P R A C A O R Y G I N A L N A T E S T Y D IAGNO S T YC Z N E

Porwnanie uytecznoci testw MTT i EZ4U stosowanych do oceny cytotoksycznoci ksenobiotykw1

Jolanta Krzyszto-Russjan, Iza Ksiek, Elbieta Anuszewska
Zakad Biochemii i Biofarmaceutykw Narodowego Instytutu Lekw Adres do korespondencji: dr n. med. Jolanta Krzyszto-Russjan, Narodowy Instytut Lekw, ul. Chemska 30/34, 00725Warszawa, tel./faks 022 841 54 31, e-mail: jrussjan@il.waw.pl

ytotoksyczno jest jednym z podstawowych mechanizmw dziaania chemioterapeutykw stosowanych w farmakoterapii [13]. W oznaczaniu aktywnoci cytotoksycznej lekw przeciwnowotworowych wwarunkach in vitro, stosuje si liczne techniki pozwalajce na pomiar zmian zwizanych zzaburzeniami procesw zjologicznych komrek ludzkich lub zwierzcych, powodowanych przez badan substancj [4, 5]. Pomiar zmian aktywnoci procesw komrkowych jest przeprowadzany dla hodowli komrkowej poddanej dziaaniu badanej substancji, wodniesieniu do kontroli stanowicej hodowl bez leku, najczciej przy uyciu technik kolorymetrycznych, uorymetrycznych, bioluminescencyjnych lub izotopowych [1, 57]. Miar aktywnoci cytotoksycznej badanej substancji jest okrelenie stenia hamujcego, IC50 (ang. inhibitory concentration), dla ktrego wzrost iproliferacja komrek whodowli zostaj zahamowane w50%, wstosunku do wzrostu komrek kontrolnych. Testy stosowane do oceny cytotoksycznoci pozwalaj na bezporedni bd poredni pomiar rnych zmian odzwierciedlajcych aktywno cytotoksyczn, np. liczby ywych komrek, niekiedy w poczeniu z okreleniem integralnoci bony komrkowej, oznaczeniem aktywnoci enzymatycznej zwizanej z metabolizmem komrki, okreleniem zdolnoci do podziaw komrkowych (stopie proliferacji) czy okreleniem cakowitej zawartoci biaka lub DNA whodowli komrkowej. Na jako wynikw bada wpywa wiele czynnikw, m.in. stabilno zastosowanej linii komrkowej, walidacja protokou prowadzenia badania, atake optymalny dobr techniki [2, 8]. Na rynku jest obecnie bardzo duo testw irozwiza technicznych, dlatego niej omwiono te najczciej stosowane.
1

Comparison of MTT and EZ4U assays applied for xenobiotics cytotoxicity evaluation Aim of study. The aim of this study was acomparison of MTT and EZ4U assays usefulness for doxorubicin cytotoxicity evaluation. It was performed by following various cell lines such as: human melanoma ME18, ME18/R, normal human broblasts WS-1, mouses broblasts L929 and human cervical cells HeLa. Results. Doxorubicin IC50 values analysis obtained for all cultures used in this study included repeatability, inside experiments variability as avalue of relative standard deviation in percents %RSDi) and intermediate precision (variability between experiments %RSDb). The highest concordance of both techniques was reected by followed doxorubicin IC50 values (MTT IC50 = 0,28 vs. EZ4U IC50 = = 0,27 g/ml) obtained for HeLa cells with respective precision 24 vs. 11,2%. For WS1 and L929 cell cultures IC50 values obtained in MTT assay were almost two-fold lower than achieved by EZ4U assays and characterized by values 0,21 and 0,22 vs. 0,44 i0,52 g/ ml respectively with the precision for MTT assay reected by values including%RSDb 32,6 and 35,2%, and for EZ4U assay 5,8 and 4,0% respectively. IC50 for ME18 determined by MTT assay was 2,4fold higher than by EZ4U assay (0,6 vs. 0,25 g/ml). This values were obtained with the precision for MTT assay 20,5%, and for EZ4U assay 12,0%. There was not obtained any IC50 value for MR18/R by MTT assay in tested range concentrations but by EZ4U assay IC50 reached 34,4 g/ml and was characterized by 5,8% precision. Conclusions. The results obtained in this study performing by EZ4U and MTT conrmed the usefulness of this both techniques for doxorubicin cytotoxicity evaluation. The EZ4U assay results characterized by considerably higher precision and repeatability (results in the article) then MTT assay results and as an only one followed to obtain IC50 values in the ranged doxorubicin concentration for all cell lines used in this study. Keywords: cytotoxicity, MTT assay, EZ4U assay, doxorubicin Farm Pol, 2009, 65(6): 395-402

Praca zostaa wykonana w ramach dziaalnoci statutowej NIL w 2008 r., DS nr 1.54.

Tom 65 nr 6 2009

395

Jednym zpodstawowych iszybkich bada jest pomiar liczby ywych komrek, ktry moe by przeprowadzony porednio z uwzgldnieniem oceny integralnoci bon komrkowych, np. wtecie zczerwieni obojtn, NR (ang. neutral red ), opartym na wychwycie czerwieni przez lizosomy. Barwnik ten przechodzi przez bon komrkow jedynie ywych komrek igromadzi si wlizosomach. Badanie to pozwala na odrnienie komrek ywych i nieuszkodzonych od martwych lub Celem pracy byo porwnanie uszkodzonych, poprzez okrelenie liczby komrek ywych, zabarwionych na uytecznoci testw MTT oraz czerwono wkomorze hemocytometru, EZ4U do oceny aktywnoci bd spektrofotometrycznie przez podoksorubicyny. Porwnanie miar absorbancji roztworu uzyskanego to przeprowadzono po rozpuszczeniu barwnika w 1% rozzzastosowaniem rnych linii tworze acetonu zawierajcego 30% etakomrkowych, tj.:komrek nolu, po uprzednim usuniciu podoa ludzkiego czerniaka ME18, hodowlanego [4]. Innym rozwizaniem ME18/R, prawidowych technicznym wskazujcym na brak inbroblastw ludzkich WS1, tegralnoci bon komrkowych, jest broblastw mysich L929 pomiar aktywnoci enzymu cytoplaoraz komrek raka szyjki zmatycznego dehydrogenazy mleczamacicy HeLa. nowej, LDH w podou hodowlanym. Obecno tego enzymu w podou wiadczy o uszkodzeniu bon komrkowych i moe by mierzona porednio przez wykrywanie zredukowanego formazanu. Wtecie LDH wykorzystuje si reakcj redukcji soli tetrazoliowej do barwnego formazanu, jako produktu dwustopniowej reakcji. W pierwszym etapie, wwyniku przeksztacenia mleczanu do pirogronianu przy udziale LDH powstaje zredukowany dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy NADH/H+, zktrego przy udziale diaforazy wdrugim etapie jon wodorowy H+ jest przenoszony na sl tetrazoliow. Wefekcie powstaje barwny formazan, ktrego intensywno zabarwienia jest mierzona spektrofotometrycznie [2, 5]. Przykadem innego badania, rwnie wskazujcego na brak integralnoci bon komrkowych, jest test NAG. Pozwala on na wykazanie obecnoci enzymu lizosomalnego N-acetylo-beta-D-glukozaminidazy wpodou hodowlanym, co jest moliwe jedynie wtedy, gdy komrki s uszkodzone. Dlatego oznaczanie aktywnoci tego enzymu wtecie NAG jest take stosowane wbadaniach cytotoksycznoci [1]. Okrelanie liczby komrek jest moliwe przy uyciu testu zsulforodamin (SRB). Pozwala on na okrelenie cakowitej iloci biaka wbadanej prbce, ktra jest wprost proporcjonalna do liczby komrek. Podstaw tego badania jest elektrostatyczne wizanie si sulforodaminy do biaek wodpowiednim pH, zalenym od skadu jakociowego aminokwasw, po wczeniejszym utrwaleniu komrek kwasem trjchlorooctowym TCA. [9]. Przykadem badania efektywnoci procesw energetycznych zachodzcych wmitochondriach, stosowanego do okrelenia cytotoksycznoci, jest oznaczenie 396

liczby wewntrzkomrkowego ATP [6]. Zaoeniem tej metody jest przyjcie staej charakterystycznej liczby ATP dla okrelonego rodzaju komrki woptymalnych warunkach hodowli. Zmiana iloci ATP jest proporcjonalna odpowiednio do wzrostu lub spadku liczby komrek, a take do spadku efektywnoci procesw energetycznych wkomrkach. Woznaczeniu liczby ATP wykorzystuje si zjawisko bioluminescencji powstajce wreakcji zlucyferaz, katalizujc reakcj utlenienia lucyferyny do oksylucyferyny z udziaem jednej czsteczki ATP. Wtym procesie emitowane jest promieniowanie wietlne. Intensywno wiecenia mierzona jest luminometrycznie iwyraana wfotonach. Wokreleniu liczby ATP wbadanej prbce wykorzystuje si liniow zaleno intensywnoci luminescencji od liczby ATP iliczby komrek. Innym przykadem pomiaru aktywnoci metabolicznej ywych komrek jest test AB (ang. alamarBlue) zzastosowaniem resauryny obarwie niebieskiej, ktra wprocesach oksydoredukcyjnych jest przeksztacana wresorun orowej uorescencji. Pomiar iloci powstaego produktu moe by przeprowadzony spektrofotometrycznie lub uorymetrycznie. Uzyskane wyniki pozwalaj oceni aktywno enzymatyczn procesw utleniania iredukcji wodniesieniu do kontroli [2]. Spord technik kolorymetrycznych jedn z najczciej stosowanych metod ilociowych, pozwalajcych na okrelenie cytotoksycznoci badanej substancji wobec komrek, jest test MTT opracowany wlatach 80. XX w. przez Mosmanna [10]. Wykorzystuje si wnim aktywno dehydrogenazy bursztynianowej, enzymu mitochondrialnego, obecnego wywych komrkach, ktry przeksztaca rozpuszczaln sl tetrazoliow, bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)2,5-difenylotetrazoliowy, wform zredukowan, nierozpuszczalny formazan, wytrcajcy si w postaci krysztaw [11]. Po zmianie rodowiska irozpuszczeniu krysztaw wDMSO lub izopropanolu powstaje barwny roztwr, ktrego intensywno zabarwienia mierzona jest spektrofotometrycznie wzakresie dugoci fal 492570 nm [1, 2, 5]. Wkomrkach uszkodzonych, upoledzonych metabolicznie lub martwych, formazan tworzy si wmniejszych ilociach lub nie powstaje. Zmiany iloci iaktywnoci enzymatycznej dehydrogenazy bursztynianowej wtecie MTT s odzwierciedlone w pomiarach absorbancji. Intensywno barwy roztworu jest wprost proporcjonalna do iloci powstaego produktu iporednio do liczby ywych komrek. Uzyskanie wiarygodnych ipowtarzalnych wynikw zzastosowaniem testu MTT, wymaga precyzji laboratoryjnej na wszystkich etapach testu, ze szczeglnym uwzgldnieniem ostatniego etapu, tj.: rozpuszczania krysztaw formazanu [1, 4]. Do oceny cytotoksycznoci substancji dostpnych jest dzi wiele testw komercyjnych, ktre jako substrat wykorzystuj sl tetrazoliow, przeksztacan pod wpywem dehydrogenazy w barwny, rozpuszczalny
Tom 65 nr 6 2009

P R A C A O R Y G I N A L N A T E S T Y D IAGNO S T YC Z N E

zwizek, nie za wkrysztay formazanu. Taka modykacja skraca procedur iupraszcza kocowy etap wizualizacji wynikw, przez co zmniejsza ryzyko bdu laboratoryjnego. Jednym z takich komercyjnych testw, wykorzystujcych zasad dziaania zblion do testu MTT, tj. redukcj soli tetrazoliowej, ale zmodykacj iskrceniem ostatnich etapw wizualizacji wyniku, jest test EZ4U rmy Biomedica GmbH, Austria (EZ4U. The 4th generation non radioactive cell proliferation & cytotoxicity assay. www.bmgrp.com). Celem pracy byo okrelenie uytecznoci zastosowania EZ4U do oceny cytotoksycznoci doksorubicyny rnych komrek w hodowlach ludzkich imysich linii komrkowych oraz okrelenie powtarzalnoci iprecyzji poredniej wynikw uzyskanych zzastosowaniem testw MTT iEZ4U, atake porwnanie wartoci IC50 uzyskanych wobu metodach.

Test MTT
Przygotowanie zawiesiny komrek Z 24 h hodowli komrek linii L929, HeLa, ME18 iME18/R oraz z72h WS-1, bdcych wfazie wzros tu logarytmicznego uzyskiwano zawiesin komrek przez odklejenie ich od powierzchni naczynia, po trypsynowaniu przez ok. 24 min (0,05% r-r trypsyny zEDTA, Gibco, USA) w37C, 5% CO2 . Liczb komrek w1 ml podoa do hodowli oznaczano zzastosowaniem licznika Coulter Z2. Przed rozpoczciem bada dla kadej linii zoptymalizowano wielko inokulum, ktre zapewniao przynajmniej 70% pokrycia naczynia. Pojedyncze badanie dla okrelonej linii stanowia hodowla komrkowa zaoona rwnolegle na dwch 96-studzienkowych pytkach titracyjnych, przeznaczonych do badania odpowiednio testem MTT iEZ4U. Dla kadej linii przeprowadzono od 2 do 4 niezalenych powtrze badania zzastosowaniem obu testw. Zakadanie hodowli Na pytki titracyjne nanoszono po 200 l zawiesiny komrek/studzienk o optymalnej liczbie komrek/ ml, tj. od 1,5 do 2,75 10 4 k-k/ml, wzalenoci od linii (tabela 1). Hodowle inkubowano przez 24 h dla wikszoci linii, zwyczeniem komrek WS-1, ktre inkubowano 4872 h wwyej opisanych warunkach wcelu przyklejenia si ich do powierzchni. Po inkubacji oceniano wzrost hodowli pod wzgldem pokrycia powierzchni studzienki. Uzyskanie pokrycia powierzchni studzienki wok. 70% pozwalao na kontynuacj dowiadczenia. Bezporednio przed wymian podoa przygotowywano 11-punktowy szereg rozciecze doksorubicyny, osteniu wyjciowym 2mg/ml (Adrimedac, roztwr do wstrzykiwa, 2 mg/ml, Medac, Niemcy) w podou. Dla linii wraliwych szereg ten obejmowa rozcieczenia doksorubicyny od 0,06 do 5,8 g/ml, za dla linii opornej ME18/R, przygotowano dwa szeregi rozciecze doksorubicyny, tj. od 2,9 do 92,8 g/ml oraz od 1,16 do 46,4 g/ml. Kady punkt ookrelonym steniu doksorubicyny by wykonany w 8 powtrzeniach. Podoe po wstpnej inkubacji usuwano izastpowano podoem zodpowiednimi steniami doksorubicyny. Wkontroli, ktr stanowia hodowla bez leku (kolumna 1), wymieniano podoe na wiee. Do kadej kolejnej kolumny studzienek dodawano po 200 l okrelonego rozcieczenia badanej
Tabela 1. Optymalna, wyjciowa gsto komrek dla linii komrkowych uytych woznaczaniu cytotoksycznoci przy uyciu testw EZ4U iMTT
Linia komrkowa ME18 ME18/R HeLa WS-1 L929 Liczba komrek/ml 1,5 10 4 2,5 10 4 2,75 10 4 2,5 10 4 2,5 10 4

Materiay imetody
Badanie obejmowao ocen cytotoksycznoci doksorubicyny zzastosowaniem testu MTT oraz EZ4U i zostao przeprowadzone z zastosowaniem piciu zrnicowanych linii komrkowych.

Linie komrkowe
Wbadaniu zastosowano nastpujce linie komrkowe: 1.  linia ciga broblastw mysich, L929, 2.  linia prawidowych broblastw ludzkich pochodzenia zarodkowego, WS-1, 3.  linia ciga wyprowadzona zkomrek nowotworu szyjki macicy, HeLa, 4.  linia ciga wyprowadzona z komrek ludzkiego czerniaka zoliwego, ME18, 5.  linia ciga, oporna na doksorubicyn, ME18/R wyprowadzona zME18. Linie komrkowe L929 iHeLa pochodziy zbanku German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, linia komrkowa WS-1 z European Collection of Cell Cultures, linia ME18 zostaa przekazana zCentrum Onkologii Instytutu im. Marii SkodowskiejCurie wWarszawie, za ME18/R to podlinia uzyskana dowiadczalnie zME18 wZakadzie Biochemii iBiofarmaceutykw Narodowego Instytutu Lekw [12].

Warunki hodowli
Komrki rosy adhezyjnie w podou MEM (Gibco, USA) zdodatkiem 10% FBS (Gibco, USA) oraz 1% roztworu antybiotykw (Gibco, USA) przygotowanego ze stonego roztworu mieszaniny zawierajcej 10000U/ml penicyliny G, 10 g/ml siarczanu streptomycyny oraz 25 g/ml amfoterycyny B. Hodowle inkubowano watmosferze 5% CO2, wtemp. 37C. Czas podwojenia, DT (ang. doubling time) wikszoci komrek ww. linii wynosi ok. 24 h zwyjtkiem komrek WS-1, dla ktrych wynosi ok. 67 h.
Tom 65 nr 6 2009

397

ywotno komrek w obecnoci okrelonego stenia doksorubicyny obliczano, odnoszc odpowiednio wartoci absorbancji uzyskane dla poszczeglnych ste leku do wartoci absorbancji komrek kontrolnych, przyjmujc absorbancj roztworu dla komrek kontrolnych za 100%. Dla wszystkich badanych linii komrkowych wyznaczono wartoci IC 50 , tj. stenia doksorubicyny, wktrych ywotno komrek badanych linii bya zahamowana w50% hodowli.

Test EZ4U
Hodowle przeznaczone do badania testem EZ4U prowadzono wedug protokou dla testu MTT rwnolegle, do momentu zakoczenia inkubacji hodowli wpodou zdoksorubicyn, zgodnie zzaleceniami producenta (EZ4U. The 4th generation non radioactive cell proliferation & cytotoxicity assay. www.bmgrp. com). Wtym tecie dodatkowo uwzgldniano kontrol zabarwienia podoa dla kadego punktu zszeregu rozciecze doksorubicyny. Kady punkt zszeregu rozciecze by wykonany w 6 powtrzeniach, za kontrola zabarwienia leku wpodou w2powtrzeniach (rycina 1A). Po inkubacji zdoksorubicyn badanie prowadzono zgodnie zprotokoem producenta. Przygotowywano roztwr zawierajcy sl tetrazoliow (odczynnik EZ4U) ibezporednio do kadej studzienki dodawano po 20 l tego odczynnika. Pytk inkubowano przez 4 h wwyej opisanych warunkach, anastpnie mierzono absorbancj wspektrofotometrze mikropytkowym przy dugoci fali =492 i=620, zgodnie zzaleceniami producenta. Pomiar absorbancji przy dugoci fali =620 by dodatkowo zalecony przez producenta wcelu korekty wynikw oto, pochodzce, m.in. od pozostaoci komrek. Podczas obliczania wynikw warto absorbancji mierzona przy dugoci fali =492 bya pomniejszana owarto absorbancji mierzonej przy dugoci fali =620.

Rycina1. Wpyw stenia doksorubicyny wpodou na barw podoa obserwowany po 48h inkubacji hodowli komrek linii MER18/R, A) natychmiast po dodaniu odczynnika EZ4U, B) po 4h inkubacji zodczynnikiem EZ4U. Kierunek wzrostu stenia doksorubicyny zaznaczono strzak (2,992,8 g/ml). K H kontrola hodowli, K D kontrola ta (podoe zdoksorubicyn)

substancji w podou, w kolejnoci od najniszego (kolumna 2) do najwyszego (kolumna 12) stenia. Komrki linii ME18, ME18/R, HeLa, L929 inkubowano przez 48 h, za komrki linii WS-1 przez 72 h wwarunkach opisanych wyej. Po inkubacji komrek zdoksorubicyn podoe usuwano ido kadej studzienki dodawano po 50 l odczynnika MTT osteniu 5 mg/ ml (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Niemcy). Hodowl nastpnie inkubowano przez 4h wwyej wymienionych warunkach. Po inkubacji ogldano wytrcone krysztay formazanu. Pyn znad krysztaw usuwano delikatnie przez odpipetowanie, nastpnie do kadej studzienki dodawano 100 l r-ru DMSO (99,5%) (Labscan Ltd, Irlandia) i agodnie mieszano kilka minut w celu rozpuszczenia krysztaw. Absorbancj roztworw mierzono spektrofotometrycznie przy dugoci fali 492 nm zzastosowaniem czytnika pytek iEMS Reader MF (Labsystems Oy, Finlandia).
Tabela 2. Porwnanie wartoci IC 50 doksorubicyny uzyskanych dla poszczeglnych linii komrkowych wzalenoci od testu zastosowanego wtej pracy zuwzgldnieniem precyzji poredniej otrzymanych wynikw (%RDSm)
Linia komrkowa ME18 ME18/R HeLa WS-1 L929 MTT IC50 wg/ml [M] 0,6 [1,1] >92,8 [170,7] 0,28 [0,5] 0,21 [0,39] 0,22 [0,4] %RSDm 20,5 nie wyznaczono 24,2 32,6 35,2 EZ4U IC50 wg/ml [M] 0,25 [0,46] 34,4 [63,3] 0,27 [0,49] 0,44 [0,8] 0,52 [0,95] %RSDm 12,0 5,8 11,2 5,8 4,0

Wyniki Optymalizacja liczby komrek

Optymalne inokulum dobrane do uytych testw byo zrnicowane wzalenoci od uytej linii. Najnisz gsto, tj. 1,510 4/ml wyznaczono dla linii MER18, najwysz za 2,7510 4/ml dla linii HeLa, dla pozostaych linii gsto ta bya jednakowa i wynosia 2,510 4/ml, szczegowe wyniki przedstawia tabela 1.

Porwnanie wartoci IC50 dla poszczeglnych linii wzalenoci od zastosowanego testu

Wartoci IC50 uzyskane zzastosowaniem testw MTT i EZ4U dla poszczeglnych linii komrkowych przedstawione zostay wtabeli 2 oraz na rycinie 2. Porwnywalne wartoci IC50 uzyskano dla HeLa (0,28 wMTT i0,27 g/ml wEZ4U). Dla komrek linii WS-1 iL929 wtecie MTT uzyskano blisko dwukrotnie nisze wartoci IC50 , ni wEZ4U (odpowiednio 0,21
Tom 65 nr 6 2009

398

P R A C A O R Y G I N A L N A T E S T Y D IAGNO S T YC Z N E

MTT ME18
% przeywalnoci komrek 120 100 80 60 40 20 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 stenie doksorubicyny [g/ml] % przeywalnoci komrek

EZ4U ME18
powt. 1 powt. 2 powt. 3

120 100 80 60 40 20 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

IC50=0,60 (20,5%)

IC50=0,25 (12,0%)

powt. 1 powt. 2 powt. 3

3,0

stenie doksorubicyny [g/ml]

MTT ME18R
% przeywalnoci komrek 120 100 80 60 40 20 0 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 % przeywalnoci komrek
powt. 1 powt. 2 powt. 3

EZ4U ME18R
120 100 80 60 40 20 0 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

IC50=34,4 (5,8%)

powt. 1 powt. 2 powt. 3 powt. 4

stenie doksorubicyny [g/ml]

stenie doksorubicyny [g/ml]

MTT HeLa
% przeywalnoci komrek 120 100 80 60 40 20 0 0,0 1,0 2,0 3,0 % przeywalnoci komrek 120 100 80 60 40 20 0 0,0 0,5

EZ4U HeLa
powt. 1 powt. 2 powt. 3 powt. 4

IC50=0,22 (24,2%)

IC50=0,27 (11,2%)

powt. 1 powt. 2 powt. 3

1,0

1,5

2,0

stenie doksorubicyny [g/ml]

stenie doksorubicyny [g/ml]

% przeywalnoci komrek

% przeywalnoci komrek

120 100 80 60 40 20 0 0,0

MTT WS-1
IC50=0,21 (32,6%)
powt. 1 powt. 2 powt. 3

120 100 80 60 40 20 0 0,0

EZ4U WS-1
IC50=0,44 (5,8%)
powt. 1 powt. 2 powt. 3

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

stenie doksorubicyny [g/ml]

stenie doksorubicyny [g/ml]

% przeywalnoci komrek

100 80 60 40 20 0 0,0

IC50=0,22 (35,2%)

powt. 1 powt. 2 powt. 3

% przeywalnoci komrek

120

MTT L929

120 100 80 60 40 20 0 0,0

EZ4U L929
powt. 1 powt. 2

IC50=0,52 (4,0%)

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

10,0

20,0

30,0

40,0

stenie doksorubicyny [g/ml]

stenie doksorubicyny [g/ml]

Rycina2. Zaleno przeywalnoci komrek (%) od stenia doksorubicyny (g/ml) okrelona dla poszczeglnych linii komrkowych wtestach MTT iEZ4U. Poszczeglne powtrzenia badania odzwierciedlaj odpowiednie kolory wykrelonych krzywych
Tom 65 nr 6 2009

399

i0,22 g/ml vs. 0,44 i0,52 g/ml wMTT). Dla komrek ME18 wtecie MTT warto IC50 bya 2,4 razy wysza ni wtecie EZ4U (0,6 wMTT vs. 0,25 g/ml). Dla komrek linii opornej ME18/R nie okrelono konkretnej wartoci IC50 wtecie MTT, warto ta bya wysza od grnego zakresu stenia dla doksorubicyny, tj, wysza ni 92,8 g/ml iokoo trzykrotnie przekraczaa warto IC50 uzyskan dla komrek tej linii wtecie EZ4U (34,4 g/ml).

dla poszczeglnych linii zakresy byy jeszcze szersze iwahay si od kilku do nieco ponad 20%. Wtecie EZ4U odpowiednio wartoci rednie %RDSw oscyloway midzy 4,9 dla komrek ME18 i6,4 dla komrek L929, przy czym dla poszczeglnych linii wahay si od kilku do 13,6%. rednie wartoci %RDSm (tabela 2) dla testu MTT wahay si wgranicach od 20,5 do ponad 35%, za dla testu EZ4U midzy 4 i12%.

Strategia opracowania statystycznego uzyskanych wynikw

Wyniki badania cytotoksycznoci przedstawiono dla kadej linii komrkowej wpostaci zalenoci stopnia przeywalnoci komrek (wyraonego wprocentach) od stenia, doksorubicyny (g/ml) (rycina 2). Zaleno ta zostaa zobrazowana dla kadego powtrzenia badania iuytej linii komrkowej, w postaci linii o okrelonych kolorach na wykresach, przypisanych kolejnym powtrzeniom badania, dla obu zastosowanych testw MTT oraz EZ4U. Wyniki poddano obrbce statystycznej, wyznaczajc zmienno wewntrz- i midzyeksperymentaln, ktre wyraono liczbowo i oznaczono odpowiednio skrtami: RSDw i RSDm [13]. Zmienno wewntrzeksperymentalna odzwierciedlaa powtarzalno, za midzyeksperymentalna precyzj poredni uzyskaDo oceny cytotoksycznoci nych wynikw IC 50 ( tabele2i3). RSDw oznaczao redni obliczosubstancji dostpnych n z uzyskanych wartoci wzgldjest dzi wiele testw nego odchylenia standardowego we komercyjnych, ktre jako wszystkich powtrzeniach badania substrat wykorzystuj dla kadego punktu zszeregu rozciesl tetrazoliow, cze, przy czym dla testu MTT odprzeksztacan pod powiednio z8-krotnego powtrzenia wpywem dehydrogenazy punktu, za dla testu EZ4U z6-krotwbarwny, rozpuszczalny nego i wyraona bya w procentach zwizek, nieza wkrysztay (%RSDw) [13]. Wtabeli 3 przedstawioformazanu. Taka modykacja no rednie wartoci zmiennoci weskraca procedur iupraszcza wntrzeksperymentalnej dla kadej kocowy etap wizualizacji linii zrozrnieniem uytego testu. wynikw, przez co zmniejsza Zmienno midzyeksperymentalryzyko bdu laboratoryjnego. na (RSDm), wyraona w procentach, okrelaa precyzj poredni wynikw uzyskiwanych danym testem. Zostaa obliczona na podstawie powtarzalnoci wartoci IC 50 wyznaczonych zliniowych fragmentw krzywych przedstawiajcych zaleno przeywalnoci komrek od stenia doksorubicyny [13]. Wtabeli2 przedstawiono wartoci IC50 uzyskane dla obu porwnywanych testw.

Omwienie wynikw
Wniniejszej pracy porwnywano dwa testy, wykrywajce aktywno mitochondrialnego enzymu dehydrogenazy bursztynianowej przez redukcj soli tetrazoliowej do formazanu. Wtecie MTT powstaje nierozpuszczalny w rodowisku wodnym formazan w formie krysztaw, za w tecie EZ4U rozpuszczony wpodou, rwnie zredukowany zwizek soli tetrazoliowej [1; EZ4U. The 4th generation non radioactive cell proliferation & cytotoxicity assay. www. bmgrp.com]. Wzwizku zniewielk rnic zwizan z powstajcym produktem kocowym, testy te byy nieznacznie zrnicowane pod wzgldem technicznym. Porwnawcze badania cytotoksycznoci doksorubicyny rozpoczto od optymalizacji wyjciowej liczby komrek wml, zastosowanej wprowadzonych badaniach. Ustalenie tego parametru i zapewnienie powtarzalnych warunkw podczas dowiadczenia miao bardzo istotny wpyw na wyznaczan warto IC 50 ijej powtarzalno, awic na jako wyniku. Wyznaczone wopisany wyej sposb optymalne inokulum zapewniao wkadym przypadku uzyskanie wostatnim dniu badania 90100% pokrycia powierzchni studzienek kontrolnych. Wwielu pracach wykazano wpyw wyjciowej gstoci komrek na wartoci absorbancji iIC50 [2, 14]. Wstpna optymalizacja gstoci komrek nanoszonych na pytk mikrotitracyjn na podstawie oceny stopnia pokrycia po 24h i72h, miaa na celu okrelenie bezpiecznej gstoci, tj. takiej, ktra nie wpynaby hamujco na aktywno proliferacyjn komrek. W omawianej pracy do bada cytotoksycznoci wybrano doksorubicyn, tj. lek odobrze udokumentowanej aktywnoci cytotoksycznej, ktry jest stosowany w farmakoterapii rnego rodzaju chorb nowotworowych [3, 12]. Wzwizku ztym, wnastpnej kolejnoci dobrano rne linie komrkowe, wwikszoci nowotworowe [12, 15, 16]. Wcelu porwnania zblionych ze sob wmechanizmie dziaania testw MTT iEZ4U, zaplanowano du liczb powtrze kadego zpunktw szeregu rozciecze leku wpojedynczym eksperymencie. Zzamieszczonych danych wynika, e redni %RSDw zmiennoci wewntrzeksperymentalnej by o ok. 3,5% wyszy wtecie MTT ni wEZ4U iwynosi 7,110,9%. Wartoci
Tom 65 nr 6 2009

Porwnanie wartoci zmiennoci wewntrzimidzyeksperymentalnej

rednie wartoci %RDSw (tabela 3) wyznaczone dla testu MTT ksztatoway si wzakresie od 7,1 dla komrek HeLa do 10,9% dla komrek ME18, przy czym 400

P R A C A O R Y G I N A L N A T E S T Y D IAGNO S T YC Z N E

uzyskane dla rednich wartoci %RSDw wtecie EZ4U mieszcz si w zakresie 4,96,4%. Zmienno wewntrzeksperymentaln stanowi bd powtarzalnoci uzyskany dla punktw wyznaczajcych krzyw, za zmienno midzyeksperymentaln wyznaczono na podstawie powtarzalnoci wartoci IC 50 , wyznaczonej zliniowej zalenoci fragmentu wykresu, przedstawiajcego zaleno stopnia zahamowania ywotnoci komrek od stenia doksorubicyny. Okrelajc redni warto %RSDm dla obu testw zastosowanych wtej pracy, ktr wyznaczono z24 niezalenych powtrze badania danej linii komrkowej (tabela 3), wyznaczono precyzj poredni, tj. powtarzalno wartoci IC50 dla obu testw. Uzyskane dane przedstawiono wtabeli 2. Wykazano, e powtarzalno wartoci IC 50 dla wszystkich uytych linii jest rwnie wiksza wtecie EZ4U. Rozrzut uzyskanych wartoci mieci si wprzedziale 4,012,0%, podczas gdy wtecie MTT zakres wartoci %RSDm oscylowa od kilku do 20,5%. Biorc pod uwag rozpito zastosowanych ste doksorubicyny oraz uwzgldniajc bd wyznaczenia wartoci IC 50 (%RSD), stwierdzono, e oprcz komrek linii ME18/R, dla pozostaych linii komrkowych zrnicowanie wartoci IC50 uzyskanych wobu testach jest nieistotne statystycznie, co pozwala uzna oba testy za porwnywalne pod wzgldem dokadnoci oznaczenia. Otrzymane wyniki powtarzalnoci midzyeksperymentalnej koreluj z wczeniej przedstawionymi wynikami dla powtarzalnoci wewntrzeksperymentalnej. Mniejsza dokadno wyznaczania odsetka przeywajcych komrek w tecie MTT (wysze %RSDw), pociga za sob wyszy bd (%RSDm) wyznaczania wartoci IC 50 . Dla komrek linii ME18/R nie udao si wyznaczy wartoci IC 50 w wybranym zakresie ste doksorubicyny. Przy najwyszym badanym steniu doksorubicyny 92,8 g/ml wtecie MTT uzyskano ok. 65% ywych komrek wstosunku do kontroli. Wtecie EZ4U dla komrek tej linii wyznaczono IC 50 na poziomie 34,4 g/ml, co wiadczy oopornoci tej linii na badany lek. Porwnujc wartoci IC 50 uzyskane wobu testach dla komrek linii ME18 (wraliwej) stwierdzono, e wartoci uzyskane wtecie MTT s ok. 2,5-krotnie wysze ni w tecie EZ4U. Zaobserwowana zaleno moe dotyczy obu linii, co wyjaniaoby fakt wystpowania wartoci IC50 powyej wartoci 92,8 g/ml. Warto ponadto zauway, e rwnie dla komrek ludzkiego czerniaka ME18, wtecie MTT uzyskano najwyszy redni bd (10,9%) oraz rozrzut wartoci %RSDw zmiennoci wewntrz eksperymentalnej (1,721,2%). Podczas wykonywania dowiadcze dla komrek linii ME18 i ME18/R stwierdzono zmniejszon adhezyjno komrek tych linii do podoa, wporwnaniu do pozostaych rodzajw linii komrkowych, uytych wbadaniach. Wynika
Tom 65 nr 6 2009

ztego, e powysza cecha komrek moe bezporednio wpywa na precyzj poredni metody (zmienno midzyeksperymentaln). Podczas wymiany podoa atwo bowiem oprzypadkowe usunicie komrek ze studzienek na pytce. Wtecie MTT, oprcz wymiany poywki hodowlanej na podoe zlekiem, dokonuje si jeszcze jednej wymiany, gdy podoe zlekiem zastpuje si odczynnikiem MTT. Poniewa komrki s osabione dziaaniem substancji cytotoksycznej (wtym przypadku doksorubicyny), atwo ulegaj odklejaniu od podoa. Im mniej adherentne komrki, tym atwiej owprowadzenie do dowiadczenia bdu eksperymentalnego. Wtecie EZ4U nie ma tego drugiego etapu, poniewa odczynnik ten dodaje si bezporednio do podoa zlekiem (nie ma etapu usuwania podoa, tak jak wMTT) ipo 4h inkubacji nastpuje bezporedni odczyt absorbancji roztworu. Innowacyjno tego rozwizania eliminuje jeszcze jeden, bardzo krytyczny etap, wystpujcy wstandardowo przeprowadzanym tecie MTT, a powodujcy pojawianie si przypadkowych bdw imajcy duy wpyw na warto IC 50 , tj. etap usuwania niezwizanego odczynnika MTT, wcelu rozpuszczenia wDMSO powstaych wwyniku reakcji krysztaw formazanu. Podczas usuwania odczynnika MTT czsto obserwowano przypadkowe odrywanie si krysztaw, co wpywao na zmian zabarwienia roztworu poddawanego pomiarowi absorpcji. Najwikszy tego typu problem stwierdzono podczas pracy zkomrkami linii ME18/R, gdzie wkontroli wystpowao bardzo duo krysztaw sabo przyklejonych do podoa. Podczas wymiany odczynnika MTT na DMSO, dua ich liczba ulegaa przypadkowemu usuniciu, co znacznie obniao warto odniesienia dla pozostaych wynikw, bdnie zawyajc przedstawion na wykresie zaleno przeywalnoci od stenia (rycina 1). Mogo to przyczyni si do znacznego zawyenia wartoci IC 50 dla tej linii i braku wyznaczenia wartoci IC50 , w ustalonym zakresie ste dla doksorubicyny. Wtecie EZ4U taki problem nie wystpowa, dla-

Tabela 3. Porwnanie wartoci zmiennoci wewntrz eksperymentalnej (RSD testw MTT iEZ4U powtarzalno metody
MTT Linia komrkowa ME18 ME18/R HeLa WS-1 L929 %RSDw (warto min imax) 10,9 (1,721,2) 7,25 (1,2212,2) 7,1 (0,011,5) 9,6 (2,220,5) 9,9 (3,415,0) Liczba bada 3 3 4 3 3 EZ4U %RSDw (warto min imax) 4,9 (1,611,2) 5,6 (0,413,6) 5,7 (1,512,1) 5,4 (1,39,9) 6,4 (2,310,4) Liczba bada 3 4 3 3 2

401

tego udao si wyznaczy warto IC 50 dla ME18/R na poziomie 34,4 g/ml. Wtecie EZ4U zaobserwowano wyrany wpyw barwy doksorubicyny na warto absorbancji. Wysokie stenia doksorubicyny spowodoway widoczn zmian barwy podoa, co obrazuje rycina2. Rycina ta przedstawia obraz pytki natychmiast po dodaniu odczynnika EZ4U (A) widoczny jest wzrost intensywnoci barwy wraz ze wzrostem stenia doksorubicyny (od lewej do prawej strony pytki) oraz po 4h inkubacji z odczynnikiem EZ4U (B) widoczne jest zrnicowanie intensywnoci barwy doksorubicyny zalene od jej stenia, szczeglnie wdwch dolnych szeregach studzienek, stanowicych kontrol zabarwienia ta. Z uwagi na zaobserwowany, wizualnie iwpomiarach (dane niezamieszczone), wpyw barwy doksorubicyny na wartoci absorbancji podczas oblicze, wartoci absorbancji uzyskane zhodowli po inkubacji zodczynnikiem EZ4U pomniejszano owartoci absorbancji uzyskane dla kontroli zszeregiem odpowiednich rozciecze doksorubicyny. Ze wzgldu na wykazany wtej pracy wpyw barwy doksorubicyny na kocowe wartoci absorbancji, pojawia si wniosek, e dla badania barwnych substancji protok oznaczania cytotoksycznoci zaproponowany przez wytwrc testu, powinien uwzgldnia kontrol zabarwienia. W przeciwnym wypadku zmiana absorbancji, bdca wynikiem wpywu barwy badanej substancji, moe znaczco wpywa na uzyskiwane wyniki. Podejmujc badania cytotoksycznoci warto ju na wstpie przeprowadzi optymalizacj przebiegu eksperymentu, m.in. pod wzgldem doboru linii komrkowej, liczby komrek, czasu inkubacji zbadan substancj oraz doboru waciwych kontroli. Wnaszej pracy wyduenie czasu inkubacji zdoksorubicyn do 48 h dla wikszoci linii komrkowych i72 h dla WS-1 byo zwizanie zprb uzyskania wyraniejszych efektw dziaania tego leku na badane komrki. Badania cytotoksycznoci substancji uywanych w farmakoterapii nowotworw [13] s najczciej wykonywane zzastosowaniem uznanych isprawdzonych eksperymentalnie testw opartych na redukcji formazanu. Nie zawsze jednak te testy mog by stosowane wocenie cytoksycznoci. Przy badaniu lekw wpywajcych na obnienie wewntrzkomrkowego poziomu wolnych rodnikw pojawiaj si zmiany komrkowe, ktre mog wpywa na wzrost ywotnoci komrek ijednoczenie na wyniki tych bada. Wykazano np., e obecno ufenazyny, leku antypsychotycznego, o aktywnoci, m.in. chemioprewencyjnej wobec komrek nowotworowych, whodowli komrkowej limfocytw moe wpywa na ocen cytotoksycznoci leku z zastosowaniem MTT [8]. W takich

sytuacjach sugeruje si zwykle zastosowanie dodatkowych technik, umoliwiajcych badanie innych zmian cytotoksycznych, wywoanych przez zmian innych procesw komrkowych. Podsumowujc, na podstawie uzyskanych wynikw badania cytotoksycznoci doksorubicyny z zastosowaniem dwch testw, EZ4U iMTT oraz piciu zrnicowanych linii komrkowych, stwierdzono, e obie techniki s uyteczne wbadaniach cytotoksycznoci. Wartoci IC 50 uzyskane z zastosowaniem testu EZ4U charakteryzoway si znacznie mniejsz zmiennoci wewntrz- i midzyeksperymentaln, aprzez to wysz powtarzalnoci oraz precyzj poredni. Test ten pozwoli na okrelenie wartoci IC50 dla wszystkich badanych linii, by przy tym atwiejszy wwykonaniu imniej czasochonny ni MTT. Autorzy skadaj podzikowania dr Beacie Gruber za krytyczne przeczytanie manuskryptu tej pracy icenne uwagi.
Otrzymano: 2009.02.24 Zaakceptowano: 2009.03.10

Pimiennictwo
1. Niu Q., Zhao C., Jing Z.: An evaluation of the colorimetric assays based on enzymatic reactions used in the measurement of human natural cytotoxicity. J. Immunol. Methods 2001, 251, 1-2, 11-19. 2. Bopp S.K., Lettieri T.: Comparison of four dierent colorimetric and uorometric cytotoxicity assays in a zebrash liver cell line. BMC Pharmacol. 2008, 8, 8. 3. Dorobek ., Szczeniak P., Thor P. iwsp.: Aktualne kierunki poszukiwania nowych lekw przeciwnowotworowych. Geriatria 2008, 2,. 37-46. 4. Chiba K., Kawakami K., Tohyama K.: Simultaneous evaluation of cell viability by neutral red, MTT and crystal violet staining assays of the same cells. Toxicology in vitro 1998, 12, 3, 251-258. 5. Fotakis G., Timbrell J.A.: In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicol. Lett. 2006, 160, 2, 171177. 6. Crouch S.P., Kozlowski R., Slater K.J. iwsp.: The use of ATP bioluminescence as ameasure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods 1993, 160, 1,81-88. 7. Boojar M.M., Goodarzi F.: Cytotoxicity and the levels of oxidative stress parameters in WI38 cells following 2 macrocyclic crown ethers treatment. Clin. Chim. Acta 2006, 364, 1-2, 321-327. 8. Jaszczyszyn A, Gsiorowski K.: Limitations of the MTT assay in cell viability testing. Adv. Clin. Exp. Med. 2008, 17, 5, 525-529. 9. Voigt W.: Sulforhodamine B assay and chemosensitivity. Methods. Mol. Med. 2005, 110, 39-48. 10. Mossman T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application for proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. 1983, 65, 55-63. 11. Vistica D.T., Skehan P., Scudiero D. iwsp.: Tetrazolium-based assays for cellular viability: acritical examination of selected parameters aecting formazan production. Cancer Res. 1991, 51, 10, 2515-20. 12. Anuszewska E., Gruber B., Koziorowska J.: Studies on adaptation to adriamycin in cells pretreated with hydrogen peroxide. Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 5, 597-603. 13. Ermer J., McB. Miller J.H.: Method validation in pharmaceutical analysis. Aguide to best practice. Wiley-Vch Verlag GmbH& Co. KGaA, Weinheim 2005, S. 21-51. 14. Gruber B., Anuszewska E.: Adaptacja testu do oceny dziaania cytotoksycznego in vitro. Biuletyn Instytutu Lekw 1994, 38, 3, 5-10.

402

Tom 65 nr 6 2009