inflamatorios ni respuesta del sistema inmune (82). En terminos generales, los sntomas que presentan son demencia, disfuncin motora, ataxia cerebelar, disautonomia y en el caso particular del FFI aparece insomnio progresivo. Dichos sntomas aparecen luego de un periodo largo de aos a decadas luego de la exposicin inicial al patgeno. En el caso del kuru, FFI y CJD aparecen a edades avanzadas, en general a partir de los 50 aos de edad, luego de dcadas de incubacin, aunque vCJD se manifiesta a edades trempranas, en la juventud. Por otra parte, GSS solo tiene unos 10-12 aos de incubacin antes de que los sntomas comiencen a manifestarse (80). Por otra parte, en cortes de tejido nervioso se observa espongiosis junto con atrofia del tejido nervioso por perdida neuronal asi como tambin deposicin de placas de tipo amiloide, stas son ms prominentes en el GSS y el Kuru y se asemejan a la amiloidosis producida en la enfermedad de Alzheimer, que tambin es producida por una protena con plegamiento anomalo (80). Existe evidencia de que vCJD se origin a partir de la transmisin del prion de la BSE a humanos a partir de carne contaminada. Adems, el prion de la BSE seria de origen ovino, derivado del prion causante del scrapie del ganado ovino, este habra cruzado la barrera de especie alrededor de 1986 cuando se comenzo a alimentar al ganado con harinas de hueso y carne proveniente de ovinos infectados de scrapie. Hacia 1988 la epidemia resultante de BSE fue suprimida cuando se interrumpio esta practica, pero en 1996 hubo otra epidemia por el mismo motivo y a demas aparecieron los primeros casos en humanos (vCJD) (66). Ademas se conocen otra va de trasmisin de CJD aparte de la oral que es la via iatrognica a traves de inyecciones de hormona de crecimiento obtenida de pituitaria, transplantes de cornea, intrumentos quirrgicos, etc, pues los priones son bastante resistentes a los mtodos de esterilizacin (83,84). Se estima que el 10 % de los casos de CJD y todos los de GSS y FFI se deben a mutaciones en la linea germinal en el gen PRP en el cromosoma 20 (17). Dichas mutaciones favorecen el cambio espontaneo de conformacin de prpc a la forma patognica prpsc sin necesidad de que exista infeccin con prpsc exogena. Mutaciones puntuales en el extremo C-terminal de prpc estn asociadas a la aparicion de FFI, CJD y GSS. Por otra parte, mutaciones de insercin en el extremo N-terminal estan asociadas a la aparicion de CJD y ademas consisten en la repeticin de un octapptido presente en la protena (1 a 9 copias del mismo). Dicho octapptido es normal que este repetido solo 5 veces. Existe un polimorfismo en el codon 129 del gen PRP, este codon puede codificar metionina o valina y esto tiene influencia en el fenotipo de la enfermedasd inducida por mutaciones en otras posiciones (17). Adems, se puede transmitir una encefalopatia espongiforme de tipo familiar (es decir de

origen gentico producida por mutacin de PRP) a animales de laboratorio, por ejemplo por inyeccin intracerebral, en nervios perifricos e inoculacin oral de preparaciones homogeneizadas de tejido del indiviuo que padece la TSE familiar, y esto demuestra que en estas enfermedades genticas se forman particulas de prion infectivo prpsc. Por otra parte, en las variantes espordicas de estas enfermedades existe una conversin espontnea de prpc a prpsc, segn se cree esto ocurre en ausencia de mutaciones en el gen y en ausencia de prpsc exogena (74). Algunas investigaciones sugieren que en realidad podria haber alguna mutacin somatica no detectada que favorece la conversin de prpc a prpsc, en el tejido con dicha mutacin, o que podria tratarse de mutaciones en algun gen que codifica para una protena que interactua con prpc afectando su conformacin, por ejemplo una chaperona. Otra posibilidad es el cambio espontaneo de prpc normales a la forma infecciosa en respuesta a algun cambio en el ambiente celular (por ejemplo alteraciones producidas por otras patologas) que afecte su conformacin.
Principales lesiones que aparecen en el sistema nervioso Deposicin de amiloides:

En muchas encefalopatas espongiformes se observan en las neuronas mediante la coloracin con rojo congo particulas con forma de baston similares a los amiloides. Al microscopio electrnico se observan como fibrillas conocidas como SAF (fibrillas asociadas a scrapie) y tambien como prion rods. Las partculas SAF se deben a la agregacin de molculas de Prpsc formando amiloides (85). Los amiloides son agregados proteicos en forma de fibrillas de unos 100 A de dimetro compuestos por proteinas con conformacin de laminas planas. En las TSEs estan compuestos por prpsc. Son insolubles y bastante resistentes a proteasas. Se tien intensamente con colorantes como el rojo congo y se acumulan en el exterior celular como consecuencia de la muerte celular por apoptosis. Estos complejos son tpicos de enfermedades neurodegenerativas tales como el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, aparecen tambien en las enfermedades causadas por priones. Ademas existen amiloidosis hereditarias, en las cuales se forman amiloides debido a la mutacin en alguna protena que entonces adquiere una conformacin que favorece su agregacion con ms molculas de si misma (81). Los amiloides no aparecen solo en el sistema nervioso de los mamferos y otros vertebrados sino que seran bastante comunes entre los organismos eucariotas en general. Los priones de S.cerevisiae tambien los producen.

Espongiosis

Se manifiesta tanto en la sustancia gris como en la sustancia blanca del sistema nervioso central. Consiste en una intensa vacuolizacin del citoplasma de las neuronas, quedando el ncleo y otras organelas en la periferia celular . Es decir, se trata de la formacin de vacuolas intracelulares y no extracelulares como originalmente se penso (estas aparecen en preparados de tejido nervioso pero constituyen un artefacto producido por el tratamiento de fijacin) (66). La vacuolizacion que se observa en las TSEs esta relacionada con la sobreeexpresin de acuoporinas 1 y 4 que producen el incremento del contenido de agua intraneuronal (86). Otra lesin que puede observarse es la astrogliosis, que se puede detectar mediante la coloracin de Nissl y Cajal. La astrogliosis es la hiperplasia e hipertrofia de los astrocitos en respuesta a daos en el sistema nervioso y uno de los marcadores bioqumicos de la misma es la presencia de alta concentracin de la proteina glial acidica (GFAP) (87). Tabla1. Enfermedades producidas por priones en humanos Enfermedad KURU Creutzfeld-Jacob esporadica (sCJD) CJD iatrogenica (iCJD) Mecanismo de patogenesis Puede aparecer por mutacin somatica, tambien transmitirse en forma infecciosa (canibalismo) Aparece por mutacin somatica al azar Infeccioso, a traves de instrumentos quirrgicos y jeringas infectados, tambien material biologico, por ejemplo tratamientos con hormona del crecimiento Genetica, hereditaria, es potencialmente transmisible en forma infecciosa. Infeccion por medio de alimentos contaminados con prion BSE Hereditaria, potencialmente infecciosa

CJD familiar (fCJD) CJD variante y nueva variante (vCJD, nvCJD) Sndrome de GerstmanStraussler-Scheinker (GSS) Insomnio fatal familiar (FFI) FFI esporadico Sindrome de Alpers

Hereditaria Mutacion genetica al azar Mutacion genetica al azar

Tabla 2. Enfermedades producidas por priones en animales.

Enfermedad Scrapie

Hospedador Ganado ovino y caprino

Encefalopatia

Ganado bovino

Mecanismo de patogenesis Puede ser genetica, esporadica por mutacion al azar y tambien infecciosa (ingesta de pasto contaminado, de las madres a las crias, etc) Infeccioso, por ingesta de alimentos

espongiforme bovina (BSE) Encefalopatia Visones de espongiforme del criadero vison Encefalopatia de antilopes ungulados exoticos Enfermedad del cansancio cronico (CWD) Encefalopatia espongiforme felina Renos

contaminados con el prion del scrapie Infecciosa por ingesta de alimentos contaminados con scrapie y transmisible por mordeduras. Infecciosa por alimentos contaminados con priones de la BSE. Infeccioso

gatos

Infeccioso por ingesta de alimentos contaminados con BSE.

A continuacin se describe brevemente cada una de estas enfermedades:

Enfermedades causadas por priones en humanos

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob es una enfermedad neurodegenerativa fatal de incidencia muy baja en la poblacin (aproximadamente 1 individuo en 1 millon). La forma tipica de esta enfermedad afecta generalmente individuos con edades de entre 50 y 75 aos y se caracteriza por la presencia de espongiosis en la corteza cerebral y en el cerebelo, acompaado de gliosis marcada y deposicin de amiloides formados por prpsc. Recientemente se descubrio otra variante de la enfermedad que fue denominada nvCJD (new variant CJD) que se caracteriza por afectar a individuos mas jvenes y se transmite por el consumo de carne contaminada con el prion de la encefalopatia espongiforme bovina. Esta variante fue la causante de una gran cantidad de casos en personas que consumieron carne de vacunos infectados en Europa en la decada del noventa y tuvo amplia repercusin en los medios. La vCJD presenta un cuadro clinico algo distinto al del CJD clsico, con vacuolizacin en los ganglios basales, marcada astrocitosis en el talamo, y amiloides rodeados por vacuolas (74). La forma clsica de la enfermedad puede presentarse en tres formas distintas (que tambien estan presentes en todas las demas enfermedades producidas pro priones): Espordica : aparece por mutacin somatica en el gen PRP o por cambio de conformacin espontaneo de prpc. Iatrognica: esta forma de la enfermedad se contrae por contaminacin con priones de material quirrgico, endoscopios, electrodos cerebrales ,etc y tambien aparece por utilizacin de hormona de crecimiento extraida de cadveres contaminada, transplantes de cornea, transplantes de dura madre entre otros.

Familiar: aparece por mutaciones en el gen PRP que se transmiten de generacin en generacin. Infecciosa: esta forma, entre humanos no ocurre pues seria necesario el canibalismo como en el caso del kuru para que exista la transmisin. Se demostro su existencia mediante inoculacin en animales de laboratorio (lo mismo se observ con las demas TSEs). Entre los sntomas de todas las variantes de la CJD se incluyen una rpida y progresiva demencia, disfuncin motora y alteraciones en el patrn electroencefalografico (88). Esta enfermedad fue descripta por primera vez por H.G. Creutzfeldt en 1920 a partir de un paciente con sntomas atpicos con respecto a las enfermedades conocidas hasta esa epoca. En 1921, el neurlogo A. Jacob describio 4 casos, dos de ellos con caractersticas tipicas de la CJD (88). El nombre de esta encefalopatia deriva del de estos dos investigadores. La forma familiar de la CJD se conoce desde hace bastantes aos y se sabe que hay varias mutaciones en el gen PRP que codifica la proteina Prp capaces de producir CJD. Otras mutaciones en este gen se encuentran asociadas a la enfermedad GSS y al insomnio fatal. Las mutaciones de PRP se heredan en forma dominante (88). Enfermedad del insomnio fatal familiar (FFI) Se trata de una enfermedad gentica autosmica dominante, causada por mutaciones en el gen PRP, precisamente debido a la sustitucion de un ac aspartico por asparagina en la posicin 178 de la protena (17,89). La misma mutacin esta asociada tambien a algunas formas de CJD familiar, sin embargo la diferencia entre ambas entidades radica en un polimorfismo metionina/valina en el codon 129. Los individuos heterocigotas presentan una tiempo de evolucin mas prolongado que los homocigotas para metionina (19). La enfermedad se caracteriza por una importante atrofia del tlamo. Las lesiones neuropatolgicas de FFI incluyen astrogliosis, principalmente a nivel de las regiones ventral anterior y dorsal media del tlamo (18,89). Entre los sntomas se puede destacar la aparicin de insomnio progresivo acompaado de perdida de las capacidades cognitivas (19). Sndrome de Gerstmann - Strussler - Scheinker (GSS) La enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker es mucho menos frecuente que la CJD con una incidencia estimada en 2 casos por cien millones de habitantes. Los sintomas suelen aparecer entre la tercera y sexta dcada de vida en forma de un cuadro atxico de curso progresivo al que se aade de forma tarda un deterioro cognoscitivo. La duracin de la enfermedad oscila entre 1 y 10 aos (19).

A nivel histologico se caracteriza por la presencia de espongiosis y de gran nmero de placas amiloides, muy notorias en el cerebelo (90,91,92). El GSS fue transferido a primates y roedores por inoculacin intracerebral, y a hamster por insercin del gen anormal PRP en el genoma del animal. (91,92) Kuru: Enfermedad confinada a varios valles adyacentes del interior montaoso de Nueva Guinea, donde afecta a unas 160 aldeas indgenas. Fue descrita por primera vez en 1957, por V. Zigas y C. Gajdusek. En aquella poca, el kuru afectaba de forma epidmica a la tribu de los Fore, transmitindose por medio del canibalismo ritual que sta tribu llevaba a cabo. As, con la desaparicin del canibalismo en Nueva Guinea, el Kuru ha experimentado un descenso progresivo (90,91,92,93). Los principales sntomas del kuru son ataxia cerebelar, prdida de coordinacin, temblores (escalofrios que evolucionan hasta una completa incapacidad motora), congestin de los vasos sanguneos, atrofia cortical y, posteriormente, demencia (90,91,92,93). El periodo de incubacin puede superar los 30 aos, sin embargo, la muerte se suele producir en menos de 2 aos a partir de la aparicin de los primeros sntomas. Sndrome de Alpers Es una enfermedad crnica neurodegenerativa similar a la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob pero con la diferencia de ademas de los tipicos signos neuronales, tambien produce degeneracin en el higado. Solo afecta a nios y recien nacidos, con una bajisima frecuencia en la poblacin. (90). El sndrome de Alpers puede ser transmitido experimentalmente a hamsters por inoculacin intracerebral, pero no a oras especies. (90).

Enfermedades producidas por priones en animales:

Enfermedad del Scrapie Esta enfermedad se conoce desde el siglo XVIII. Actualmente se encuentra ampliamente extendida en Europa, Asia y Amrica siendo la encefalopatia espongiforme mas comun. Es una enfermedad neurodegenerativa del sistema nervioso propia del ganado ovino. En 1938 fue demostrado su carcter tranmisible en experimentos de J. Cuill y P.L. Chelle quienes inocularon con scrapie de animales enfermos a cabras sanas, que luego desarrollaron la enfermedad.

En 1939, el veterinario norteamericano W.J. Hadlow seal la similitud que existe entre el Scrapie y una enfermedad humana neurodegenerativa (el Kuru). A principios de los aos cincuenta se hizo patente la naturaleza atpica del supuesto patgeno por su extraordinaria resistencia a agentes fisicoqumicos que normalmente inactivan a los virus. En esta poca se constat la diferente susceptibilidad al scrapie entre distintas razas de ovejas y en 1965 se estableci el concepto de la barrera interespecfica en la transmisin del scrapie. A partir de entonces se puso en duda la existencia de un cido nucleico especfico .proponindose la asociacin del scrapie con una pequea protena bsica y especulndose sobre la posible replicacin de las protenas. Finalmente, en 1982 Prusiner propuso la hiptesis del prion como una partcula infecciosa de naturaleza proteica responsable del scrapie (74). Los signos clnicos ms significativos del scrapie son temblores y un fuerte prurito que conduce a los animales a rascarse (de donde proviene el nombre de la enfermedad). A nivel histologico la enfermedad presenta astrogliosis, intensa vacuolizacin intracelular y prdida neuronal (94). El prion causante del scrapie se puede transmitir a la descendencia del animal afectado a traves de la placenta asi como tambien a otros ovinos a travs del contacto con pasturas contaminadas con el prion. Los sntomas de la enfermedad aparecen normalmente entre los 2 y 5 aos de edad. Los animales infectados mueren alrededor de seis meses despus de la aparicion de los sintomas clinicos.(74) Encefalopata espongiforme bovina (BSE) Tambien conocida como enfermedad de las vacas locas, es una enfermedad bastante reciente. Surgio en el Reino Unido en al decada del 80 , desde donde se extendio a otros paises europeos. Se origino debido al uso de harinas fabricadas con restos de ovejas presumiblemente infectadas con scrapie (66). Los animales infectados desarrollan transtornos en la locomocin y en el comportamiento tales como posturas anormales, agresividad, nerviosismo, dificultad para alimentarse e incorporarse (66). En la BSE aparece vacuolizacin bilateral simtrica en el tronco enceflico(74). Encefalopata Espongiforme Felina (FSE) Fue diagnosticada por primera vez en 1990 en un gato domstico y a partir de entonces se encontraron numerosos casos en estos animales, principalmente en el Reino Unido. Se cree que esta encefalopatia espongiforme es una enfermedad nueva que se origin en los felinos a partir del prion de la enfermedad de las vacas locas contaminante de los alimentos balanceados para mascotas. Esto es coherente con el hecho de que los primeros casos aparecieron en plena expansion de la epidemia de BSE en el ganado vacuno y

ademas, en estudios histologicos de los animales muertos por la enfermedad se observaron los signos tipicos de la encefalopatia causada por el prion de la BSE (66).

Sndrome del cansancio crnico (CWD) El CWD (chronic wasting disease) afecta animales salvajes de la familia de los cervidos , especialmente alces y renos, pero tambien aparece en antlopes. Los animales afectados permanecen postrados, con incordinacion de los movimientos, dejan de alimentarse y finalmente mueren (90). Encefalopatia transmisible del vison (TME) Es similar a la BSE y al CWD, se descubrio en criaderos de visones destinados a la industria peletera. Una hiptesis sobre su origen sugiere que aparecio en estos animales de una manera similar al de la epidemia de BSE, por el consumo de alimento contaminado con priones del scrapie o de la BSE (74,90).

Diagnostico de las TSEs

El mtodo ms seguro para el diagnstico de una enfermedad prinica consiste en la deteccin inequvoca de la protena PrPSC por lo que las tcnicas basadas en la utilizacin de anticuerpos especificos, (principalmente Western blot e inmunohistoquimica) , son las mas empleadas en el diagnostico. Actualmente se dispone de anticuerpos monoclonales que distinguen entre prpsc y prpc (94). El diagnostico postmortem de TSEs se puede realizar por la tcnica de Western blot con anticuerpos que reconocen prpsc (96). Para esto, se obtienen muestras de tejido cerebral, se homogenizan y luego se trata con proteinasa K, que degrada cualquier protena que no sea prpsc, que es proteasa resistente. A continuacin se realiza una extraccin de protenas y la fraccin proteica se corre en un gel de poliacrilamida. Las bandas del gel se transfieren a una membrana de nitrocelulosa donde se revela la presencia de prpsc mediante anticuerpos especficos comerciales. En este ensayo se basa un test comercial muy utilizado para la deteccin de TSE en animales denominado test Prionics. Este test emplea muestras de tejido cerebral de animales enfermos, de animales clnicamente sanos y de otros con enfermedades neurolgicas no relacionadas con los priones y la mayor desventaja que presenta es que su sensibilidad no es suficientemente alta como para detectar las isoformas patolgicas en muestras de animales vivos, por lo que nicamente se pueden analizar muestras de cerebro tras el sacrificio. Otros tests que se estn empleando en la actualidad tambien se basan en la resistencia a proteasas que presentan los agregados de prpsc y en la deteccin con tcnicas de Western blots de las formas resistentes (94,95). Tambin se puede detectar PrPcs en secciones de tejido embebido en parafina y fijado con formalina. Para revelar la presencia de prpsc se pueden emplear

diversos pretratamientos. Uno de los ms simples y efectivos para la tincin de la protena, y tambien de agregados amiloides, es el tratamiento con 90% de cido frmico en secciones deparafinizadas . Ademas, se puede utilizar microscopia electrnica para detectar fibrillas asociadas a scrapie (SAF) por microscopia electrnica que permiten diagnosticar el scrapie (96). Los resultados obtenidos mediante las tcnicas anteriores son validados mediante el bioensayo del homogenato cerebral que supuestamente posee priones en ratn. Esta tcnica permite identificar la cepa de prion presente en el homogenato, pues estan estandarizadas (96). Existen diversas lneas de ratn que expresan distintas cepas de prpc y debido a la existencia de la barrera de especies y al reconocimiento entre cepas, los priones de la muestra solo produciran enfermedad en el ratn si pertenecen a la misma cepa que la prpc expresada en el sistema nervioso del animal. Tambin se pueden diagnosticar TSEs mediante el anlisis de lquido cefalorraqudeo para determinar la presencia de protenas marcadoras de estas enfermedades, esto es, proteinas cuya expresin esta alterada en estas enfermedades pero no en otras. Uno de los marcadores mas utilizados es la proteina 14-3-3 (94,95). La familia de protenas 14-3-3 est compuesta por 7 isoformas. Fueron descubiertas en 1967 tras un estudio intensivo de protenas de cerebro bovino y recibieron esta nomenclatura, que todava se mantiene, por sus perfiles de elusin cromatogrfica y de movilidad electrofortica. Son protenas de distribucin ubicuas, se encuentran en todos los tejidos de todos los organismos eucariticos estudiados y estn implicadas en la regulacin del ciclo celular y de la apoptosis mediante su unin a motivos estructurales de protenas reguladoras especficas. La presencia de la protena 14-3-3 en lquido cefalorraqudeo permite discriminar TSEs de otras enfermedades neurolgicas pues su expresin esta aumentada en ls encefalopatias espongiformes. Aun asi, hay casos en los que el diagnostico de una TSE mediante este marcador no es definitivo pues al tratarse de una protena que se expresa en muchos tipos celulares en el sistema nervioso, puede ser liberada al liquido cefalorraquideo en enfermedades infecciosas que producen muerte celular, por ejemplo meningitis bacterianas (94,95).

Aspectos terapeuticos:
Actualmente no existe ningn tratamiento para las TSEs y se estn realizando numerosas investigaciones enfocadas al diseo de frmacos para evitar la formacin de la isoforma prpsc o para facilitar su eliminacin. Probablemente, los avances en el estudio de enfermedades como el Alzheimer favorezca el desarrollo de frmacos efectivos frente a los priones. No hay que olvidar que ambos tipos de enfermedad afectan al sistema nervioso y producen agregados amiloides en las neuronas.

Entre los compuestos ensayados para el diseo de frmacos contra los priones se encuentra el colorante rojo congo, un pentosan sulfato. Se sabe que bloquea la formacin de amiloides, pero es toxico para las celulas por lo que habra que encontrar algun otro pentosan sulfato que no lo sea. De todos modos, no es capaz de bloquear la accion de prpsc una vez que la enfermedad esta avanzada. Aparentemente solo es eficaz si se lo administra a ratones al mismo tiempo que se los infecta con el prion (97). Una alternativa son las antraciclinas como la doxorrubicina y sus derivados. Para demostrar su eficacia se realizaron ensayos en hamsters a los que se les administraba simultneamente el frmaco y homogenatos de cerebro de ratones infectados con PrPSC. En estos estudios se encontro que se retrasa la aparicin de los sntomas clnicos de la enfermedad y se prolonga significativamente el periodo de supervivencia de los ratones. Adems, el derivado 4-iodo-4desoxi- doxorrubicina bloquea la formacin de amiloides in vitro (97). Algunos tetrapirroles ciclicos inhiben la formacin de prpsc in vitro y al ser ensayados in vivo en ratones infectados con prpsc la supervivencia se incrementa entre el 50% y el 300% . Estos compuestos estabilizan la conformacin normal de prpc (impiden su cambio conformacional en presencia de ppsc) por lo que seran buenos candidatos para el diseo de terapias contra las TSEs (99). Otro enfoque experimental consiste en disminuir los efectos negativos de la deplecin de prpc producida por accion de prpsc que le cambia su conformacin volvindola no funcional. Uno de los frmacos que podria ser util para esto es la flupirtina, un analgsico no opioide (94,95). In vitro tiene un fuerte efecto protector de neuronas infectadas con PrPSC porque incrementa los niveles intracelulares de la protena antiapopttica Bcl-1 y del antioxidante glutation (94,95). Otros compuestos analizados son los Glicanos polianinicos y sulfato de dextrano, que estimulan la endocitosis de prpc evitando que tenga acceso a prpsc (74). Probablemente el mejor enfoque teraputico consista en el bloqueo de la interaccin entre prpc y prpsc mediante el empleo de algun frmaco que interfiera con dicha interaccin, por ejemplo se podran disear alguno frmaco que mimetice a prpc de manera tal que prpsc tenga mas afinidad por el frmaco que por la verdadera prpc. Con respecto a esto, en un estudio con ratones que expresan prpc fusionada a un fragmento Fc de inmunoglobulina (prpc soluble dimerica) se vio que la protena de fusin inhiba la replicacin de prpsc evitndose asi la enfermedad. Dicha protena funcionaba como un receptor de prpsc que era capaz de unirse a esta pero resultaba resistente al cambio conformacional con lo cual prpsc no podia propagarse (100).

Mecanismos de patogenesis de prpsc

La patognesis de los priones es un proceso complejo que puede dividirse en las siguientes 4 fases que son: infeccin, replicacin en los tejidos perifricos, transmigracion desde los tejidos perifricos al sistema nervioso central y neurodegeneracin.

Infeccin y replicacin en los tejidos perifricos: Entrada por via oral y transporte al sistema nervioso central: El evento clave en la patognesis de los priones es la conversin de prpc en copias de la isoforma patgena prpsc que como ya indiqu anteriormente, es proteasa resistente. En rasgos generales, la entrada de prpsc por via oral es capaz de iniciar la reaccin de cambio conformacional, convirtiendo las molculas de prpc intestinales en mas prpsc, que invade entonces los nervios perifricos cercanos, que tambin expresan prpc, con lo cual se va propagando hasta que llega al sistema nervioso central. Este transporte es muy lento y depende de la cantidad inicial de prpsc que llega a las terminaciones nerviosas y de la expresin de prpc. Ademas no es el unico mecanismo existente: tambien se ha propuesto transporte a traves de los vasos sanguneos mediante unin a proteinas plasmticas e infeccin de celulas por contacto directo. El hecho de que prpsc es resistente a proteasas favorece la infeccin por via gastrointestinal, pues queda protegida de la degradacin por enzimas digestivas. En modelos murinos de TSEs se detecta la presencia de prpsc en el sistema nervioso entrico (SNE) luego de la inoculacin oral de los priones, esto constituye evidencia a favor de un mecanismo de entrada del patgeno por via oral seguida de transporte a las terminaciones nerviosas del intestino (101). Diversos estudios indican acerca de posibles receptores para prpsc en la mucosa intestinal y aparentemente el principal seria el precursor del receptor de laminina de 37 kD (102), este receptor se incorpora al receptor maduro que tiene 37kD y a partir de estudios de inmunohistoquimica con anticuerpos monoclonales en secciones de tejido en parafina se descubrio que se expresa en el ribete en cepillo del intestino delgado en humanos (103).

A partir del empleo de anticuerpos contra prpc en secciones de biopsias de tejido intestinal se demostro que prpc colocaliza con los filamentos proteicos neurales de las fibras nerviosas entericas (104). Experimentos de hibridacin in situ confirmaron la presencia del mRNA de prpc en celulas gliales de los ganglios entericos. Las terminaciones nerviosas del sistema nervioso enterico que expresan prpc se encuentran asociadas ntimamente a las celulas epiteliales del intestino. El receptor de laminina de 37 Kda se expresa en

dichas celulas, ademas solo una capa epitelial delgada separa a las molculas de prpsc en el lumen intestinal de las terminaciones nerviosas (102). Un modelo que explica como llega el prion al sistema nervioso postula que luego de la ingestin, prpsc llega al epitelio intestinal donde entra en las clulas a traves de endocitosis mediada por el precursor del receptor de laminina de 37 kD. Una vez internalizada, prpsc convierte prpc en mas prpsc, y es transportada al sistema nervioso entrico, esto involucra transportes celulacelula. Las molculas de prpsc en el intestino ingresarian en primer lugar a las clulas M intestinales que son clulas del epitelio de las placas de Peyer cuya funcin es la presentacin de antgenos a los linfocitos y otras clulas inmunes. Los antigenos los obtienen del lumen del intestino y los incorporan mediante el mecanismo de transcitosis. En experimentos con lineas celulares de clulas M creciendo en monocapa junto a una lnea celular de epitelio intestinal (caco-2), se observa transporte activo depeniente de la temperatura de bolitas de latex conjugadas a FITC con priones infectivos (105). Como resultado se encontro que el prion es transportado a traves de la monocapa celular. Por otra parte, no se observa transporte de priones en cultivos de celulas caco-2 en ausencia de celulas M. La transcitosis dependiente de celulas M permite a los priones acceder a celulas inmunologicas, en especial celulas dendrticas. Estas forman una capa celular densa en las placas de peyer en regiones que estan en intimo contacto con el epitelio asociado que contiene las celulas M. De esta manera, las clulas dendrticas pueden infectarse con prpsc proveniente de las clulas M. De hecho, clulas dendrticas in vitro pueden adquirir prpsc y como existen subpoblaciones de estas clulas que son migratorias, pueden propagar el prion adquirido a traves del tejido linftico (106). Ademas, el uptake de prpsc en el lumen del intestino esta restringido a estas clulas y no se encuentra prpsc en otras clulas inmunologicas. Las celulas dendriticas foliculares expresan prpc y esto las hace criticas para la replicacin del prion en el tejido linfoide y posterior neuroinvasion ya que se necesita prpc para poder obtener mas copias de prpsc. La prdida temporal de la diferenciacion de estas celulas mediante expresin de una proteina de fusion que consiste en una inmunoglobulina fusionada al receptor B de linfotoxina (LTB R- ig) antes de la inoculacin intraperitoneal de scrapie en ratones bloquea la acumulacin temprana de infectividad en el bazo y reduce la susceptibilidad a la enfermedad. Adems, el tratamiento con LTBR-Ig luego de la inoculacin oral de scrapie bloquea la acumulacin de prpsc en las placas de peyer y ndulos linfticos mesentericos, evitando la neuroinvasion (82,107).

Transporte al sistema nervioso y mecanismos de neurodegeneracion:

Prpsc llega al sistema nervioso central a traves de la migracin desde organos perifericos en especial el bazo, intestino y sistema linfoide y tambien a traves de su propagacin por los nervios perifricos (107), en forma similar a la propagacin de virus herpes, es decir, avance a traves de la infeccion de terminaciones nerviosas y avance a traves del nervio a medida que se va

replicando utilizando para esto las molculas de prpc que encuentra a su paso. Este proceso es muy lento y tendra relacin con el periodo de incubacion de las TSEs (66). La propagacin de prpsc por los tejidos perifricos tambin ocurre a traves de la infeccin sucesiva de las clulas que expresan prpc que encuentra a su paso (clulas nerviosas, linfocitos B, clulas dendrticas foliculares, keratinocitos, etc.) el prion es capaz de pasar de clula a clula. No se sabe bien como ocurre esto. Probablemente el mecanismo implicado sea el de endocitosis mediada por receptor de molculas de prpsc liberadas al espacio intercelular, otra posibilidad es que prpsc aproveche algunos de los transportadores existentes como por ejemplo los Gap junctions que comunican directamente celulas entre si. La expresin de prpc en la celula blanco de prpsc es absolutamente necesaria para que exista infeccin. Un sitio de replicacion y acumulacion de prpsc es el bazo y tejido linfoide asociado (82). Las clulas dendrticas son muy importantes para la replicacin de prpsc. En cambio, los linfocitos T no estan involucrados. La timectomia no altera el tiempo de incubacin de una TSE y ratones deficientes en celulas T no son menos suceptibles a las TSEs ni a la acumulacion de prpsc en tejidos perifericos (82). La deficiencia de celulas B interfiere con la replicacin de prpsc en el bazo y con la neuroinvacin. Evidentemente dichas celulas transportan prpsc largas distancias y de esta manera es ms probable que llegue ms rpido al sistema nervioso, acortandose el tiempo de incubacin, que de por si es prolongado an en presencia de esas clulas pero mucho ms en su ausencia. De todos modos, las clulas dendrticas foliculares son las ms importantes para la replicacin de prpsc de todas las celulas inmunes (82). En cuanto a los macrfagos, contribuyen a inhibir la replicacion de prpsc en los tejidos endocitando clulas infectadas en los tejidos perifericos, en especial linfocitos Se puede detectar prpsc dentro de los lisosomas de los macrfagos, donde queda secuestrada y asi se retarda el tiempo de incubacion (82). Por otra parte, es necesario tener en cuenta que la entrada del rprion no siempre ocurre por via oral, tambin puede transmitirse por cualquier otra va que involucre un dao al organismo combinado con exposicin al prion, por ejemplo se conoce la transmisin denominada iatrognica, a travs de instrumentos quirurjicos, electrodos cerebrales y tambin por medio de transplantes de tejido infectado principalmente cornea y dura madre (68). Neurodegeneracin: Muchas enfermedades neurodegenerativas involucran el procesamiento anormal de protenas neuronales y la acumulacin de protenas mal plegadas, las TSEs no son la excepcion (10,81). La neurodegeneracin producida por los priones es un proceso multifactorial que involucra acumulacin de proteinas anormales en amiloides y agresomas, estrs oxidativo y apoptosis. Para que prpsc reconozca a prpc ambas deben encontrarse en la misma membrana plasmtica. Prpsc se une a prpc y se produce la reaccin de cambio conformacional que propaga la infeccin pues aumenta la cantidad de prpsc. En esta reaccin puede estar involucrada alguna chaperona celular u otro tipo de molcula como se explic anteriormente.

La reaccion puede ocurrir en cualquier superficie de membrana que contenga prpc y prpsc o a la cual prpsc tenga acceso (por ejemplo, prpsc en una vescula endocitica que sale del RE puede convertir a la prpc presente en el golgi cuando dicha vescula llegue a esta organela). Una vez que prpsc llega a una neurona y accede a prpc, le cambia la conformacin. Dado que prpc se ubica en dominios de membrana donde se produce endocitosis, el complejo resultante de prpsc puede ser endocitado y ser dirigido a los lisosomas. Una vez alli, es atacado por las proteasas lisosomales y como prpsc es parcialmente resistente no podra ser totalmente degradado. La acumulacin de esta protena parcialmente degradada en los lisosomas puede desencadenar el aumento del dao oxidativo debido al esfuerzo celular para degradarlas y adems puede desencadenar una seal de apoptosis. Por otra parte, el estrs oxidativo puede estar aumentado tambin por la deplecin de prpc producida por su conversin a prpsc con lo cual ya no puede cumplir su funcion antioxidante (33) (prpc esta involucrada en la defensa frente a radicales libres dada su actividad de superoxido dismutasa o su relacion con estas a traves de su funcion en el metabolismo del cobre). Se sabe que en las TSEs existe un aumento pronunciado de la concentracin de oxidantes como los radicales libres en el cerebro(33). Por otra parte, es muy probable que durante la degradacin parcial de prpsc en los lisosomas se forme el fragmento prp 27-30. Dicho fragmento es neurotxico y desencadena apoptosis. Esto fue observado en varios estudios. Ademas, se demostr que dicho fragmento no solo es capaz de formar agregados amiloides citotxicos sino que puede acomplejarse formando canales en membranas y estos canales permiten el paso de iones calcio (108). Este resultado podra tener gran importancia en los mecanismos por los cuales el prion produce dao celular. Los productos de degradacin lisosomal de prpsc como por ejemplo el prp27-30 podrian escapar del lisosoma mediante algun mecanismo desconocido y acceder al retculo endoplsmico donde son capaces de agregarse formando canales permedables a iones o bien podran acumularse en el citoplasma. En principio, fragmentos de prpsc como el mencionado tienen ancla de GPI, por lo que no podran acumularse en el citoplasma sino que quedarian anclados a la membrana lisosomal luego de su degradacin. Pero entre las enzimas lisosomales podran encontrarse fosfolipasas capaces de cortar el GPI, con lo que se obtendra prp27-30 no anclada en solucin capaz de llegar al citoplasma por algun mecanismo. La formacin de canales en la membrana del retculo por parte de prpsc se observ en clulas en cultivo. En otros estudios se encontr que la apoptosis inducida por priones ocurre a traves de la liberacin de calcio del retculo endoplasmico y activacion de la caspasa 12 residente en dicha organela (109). El aumento de la concentracin de calcio en el citosol es una seal de apoptosis, ademas, las caspasas son las proteasas efectoras de este mecanismo, degradando proteinas celulares. prpsc podra acceder a las molculas de prpc que se estan sintetizando en ribosomas asociados al retculo mediante un mecanismo desconocido. Una vez en el retculo, prpsc interfiere con el correcto plegado de prpc supervisado por chaperonas residentes en el retculo y produce agregacin proteica (109). Se sabe que en la patogenia de

los priones algunas chaperonas favorecen la conversin de prpc en prpsc cuando esta ultima esta presente (este es el caso de la proteina X hipottica propuesta en los primeros trabajos sobre priones que se cree que es una chaperona), mientras que otras protegen a prpc de la accion de prpsc. En el retculo se encuentra la chaperona Bip (tambin denominada Gpr78) que tiene una funcion protectora para la clula infectada con prpsc. Bip se une a protenas mal plegadas o agregadas y las dirige hacia su degradacin en proteasomas. Se cree que en las TSEs familiares (producidas por mutaciones en el gen PRP que resultan en prpc mutantes que se pliegan mal en el retculo o se agregan) el largo periodo de incubacin hasta la aparicion de los sntomas se debe a la accin protectora de Bip que media la degradacin de las molculas de prpc mutadas a traves del proteasoma (38). Como consecuencia de la agregacion de protenas en el retculo, llega un punto en que la defensa dada por chaperonas como Bip no da abasto y entonces se desencadena la apoptosis a traves del mecanismo de respuesta a estrs en el reticulo, que se denomina respuesta UPR (unfolded protein response). El estrs en el reticulo es desencadenado por factores tales como la deprivacin de nutrientes, o energia, flujos de calcio y acumulacin de proteinas mal plegadas (110). Estos factores inician la respuesta UPR que se basa en la unin de Bip a las proteinas mal plegadas en forma dependiente de ATP. Bip se une tanto a protenas mal plegadas como tambin a las que estan siendo sintetizadas, pero la unin es mas persistente con las protenas mal plegadas. La unin a las protenas normales es transiente. En condiciones de ausencia de estrs, Bip se une a tres protenas sensor transmembrana del retculo endoplasmico con lo cual produce la regulacin negativa del UPR porque mantiene a dichos sensores inactivados. En presencia de estrs en el retculo (presencia de protenas mal plegadas y/o agregadas), Bip se disocia de los sensores y se une a las protenas mal plegadas, entonces, ls protenas sensor liberadas permiten que el UPR se produzca, disminuye la sntesis general de protenas en ribosomas asociados al retculo y se aumenta la biosintesis de chaperonas del reticulo. A continuacion se activa una va de degradacion de las proteinas mal plegadas denominada ERAD (ER asociated degradation) que las dirige al proteasoma. Bip monitorea la calidad de las protenas en el retculo y regula cuales seran degradadas y cuales no. Adems, el aumento en la sntesis de chaperonas del reticulo es acompaada por la liberacin de calcio desde el reticulo al citosol, esto funciona como una seal apoptotica probablemente a travs de la va del inositol trifosfato (IP3) clsica (78,109) e involucra la activacin de la procaspasa 12 residente en el retculo (esta es clivada originando la caspasa 12 activa) La caspasa 12 va al citoplasma donde activa a la caspasa 3 que es central en los mecanismos de apoptosis, tambien se forman unas estructuras en el citoplasma denominadas agresomas que son complejos proteicos compuestos por agregados de prpsc, chaperonas Hsp70, subunidades del proteasoma, ubiquitina y vimentina. Se trata de complejos que se acumulan como resultado del intento de las celulas por degradar a prpsc. La formacin de los agresomas activa las caspasas 8 y tambien la 3, esto conduce a la apoptosis (111). Por otra parte, no siempre, es prpsc quien produce la neurodegeneracin. Una de las isoformas topologicas de prpc (CTMprpc ) es neurotxica por si misma y

existen casos de TSE en los cuales no se detecta prpsc pero si acumulacin de ctmprpc que ejerce efectos neurodegenerativos (69). Algunas mutaciones en el gen PRP favorecen la estabilizacin en el retculo de la forma topolgica transmembrana CTMprpc, esta no se acumula en el retculo sino que es transportada en vesiculas al Golgi, donde se acumula y conduce a las celulas a la apoptosis a traves de un mecanismo desconocido (69). Prpsc no solo se acumula en reticulo donde desencadena la respuesta UPR, sino tambien en lisosomas y citoplasma, al igual que el fragmento resultante de la degradacion con proteasas Prp27-30. El mecanismo de toxicidad que involucra lisosomas es desconocido, pero se sabe que conduce a la apoptosis a traves del efecto txico de la acumulacin de fragmentos de prpsc parcialmente degradados en los lisosomas. En el citoplasma, la toxicidad de prpsc o de sus derivados de degradacin involucrara la disfuncin de la va de degradacin de protenas citoslicas a travs de proteasomas que reconocen protenas marcadas con ubiquitina (111), adems, algunos autores proponen que en algunos casos, en ausencia de prpsc y de ctmprpc puede aparecer neurodegeneracin y TSEs, pues algunas mutaciones de prpc que rpesentan alteraciones queafectan su transporte a travs de la va secretoria pueden acumularse en el citoplasma y agregarse en amiloides, inhibiendo la degradacin por medio de proteasomas (111).

Priones de levadura y otros hongos

Una manera en que un prion de levadura (o cualquier otro ) puede manifestarse es a traves del cambio en una protena codificada en un gen cromosmico, de forma tal que la forma alterada de la protena es necesaria para la generacin de mas molculas de la misma forma a partir de la forma no alterada (es lo que ocurre con prpsc y prpc). Dicho cambio conformacional va a tener alguna consecuencia para la clula: si la forma infeciosa es txica (caso de prpsc) entonces la clula sera depletada de la forma normal y sufrir apoptosis. Esto es lo que ocurre con el prion prp como explique antes. Ahora, si la conformacin infecciosa es la forma inactiva de la protena normal entonces en las clulas en presencia del priones infecciosos, la protena normal se inactivar al convertirse en mas molculas de la forma infecciosa y el fenotipo se sera el mismo que se obtiene en un mutante nulo para el gen de la protena en cuestin. Este es el caso del prion Psi, que es la forma inactiva del terminador de la traduccin sup35 y del prion URE3, que es la forma inactiva de ure2p (un regulador del catabolismo del nitrogeno). Si la conformacin infecciosa es la forma activa en alguna funcin celular, entonces el fenotipo dado por esta conformacin es el wild type . Esto es lo que ocurre con el prion Het-s de podospora y con el prion beta de levadura. Ambos priones realizan funciones celulares normales y por esto la mayoria de las cepas de hongo wild type los tienen. En cambio, psi esta ausente en cepas wild type, su presencia seria desventajosa debido a la inhibicion de la traduccion (66). Aun asi se propaga eficientemente en la poblacin pues siempre que se produzca un mating (cruzamiento) entre una levadura psi positiva con una negativa, toda la progenie sera psi positiva. La infeccin

ocurre a traves del intercambio citoplasmatico entre las levaduras. Se trata de una herencia citoplasmatica con genes no cromosomales que adems son protenicos en forma anloga a la herencia de mitocondrias. En los hongos filamentosos, el intercambio involucra la fusin de hifas de colonias distintas y a traves de stas pueden pasar los priones. Los priones de levadura poseen tres caracteristicas que los distinguen de los virus: Curabilidad reversible: esto significa que la conformacin infecciosa se puede eliminar por completo de las celulas infectadas mediante algun tratamiento y aun asi luego puede volver a aparecer en forma espontanea sin necesidad de fuente externa pues la protena celular puede cambiar espontaneamente de conformacin con cierta frecuencia baja originando de novo la conformacin infecciosa. Esto con un virus no puede ocurrir, una vez que es eliminado de una celula no puede volver a aparecer en ella si no hay una nueva infeccion. La presencia de la conformacion no replicativa es necesaria para la propagacin de la conformacin infecciosa . La sobreexpresion de la forma no infecciosa incrementa la frecuencia con que esta aparece (es porque aumenta la probabilidad del cambio espontaneo.)

El prion URE3 Las clulas de levadura son capaces de reprimir la sintesis de las enzimas y transportadores necesarios para el crecimiento en medios pobres en ciertos nutrientes. Cuando crecen en medios ricos en nitrogeno como por ejemplo con glutamato, amonio, etc, la proteina Ure2p se une a los factores de transcripcin Gln3p y Gat1p en el citosol impidiendo su transporte al ncleo con lo cual no pueden actuar sobre los genes involucrados en el metabolismo de compuestos pobres en nitrogeno como por ejemplo el alantoato y el ureidosuccionato (USA). Entre los genes que intervienen se encuentra el DAL5 que codifica para un tranportador de ambos compuestos mencionados y es inhibido por los factores mencionados (5). Mutaciones en el gen ure2 que codifica la proteina ure2p no presentan la represion del los genes involucrados en el metabolismo de compuestos pobres en nitrogeno aun en presencia de compuestos ricos en nitrogeno como el amonio (1,5,112,113). La protena codificada por el gen ure2 puede existir en dos conformaciones, una de ellas es la protena ure2p mencionada y la otra se denomina URE3 que tiene comportamiento infeccioso en forma anloga al caso de prp. En presencia de URE3, las levaduras presentan el mismo fenotipo que las levaduras mutantes nulas para el gen ure2 pues URE3 convierte a ure2p en mas copias de si misma. URE3 posee las tres propiedades esperadas para los priones de levadura: puede se r eliminado de las celulas infectadas mediante tratamiento con guanidina pero de los clones curados se pueden aislar subclones que son URE3 positivos , La sobreexpresion de ure2p aumenta la produccin de URE3,

no por efecto del mRNA de ure2p sino por la presencia de la protena (5,6) y por ltimo, como indiqu, el fenotipo de las clulas URE3 positivas es el mismo que el de los mutantes nulos para Ure2p. Esto ocurre porque al propagarse URE3 mediante conversin de molculas de ure2p, estas cambian de conformacin tomando la conformacion infecciosa de URE3 y entonces ya no pueden cumplir su funcion (113). Las clulas que presentan URE3 tienen tambin ure2p parcialmente resistente a proteasas y esta resistencia es caracterstica de los amiloides (6) Ure2p se agrega especficamente en presencia de URE3 en forma dependiente de la secuencia de su extremo N-terminal (5,6). De hecho, el extremo N-terminal de 65 aa de Ure2p se denomina extremo prionico y es necesario para la agregacion y tambien para la innactivacin de la protena. Por otra parte, el dominio C-terminal de la protena es el que cumple la funcin represora de la transcripcion. Ademas, el dominio prionico es capaz de agregarse en ausencia del dominio C-terminal y propagar a URE3. De esta manera, URE3 se propaga mediante la conversin de molculas de ure2p en ms molculas de si misma que luego se agregan en amiloides.

El prion PSI
Este prion tiene dos conformaciones: sup35 que es la version normal con funcin en la traduccin y psi que es la forma infecciosa que se propaga a si misma mediante conversin de las molculas de sup35. Tambin forma amiloides como URE3 y su propagacin puede ser tanto inhibida como favorecida por chaperonas como por ejemplo hsp104,hsp40 y hsp70 (114,115). Sup35 es una subunidad de un factor de terminacin de la traduccin con funcion de reconocimiento de codones stop y clivaje del pptido del tRNA. En presencia de tRNAs supresores se establece una competencia entre el reconocimiento del codon de terminacin por dicho tRNA lo cual permite insertar mas aminocidos y el reconocimiento del codon de terminacin por parte del factor de terminacin, que resulta en la terminacin de la sntesis. La presencia de la forma infecciosa psi depleta a las celulas de sup35 y de esta manera la sntesis de protenas continua ms alla del codn de terminacin. (116,117). Al igual de lo que ocurre en el caso de ure2p, el extremo C-terminal de sup35 es el que se encarga de al funcin celular normal, es esencial para el crecimiento celular y presenta homologia con el factor de elongacin de la traduccion EF-1 (112) mientras que el dominio N-terminal es el que reconoce psi y esta involucrado en el cambio conformacional y capacidad de formar amiloides. Este dominio, in vitro es capaz de agregarse en presencia de psi y se lo denomina dominio prion, es tipico de varios priones de levadura. Mutaciones en este dominio pueden impedir la propagacin de psi (112) por otra parte el dominio C-terminal es funcional por si solo en sistemas de traduccin in vitro (116,117). El dominio prionico N-terminal de sup35 al igual que el de ure2p es rico residuos de glutamina y asparagina. Adems, los residuos de glutamina son importantes para la propagacin de la conformacin infecciosa (118) y el dominio posee 5 repeticiones de octapeptidos similar al del prion prp (6). La delecin de repeticiones inhibe la propagacin de psi, mientras que la adicin de nuevas repeticiones en el dominio aumenta la frecuencia de aparicin de la conformacin psi de novo (119).

En la figura 3 se muestra un esquema resumido de los mecanismos de accion de los priones PSI (figura 3a) y URE3 (figura3b y c)

Figura 3. Algunos priones de levaduras y sus mecanismos de accion. a) Psi secuestra moleculas de sup35 (isoforma normal), que pasan a formar parte del amiloide en crecimiento (cuadrados rojos). De esta forma sup35 no puede cumplir su funcion en la terminacion de la traduccion

b) Ure2p regula el metabolismo del nitrogeno. Cuando las celulas crecen en medio con nitrogeno, ure2p se une a gln3p, impidiendo la transcripcin de genes necesarios para el crecimiento en medios pobres en nitrogeno, como por ej Dal5p, que es un transportador de alantoato y de ureidosuccinato (USA). El alantoato es una fuente pobre de nitrogeno, mientras que USA es un intermediario de la sntesis de uracilo.

c) El prion URE3 secuestra moleculas de ure2p en amiloides. De esta manera disminuye la cantidad de moleculas disponibles para la regulacin del metabolismo del nitrogeno (6).

Otros priones: PIN

Es un prion que determina la inducibilidad del prion psi. La habilidad de la sobrexpresion de sup35 de inducir la aparicin espontanea de psi es mayor en presencia de PIN. Existe en dos formas, la conformacion normal se denomina rnq1p y esta codificada en el gen RNQ1 y la conformacin prionica (pues es la que se puede propagar) es PIN. En presencia de PIN, la proteina rnq1p se agrega en amiloides y toma la conformacion de PIN (6).

Het-s

Interviene en la incompatibilidad citoplasmatica en podospora, es decir, cumple una funcin normal. Cada cepa de dicha especie posee su propia cepa de Het-s, que se diferencia de la de las demas cepas en solo 13 de sus 289 aminoacidos.
Las cepas de Het-s se comportan como alelos no cromosomales. El mating solo puede ocurrir entre colonias de podospora con el mismo tipo de het-s (5,6) Beta. Se trata de un prion con funcin enzimatica. La forma infecciosa se denomina beta y es la forma activa de la proteasa vauolar beta. Esta conformacin es esencial para activar al precursor inactivo. La presencia de la forma beta es esencial para las celuas de levadura, en su ausencia son incapaces de esporular y mueren mas facilmente al ser cambiadas de medio (6,119).

Conclusion:
Los priones son protenas nicas, pues son capaces de ingresar en sus hospedadores a traves de sus portales naturales como por ejemplo el sistema digestivo y asi infectar como lo hacen virus y bacterias, ademas son portadores de informacin gentica en forma de conformaciones de protena en lugar de cidos nucleicos y esta variabilidad conformacional podria intervenir en la adaptacin de las especies hospedadoras, no solo en la produccin de enfermedad. Las protenas involucradas en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson, Huntington, etc, forman amiloides similares a los que forman los priones, pero no se comportan como priones y hasta ahora no fue posible determinar si lo son (120). Estas protenas producen lo que se

denomina enfermedades conformacionales, pues son producidas por protenas con conformacion alterada. No esta demostrado que las protenas responsables de dichas enfermedades puedan autopropagarse como los priones, pero en algunos casos parece que pueden ser transmitidos pues en experimentos en los que se inoculan amiloides en animales que ya presentan una amiloidosis la enfermedad se acelera, como si los amiloides inoculados participaran tambien de la patogenesis (68). Ahora bien: no se tratara de autenticos priones defectivos, en forma anloga a lo que ocurre con retrotransposones que son retrovirus defectivos y con muchos virus? es decir, protenas que en el pasado fueron priones pero que perdieron la capacidad autorreplicativa y de transmisin, conservando su capacidad de formar amiloides y causar enfermedad. Si esto fuera cierto, tal vez con algun prion helper sintetizado artificialmente se podra inducir el comportamiento prionico de estas supuestas protenas defectivas (esto que digo es anlogo a tener un virus defectivo en una celula que no puede replicarse e infectar con un virus helper que aporta la maquinaria de replicacin que le falta al otro virus, con lo cual se va a poder replicar). De hecho, en algunos casos es posible acelerar una enfermedad. Resulta evidente que los mecanismos por los cuales los priones ejercen su accion deleterea sobre las clulas de mamferos son complejos y permanecen en gran parte en el misterio. Basicamente todos involucran la apoptosis pero mediante diversas vias parcialmente conocidas. Otras ms seguramente quedan por descubrir. Se puede destacar tambien la semejanza entre la patogenia de los priones y la de ciertos virus que afectan el sistema nervioso en ratones. En ratn existen retrovirus que inducen la respuesta UPR a traves de la acumulacin y agregacin de protenas virales de la capside en el retculo a las cuales se une Bip (110). El mecanismo de toxicidad de prpsc en el retculo no esta determinado totalmente sino que la evidencia experimental apunta a que es el mismo que ocurre en el retrovirus murino. Resulta intrigante que dicho virus produce una enfermedad que se asemeja muchsimo a las TSEs, incluyendo vacuolizacin de las neuronas. Esto podria ocurrir mediante el mismo mecanismo que la espongiosis de origen prionico, involucrando acuoporinas. La semejanza entre el virus y el prion podria ser simplemente producto de la casualidad o tal vez el resultado de la evolucin convergente, pero otra posibilidad apunta aun origen viral del gen PRP. Dicho gen podria provenir de un retrovirus ancestral que infectaba a algun vertebrado del cual derivaron todos los vertebrados, que actualmente tienen el gen. El virus se habra insertado en el genoma del vertebrado en la lnea germinal mediante su mecanismo de transposicin y habra quedado incorporado. Actualmente se piensa que mucho del DNA presente en los organismos deriva de retrovirus. Existen retrovirus endgenos, esto es, retrovirus que perdieron genes que requerian para multiplicarse, por lo que quedan latentes en el genoma y van acumulando mutaciones, ademas puede ocurrir duplicacin y divergencia de sus secuencias. Luego, cada duplicacion evoluciona por separado. Originalmente, el gen PRP pudo pertenecer al genoma de un retrovirus y codificar una prpc perteneciente a la capside viral que por alguna razon fue conservada y actualmente es producida por las celulas de vertebrados

actuales. La evidencia a favor de algunas de las funciones propuestas para prpc es fuerte, pero aun asi, hasta ahora nadie demostro la funcin in vivo sin que haya ninguna duda, a lo mejor, la dificultad para encontrar dicha funcin y determinar que realmente es esa la funcion in vivo se debe a que prpc cumplira una funcion redundante, suplida por otras protenas. Pero tal vez la imposibilidad de determinar la funcin se deba a que no la tiene ms alla de servir para la propagacion de prpsc, pero Prpc bien podria derivar de una proteina viral y seguir siendo sintetizada en al celula si tenerla proporcionara alguna ventaja adaptativa, por ejemplo interferir con la multiplicacin de virus y esa podra ser su funcin actual. Dentro del ciclo de multiplicacin de un virus puede estar involucrado en muchos casos la sntesis de protenas de la cpside que se translocan al retculo y siguen la via secretoria al igual que prpc. Si prpc derivara de protenas virales ancestrales podria haber mantenido cierta semejanza con protenas virales actuales y de esta manera interferir con la replicacin viral a traves de la interaccion con las protenas virales en el lugar en que se ensambla la capside (en algun punto de la ia secretoria, puede ser el retculo, el Golgi o las vesculas endocticas). La interaccin con protenas de la cpside que se estan ensamblando podria resultar en la produccin de cpsides defectivas que no incorporan el genoma viral, inhibiendo asi la infeccin, se tratara de un sistema de defensa. De todos modos esto es hipottico y no concuerda bien con la evidencia a favor de funciones relacionadas con transduccion de seal, estrs oxidativo y metabolismo del cobre. Harian falta nuevos estudios para aclarar este punto. Los priones podran en principio ser importantes en la adaptacin de sus hospedadores al medio ya que tienen la capacidad de propagar una conformacin proteica en toda la poblacin de dicha protena dentro de los individuos de una misma especie en forma altamente eficiente y relativamente rpida una vez que se encuentran dentro de la clula blanco, y tambin debido a que cada conformacin tiene una informacin intrnseca distinta. Pueden formar parte de mecanismos de regulacin y adaptacin en los que inicialmente todas las protenas de un mismo tipo tienen la misma conformacin dentro de una poblacin dada de cierta especie hospedadora y estan cumpliendo una funcion determinada. Ante algn cambio en el ambiente que resulta perjudicial para la especie, en algunos individuos podria cambiar espontneamente la conformacin del prion, que entonces se va a propagar entre los individuos de la poblacin, en algunos casos, la nueva conformacin podria favorecer la adaptacin al cambio, en cambio, otras nuevas conformaciones podran ser perjudiciales (por ejemplo el caso de prpsc). Cualquier conformacin del prion que surja y se comporte como las formas infecciosas descriptas en este trabajo, se va a propagar y va a reeemplazar a todas las molculas de otra conformacin que encuentre, por esto, en principio tanto el prion que confiere ventaja adaptativa y el que resulta perjudicial se van a propagar, pero el perjudicial va a estar sujeto a seleccin natural negativa, es decir va a tender a perderse pues los organismos que lo poseen seran menos viables y dejaran menos descendencia. Esto no se cumple en el caso de prp porque es un prion lento, las enfermedades que produce tienen un largo periodo de incubacin de decadas y no impiden que el individuo portador deje descendencia. La enfermedad suele desencadenarse despus del fin de la edad reproductiva.

En cambio un prion beneficioso, va ser mantenido en la poblacin por seleccin natural y se va propagar mas fcilmente pues sus portadores tendran un fitness mayor. Otra funcion de los priones se relaciona al mantenimiento de la memoria. En un molusco del genero Aplysia, se encontr una protena con caractersticas tpicas de prion denominada elemento de poliadenilacin citoplasmtica proteico (CPEB). Esta protena activa mRNAs latentes (mensajeros que fueron sintetizados pero que no se estan traduciendo) mediante la elongacin de sus colas de poliA y esto esta asociado a estabilidad sinaptica de largo alcance (conservacin de la memoria). CPEB existe en dos conformaciones y la conformacin que se encarga de elongar los mensajeros y de esta forma participar del proceso de mantenimiento de la memoria es la conformacin infecciosa que se propaga como todo prion (convirtiendo molculas de la otra conformacin, que es inactiva en mas molculas de si misma) (116). Seguramente existen muchsimos casos mas como este. Los priones son protenas ubicuas de los que actualmente se sabe muy poco y puede que sean mas importantes de lo que se piensa. Tal vez se trata de otro caso similar al del RNA, del que hace algunos pocos aos nadie imaginaba la cantidad de funciones regulatorias que tiene a traves del mecanismo de RNAi.

Agradecimientos
Este trabajo fue realizado gracias a una iniciativa de los docentes de quimica biologica II, materia dictada en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires.

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