Artyku naukowy

prof. dr hab. n. farm. ELBIETA LIDIA ANUSZEWSKA Kierownik Zakadu Biochemii iBiofarmaceutykw Narodowego Instytutu Lekw wWarszawie  aktywno enzymw zwizanych zmetabolizmem komrki  zdolno komrki do podziaw, czyli proliferacji  zmiany wzawartoci biaka lub materiau genetycznego Miar aktywnoci cytotoksycznej jest warto stenia badanego czynnika hamujcego ywotno komrki IC50 (ang. inhibitory concentration), czyli takie jego stenie, przy ktrym proliferacja komrek zostaje zahamowana w50 proc., wodniesieniu do ukadu kontrolnego.

Streszczenie:

Obowizujce prawo wymaga, aby nowe zwizki imateriay potencjalnie mogce mie zastosowanie wterapii, podlegay badaniom wcelu oceny ich aktywnoci cytotoksycznej. Wprawdzie badania cytotoksycznoci in vitro nie wpeni oddaj dziaanie toksyczne in vivo, lecz mog by doskona wskazwk dotyczc mechanizmu oddziaywania na komrk. Wcelu oceny aktywnoci cytotoksycznej badanych jest szereg parametrw zwizanych zywotnoci komrki, takich jak: integralno bony komrkowej, metabolizm, zdolno do replikacji. Wraliwo komrki na dziaanie danego czynnika wyraana jest wartoci IC50.
Sowa kluczowe:

Cytotoksyczno, testy in vitro, IC50

Summary:

Legislation demands that new therapeutic agents are subjected to rigorous cytotoxicity testing before they are progressed to the clinic. Although in vitro cytotoxicity is not necessarily directly related to in vivo toxicity, it can indicate aselective mode of action for acompound. For estimation of cytotoxicity arange of parameters can be investigated, including cell viability, cell metabolism and cell replication. Sensitivity of cells to tested agents is defined on the basis of IC50values obtained in used tests.
Key words:

leczniczego danego zwizku, aktywno cytotoksyczna jest aktywnoci podan, jak to ma miejsce wprzypadku cytostatykw, stosowanych wchorobach nowotworowych lub jest parametrem dyskwalifikujcym. Zwizki chemiczne oddziauj na komrk wrny sposb zaburzajc jej procesy fizjologiczne, azaistniae zmiany wtych procesach mona obserwowa stosujc rne techniki pomiarowe jak np.: kolorymetri, fluorymetri, bioluminescencj czy pomiar scyntylacyjny wprzypadku uycia izotopw promieniotwrczych. Szybki rozwj hodowli komrek ssaczych, jako alternatywy dla bada zuyciem zwierzt, stworzy moliwo wykonania pierwszych bada przesiewowych zyw komrk in vitro. Ichocia badania in vitro aktywnoci cytotoksycznej nie mog cakowicie zastpi bada toksycznoci in vivo, to jednak przy odpowiednio dobranych testach mog okreli potencjalny mechanizm oddziaywania na komrk idalszy kierunek bada.

Barwniki...
Jedn zpodstawowych metod bezporedniego pomiaru ywotnoci komrek whodowli, jest okrelenie liczby ywych lub martwych komrek poprzez zastosowanie odpowiednich barwnikw, ktre wzalenoci od stanu bony komrkowej albo wnikaj do wntrza komrki albo pozostaj na jej powierzchni. Najczciej do barwienia przyyciowego stosowany jest, bkit trypanu lub czerwie obojtna: Bkit trypanu (BT) barwi wycznie martwe komrki, pnoapoptotyczne lub nekrotyczne, nie wnikajc do cytoplazmy komrek ywych, co jest zwizane ze zmian wintegralnoci bony komrkowej. Komrki zzabarwion na ciemnoniebiesko bon komrkow zliczane s wkomorze hemocytometru, wmikroskopie wietlnym1,2. Czerwie obojtna (NR neutral red ) rwnie pozwala na odrnienie komrki ywej od martwej. Barwnik ten przechodzi na drodze transportu biernego do cytoplazmy jedynie komrek ywych, zwydajnym procesem naprawy uszkodze wywoanych przez badany czynnik inagromadza si wlizosomach. Zabarwione na czerwono komrki zliczane s wkomorze hemocytometru lub po odpowiednim przygotowaniu hodowli, intensywno zabarwienia,

Testy aktywnoci cytotoksycznej

Wybr metody badania aktywnoci cytotoksycznej zaley wduym stopniu od informacji ocharakterze badanego zwizku imoliwoci interakcji zywym organizmem lub jego skadowymi. Aktywno cytotoksyczn mona oceni poprzez bezporedni lub poredni pomiar zmian zachodzcych wkomrce poddanej dziaaniu danego zwizku wodniesieniu do ukadu kontrolnego hodowli komrek bez badanego zwizku lub ze zwizkiem, oktrym wiadomo, e jest cytotoksyczny wokrelonym zakresie ste. Stosowanych jest cay szereg testw do oceny aktywnoci cytotoksycznej wykorzystujcych: zmiany wintegralnoci bony komrkowej
GAZETA FARMACEUTYCZNA 5/2010

Cytotoxicity, in vitro tests, IC50

Zatwierdzono do publikacji: marzec 2010 r.

O
36

bowizujce prawo wymaga, aby wszystkie nowe zwizki ocharakterze potencjalnych lekw, podlegay szeroko zakrojonym badaniom wcelu oceny aktywnoci cytotoksycznej, przed skierowaniem ich do bada klinicznych. Wzalenoci od przeznaczenia

Fot. K. KALISKI

Badanie aktywnoci cytotoksycznej produktw leczniczych iwyrobw medycznych

Artyku naukowy
proporcjonaln do liczby ywych komrek, mierzy si spektrofotometrycznie3,4. towana tymidyna [H3] tymidyna ipomiar scyntylacyjny promieniowania . Bardziej wyrafinowan metod pozwalajc na ocen wielkoci uszkodze powodowanych przez badany czynnik izapocztkowania procesw fizjologicznej mierci, jest barwienie komrek aneksyn V ijodkiem propidyny (PI). We wczesnej apoptozie fosfatydyloseryna usytuowana po wewntrznej stronie bony komrkowej przemieszcza si na zewntrz iwie zaneksyn V. Jednoczenie jodek propidyny pozwala na obserwacj integralnoci bony komrkowej zwizan zprocesem nekrozy11. Ta procedura umoliwia rozrnienie komrek: we wczesnej apoptozie wpnej fazie apoptozy ywych, nieapoptotycznych komrek nekrotycznych. wyrobw medycznych jest norma PN-EN ISO 10993-5:2009, Biologiczna ocena wyrobw medycznych Cz 5: Badania cytotoksycznoci in vitro18. Norma przewiduje 3 testy dla oceny dziaania toksycznego wyrobw medycznych, wzalenoci od rodzaju materiau, zktrego jest wykonany iprzeznaczenia: test bezporedniego kontaktu test dyfuzji wagarze test na wycigach Norma okrela:  warunki przygotowania hodowli do poszczeglnych testw  rekomendowane linie komrkowe  warunki przygotowania prby badanej ikontroli  niezbdne iloci prby badanej  rodzaj materiau zastosowanego jako kontrola pozytywna inegatywna warunki ekstrakcji kryteria oceny uzyskanych efektw Opisane procedury pozwalaj na jakociow iilociow ocen toksycznoci wyrobu medycznego. Zgodnie znorm wtecie na wycigach oceniane s zmiany morfologiczne komrek wywoane przez wyekstrahowane substancje zbadanego materiau, wodniesieniu do 5-stopniowej skali toksycznoci: stopie 0: wyrb nietoksyczny (pojedyncze wewntrzplazmatyczne ziarnistoci) stopie 1: wyrb sabo toksyczny (ok. 20 proc. komrek zaokrglonych iodlepiajcych si, pojedyncze komrki rozerwane) stopie 2: wyrb umiarkowanie toksyczny (ok. 50 proc. zaokrglonych, umiarkowana liza komrek, zahamowanie proliferacji wok. 50 proc.) stopie 3: wyrb rednio toksyczny (ok. 70 proc. komrek zaokrglonych iodlepiajcych si, zaawansowana liza komrek, zahamowanie proliferacji) stopie 4: wyrb silnie toksyczny (praktycznie zniszczona hodowla) Podobnie wyglda ocena jakociowa wprzypadku testu bezporedniego kontaktu itestu dyfuzji wagarze ztym, e oceniany jest zakres uszkodzenia hodowli pod lub poza badanym wyrobem (wielko strefy zmienionych morfologicznie komrek lub zahamowania wzrostu). Dla oceny ilociowej zmian wywotnoci komrek, norma PN-EN ISO 109935:2009 zaleca stosowanie testu zczerwieni obojtn (NR), MTT lub jego odmiany XTT atake testu tworzenia kolonii. Poprawne przeprowadzenie procedury oceny aktywnoci cytotoksycznej zwizku lub wyrobu medycznego, wy-

... ienzymy
Dziaanie cytotoksyczne badanych czynnikw mona take okreli metodami porednimi, np. poprzez aktywno enzymw komrkowych: Dehydrogenaza mleczanowa (test LDH), enzym cytoplazmatyczny, na skutek zmian wintegralnoci bony komrkowej przemieszcza si zkomrki do poywki hodowlanej. Obecny wpodou hodowlanym enzym przeksztaca sl tetrazoliow wbarwny formazan, aintensywno zabarwienia mierzona jest spektrofotometrycznie5. N-acetylo-beta-D-glukozaminidaza (test NAG), enzym lizosomalny, ktry tak jak LDH, wprzypadkach uszkodzenia komrki przechodzi do podoa hodowlanego. Oznaczenie jego aktywnoci wpodou moe by miar dziaania cytotoksycznego6. Dehydrogenaza bursztynianowa (test MTT), enzym mitochondrialny obecny wywych komrkach, ktry redukuje rozpuszczalny wwodzie bromek tetrazoliowy do formazanu, wytrcajcego si wpodou, wpostaci nierozpuszczalnych, szaro-fioletowych krysztaw. Intensywno zabarwienia roztworu po rozpuszczeniu krysztaw, mierzona spektrofotometrycznie, jest miar ywotnoci komrek7,8. Test MTT jest obecnie najczciej stosowany do oceny dziaania cytotoksycznego izalecany jako referencyjny, przez midzynarodowe organizacje normotwrcze. Niedawno pojawia si na rynku modyfikacja tego testu pod nazw EZ4U, gdzie efektem kocowym reakcji pomidzy enzymem asol tetrazoliow nie s krysztay formazanu, arozpuszczalny wpodou barwny zwizek, co upraszcza procedur izmniejsza ryzyko popenienia bdu9. Oszacowanie liczby ywych komrek whodowli jest moliwe take przy uyciu testu zsulforodamin (SRB). Podstaw metody jest elektrostatyczne wizanie biaka wrodowisku oodpowiednim pH zsulforodamin ispektrofotometryczny pomiar intensywnoci zabarwienia. Ilo biaka wprbie jest wprost proporcjonalna do liczby ywych komrek. Moemy take oceni liczb ywych komrek whodowli poprzez zawarto wnich DNA, wikszo uszkodze powoduje zahamowanie jego syntezy10. Najczciej wtym celu stosuje si wbudowywanie prekursorw syntezy DNA, takich jak try-

Linie komrkowe
Niezmiernie wany wbadaniach toksycznoci in vitro jest dobr odpowiedniej linii komrkowej. Tak jak kady ywy organizm, komrki wywodzce si zrnych tkanek irnych gatunkw, bdzie cechowaa rna wraliwo na t sam substancj. Dlatego te dla waciwej oceny naley uy jak najwikszej iloci linii komrkowych ozrnicowanej wraliwoci12,13. Naley take zwrci uwag na fakt, e testy stosowane do oceny dziaania cytotoksycznego nie s rwnowane. Wartoci IC50 uzyskane wrnych testach dla tej samej linii komrkowej itej samej substancji, mog si niekiedy znacznie rni. Metody oparte na liczeniu zabarwionych komrek daj ocen do subiektywn, zalen od wprawnego oka oceniajcego, metody oparte np. na pomiarach spektrofotometrycznych s bardziej obiektywne idaj wyniki zblione do stanu faktycznego2,4,14.

Wyroby medyczne
Odrbnym dziaem wbadaniach cytotoksycznoci jest badanie wyrobw medycznych. Wodrnieniu od produktw leczniczych, gdzie zakres bada jest uzaleniony od przeznaczenia terapeutycznego zwizku inie ma ogranicze odnonie testw ilinii komrkowych, zakres bada wyrobw medycznych cile okrelaj odpowiednie akty prawne. Monografie dotyczce badania cytotoksycznoci znajduj si wfarmakopeach: polskiej iamerykaskiej oraz publikacjach NIL15,16,17. Jednake podstawowym dokumentem obowizujcym przy ocenie toksycznoci
GAZETA FARMACEUTYCZNA 5/2010

37

maga dysponowania odpowiednio wyposaonym laboratorium iodpowiednio przeszkolon kadr. Zakad Biochemii iBiofarmaceutykw Narodowego Instytutu Lekw posiada akredytacj Polskiego Centrum Akredytacji, AB 774 iEuropejskiego Dyrektoriatu ds. Jakoci Lekw (European Directoriate for the Quality of Medicines & Health Care), EDQM/MJA-032, wzakresie badania cytotoksycznoci, jak rwnie wzakresie oceny dziaania genotoksycznego (test Amesa).
prof. ELBIETA LIDIA ANUSZEWSKA
e-mail: anuszewska@il.waw.pl

Pimiennictwo:
1. Anuszewska E: Effect of H2O2 on adriamycin-induced cytotoxicity in vitro. Archiv. Immunol. Ther. Eptl. 42, 281-286. 1994 2. Anuszewska E L, Gruber B M, Koziorowska J H: Studies on adaptation to adriamycin in cells pretreated with hydrogen peroxide. Biochem. Pharmacol. 54, 597-603,1997 3. Borenfreund E, Puerner J A: Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicol. Letters 24, 119-124, 1985 4. Husy T, Syversen T, Jenssen J: Comparisons of four in vitro cytotoxicity tests: The MTT assay, NR assay, uridine incorporation and protein measurements. Toxicol. in Vitro 7(2), 149-154, 1993 5. Fotakis G, Timbrell J A: In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicol. Letters 160(2), 171-177, 2006 6. Niu Q, Zhao C, Jing Z: An evaluation of the colorimetric assays based on enzymatic reactions used in the measurement of human natural cytotoxicity. J. Immunol. Methods 251(1-2), 11-19, 2001 7. Mosmann T: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65, 55-63, 1983 8. Gruber B, Anuszewska E: Adaptacja kolorymetrycznego testu do oceny dziaania cytotoksycznego in vitro. Biuletyn IL 38(3), 5-10, 1994 9. Krzyszto-Russjan J, Ksiek I, Anuszewska E: Porwnanie uytecznoci testw MTT iEZ4U stosowanych do oceny cytotoksycznoci ksenobiotykw. Farm. Pol. 65(6), 1-8, 2009 10. Voigt W: Sulforhodamine B assay and chemosensitivity. Methods Mol. Med. 110, 39-48, 2005 11. Gruber B M, Anuszewska E L, Skierski J S: Activation of programmed cell death (apoptosis) by adriamycin in human neoplastic cells. Mutation Res. 484, 87-93, 2001 12. Isama K, Matsuoka A, Haishima Y, Tsuchiya T: Proliferation and differentiation of normal human osteoblasts on dental Au-Ag-Pd casting alloy: Comparison with cytotoxicity using fibroblast L929 and V79 cells. Mater. Trans. 43, 3155-3159, 2002 13. Gruber B M, Anuszewska E L: Ocena dziaania cytotoksycznego nowych pochodnych antracyklinowych wukadzie rnych linii komrkowych. Biuletyn IL 45(3), 569-578, 2001 14. Radko L, Cybulski W, Rzeski W: Cytotoksyczno salinomycyny ilazolocydu wobec hepatocytw modelowej linii komrkowej szczura. Med. Wet. 63(7), 839842, 2007 15. Farmakopea Polska wyd. VI. Badanie toksycznoci tworzyw przy uyciu ustalonych linii komrkowych (badanie in vitro), str. 144, 2002 16. U.S.Pharmacopeia 32 / National Formulary 27. Biological reactivity tests in vitro, p. 97, 2009 17. Anuszewska E L: Badanie toksycznoci tworzyw przy uyciu linii komrkowych in vitro. Biuletyn IL 39(3), 23-29, 1995 18. PN-EN ISO 10993-5:2009

38

GAZETA FARMACEUTYCZNA 5/2010