EVALUACIN DE LA OBTENCIN DE BIOETANOL A PARTIR DEL ALMIDN DE AME (DIOSCOREA ROTUNDATA, DIOSCOREA ALATA Y DIOSCOREA TRFIDA) MEDIANTE LA HIDRLISIS

ENZIMTICA Y POSTERIOR FERMENTACIN.

JOSE DAVID MURGAS TORRES MIGUEL ANGEL VASQUEZ MONTERROSA

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA FACULTAD DE INGENIERAS, ARQUITECTURA, ARTE Y DISEOS PROGRAMA DE INGENIERA QUMICA CARTAGENA 2012

EVALUACIN DE LA OBTENCIN DE BIOETANOL A PARTIR DEL ALMIDN DE AME (DIOSCOREA ROTUNDATA, DIOSCOREA ALATA Y DIOSCOREA TRFIDA), MEDIANTE LA HIDRLISIS ENZIMTICA Y POSTERIOR FERMENTACION.

JOSE DAVID MURGAS TORRES MIGUEL ANGEL VASQUEZ MONTERROSA

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al ttulo de Ingeniero Qumico

Asesora Externa Adriana Alejandra Prez Bacteriloga

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA FACULTAD DE INGENIERAS, ARQUITECTURA, ARTE Y DISEOS PROGRAMA DE INGENIERA QUMICA CARTAGENA 2012

Nota de aceptacin

Firma del Presidente del jurado

Firma del jurado

Firma del jurado

Cartagena,Mayo de 2012

DEDICATORIA

Celebramos el fin de una etapa importante en nuestra vida dando las gracias, principalmente a nuestro seor Dios que nos permiti compartir este tiempo de enseanza necesaria para nuestra formacin. A mi querida madre Mara Lourdes por luchar junto a m en la bsqueda de mis objetivos, por su educacin y valores inculcados a lo largo de mi vida. A mis amigos y todos lo que hicieron parte de esta formacin, por brindarme siempre palabras de aliento y el apoyo en los momentos difciles. Dedico esto a una persona muy especial que ha sido una fuente inagotable de luz para m, que me ha brindado su confianza y que siempre estuvo ah, para apoyarme cuando lo necesite, la persona que considero como mi padre; por ese motivo gracias te doy mi querido to Jonny Torres Saurith, gracias por su apoyo incondicional.

JOSE DAVID MURGAS TORRES

DEDICATORIA

A dios principalmente ya que gracias a l todo esto fue posible A m querida madre Milagros Monterrosa quien con mucho sacrificio me saco adelante durante todos estos aos, siempre estuvo apoyndome en las buenas y en las malas, le doy las gracias por su comprensin y paciencia, por creer en m en la adversidad, por darme t ejemplo y educacin me ayudaste a ser una mejor persona. A mi ta Carmenza Monterrosa quien siempre estuvo a lo largo del desarrollo de mi carrera apoyndome. A mi ta Marina quien a pesar de la distancia me dio su apoyo y consejo. A mis dems tas Clara y Raquel quienes siempre estuvieron pendientes de mi proceso y me brindaron su cario y comprensin. A mi hermana Gina por ser fuente de alegra en todo momento. A mis amigos Mara, Carlos y Fabin con quienes pude compartir alegras y tristezas, gracias por su amistad incondicional.

Miguel ngel Vsquez Monterrosa

AGRADECIMIENTOS El desarrollo y culminacin de este proyecto se debe al apoyo de todas aquellas personas que nos brindaron sus conocimientos y experiencia. Expresamos nuestros ms sinceros agradecimientos: A nuestros padres, familiares y amigos que estuvieron siempre presente en cada uno de nuestros felices y difciles, brindndonos su apoyo de manera incondicional.

A la Universidad de San Buenaventura por la excelente formacin acadmica brindada, logrando formar profesionales integrales.

A Adriana Alejandra Prez, Bacteriloga quien estuvo asesorndonos en el desarrollo del proyecto de grado.

Al personal de los laboratorios: Aissa Rodrguez, Rosa Rangel, Carmen Muskus y Alma Estrada por brindarnos su ayuda incondicional.

A todos muchas gracias.

CONTENIDO 1 PROBLEMA DE INVESTIGACIN 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.2 FORMULACIN DEL PROBLEMA 1.3 JUSTIFICACIN 1.4 OBJETIVOS 1.4.1 Objetivo general 1.4.2 Objetivos especficos 2 MARCO DE REFERENCIA 2.1 ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS 2.1.1 Historia del etanol 2.1.2 Estado actual en Latinoamrica 2.2 BASES TERICAS 2.2.1 ame 2.2.2 Dioscorea Alata 2.2.3 Dioscorea Trfida 2.2.4 Dioscorea Rotundata 2.2.5 Produccin Mundial de ame 2.2.6 Produccin de ame en Colombia 2.2.7 Almidn 2.2.8 Hidrolisis 2.2.9 Hidrolisis Qumica 2.2.10 Hidrolisis Enzimtica 2.2.11 Fermentacin 2.2.12 Etanol 2.2.13 Destilacin 2.3 MARCO LEGAL 2.4 MARCO CONCEPTUAL 3 DISEO METODOLGICO 3.1 TIPO DE INVESTIGACIN 3.2 POBLACIN Y MUESTRA 3.3 METODOLOGA UTILIZADA EN EL PROYECTO 3.3.1 Obtencin de la harina de ame 3.3.2 Hidrlisis enzimtica 3.3.3 Fermentacin 3.3.4 Destilacin 3.4 RECOLECCION DE LA INFORMACION 3.4.1 Fuentes primarias 3.4.2 Fuentes secundarias 3.5 INSTRUMENTOS 3.5.1 Instrumentos y equipos 3.5.2 Materias primas y reactivos 3.6 HIPOTESIS 3.6.1 Hiptesis nula I Pag 1 1 4 4 5 5 5 6 6 6 7 10 10 11 12 13 14 15 16 20 21 22 24 38 40 42 44 46 46 48 48 48 50 52 56 56 56 56 57 57 57 58 58

3.6.2 Hiptesis alternativa 3.7 VARIABLES 3.7.1 Variables Independientes 3.7.2 Variables Dependientes 3.8 OPERACIONALIZACIN DE VARIABLES 3.9 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIN 4 RESULTADOS 4.1 Comportamiento de Dioscorea Alata en la hidrlisis enzimtica 4.2 Comportamiento de Dioscorea Trfida en la hidrlisis enzimtica 4.3 Comportamiento de Dioscorea Rotundata en la hidrlisis enzimtica 4.4 Lectura de pH 4.4.1 Lectura de pH para Dioscorea Alata 4.4.2 Lectura de pH para Dioscorea Trfida 4.4.3 Lectura de pH para Dioscorea Rotundata 4.5 Lectura de BRIX 4.5.1 Lectura de BRIX para Dioscorea Alata. 4.5.2 Lectura de BRIX para Dioscorea Trfida 4.5.3 Lectura de BRIX para Dioscorea Rotundata 4.6 Lectura de azucares reductores en la fermentacin. 4.6.1 Lectura de azucares reductores para Dioscorea Alata 4.6.2 Lectura de azucares reductores para la Dioscorea Trfida 4.6.3 Lectura de azucares reductores para Dioscorea Rotundata 4.7 Conteo de microorganismos 4.7.1 Conteo de microorganismos para Dioscorea Alata 4.7.2 Conteo de microorganismos para Dioscorea Trfida 4.7.3 Conteo de microorganismos para Dioscorea Rotundata 4.8 Produccin de etanol 4.8.1 Produccin de etanol de Dioscorea Alata 4.8.2 Produccin de etanol de Dioscorea Trfida 4.8.3 Produccin de etanol de Dioscorea Rotundata 4.9 Rendimientos del proceso 4.9.1 Rendimiento para Dioscorea Alata . 4.9.2 Rendimiento para Dioscorea Trfida 4.9.3 Rendimiento para Dioscorea Rotundata 4.10 ANLISIS ESTADSTICO 5 CONCLUSIONES 6 RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS

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II

LISTA DE FIGURAS Pag Figura 1. Lnea de tiempo de utilizacin de bioetanol a nivel mundial. Figura 2. Imagen sobre hojas de Dioscorea (izquierda) y morfologa del ame (derecha) Figura 3. Hojas D. Alata (izquierda) y tubrculo (derecha) Figura 4. Hoja de D.Trfida (izquierda) y tubrculo (derecha) Figura 5. Hojas de D. Rotundata (izquierda) y tubrculo (derecha) Figura 6. Produccin de ame en los departamentos de Colombia ao 2010 Figura 7. Estructura del almidn Figura 8. Esquema del proceso de glucolisis. Figura 9. Esquema de distintas formas de levadura Figura 10. Diagrama de la estructura de una levadura Figura 11. Curva de crecimiento de un microorganismo Figura 12. Diagrama de flujo de un proceso de destilacin Figura 13. Equipo de destilacin simple Figura 14. Proceso de extraccin de harina de ame Figura 15. Esquema general del proceso de hidrlisis Figura 16. Hidrolizados Esterilizados Figura 17. Fermentadores usados Figura 18. Toma de muestras Figura 19. Lecturas de pH Figura 20. Montaje del equipo de Destilacin III 6 10

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18 27 34 35 37 42 42 49 52 53 54 55 55 56

LISTA DE GRAFICAS. Pag Grfica 1. Comportamiento de azucares reductores en la hidrlisis enzimtica de D. Alata Grfica 2. Comportamiento Brix en la hidrolisis enzimtica de D. Alata Grfica 3. Comportamiento azucares reductores en la hidrlisis enzimtica de D. Trfida. Grfica 4. Comportamiento Brix en la hidrlisis enzimtica de D. Trfida. Grfica 5. Comportamiento azucares reductores en la hidrlisis enzimtica de D. Rotundata. Grfica 6. Comportamiento Brix en la hidrlisis enzimtica de D. Rotundata. Grfica 7. Comportamiento del pH durante la fermentacin de D. Alata. Grfica 8. Comportamiento del pH durante la fermentacin de D. Trfida. Grfica 9. Comportamiento del pH durante la fermentacin de D. Rotundata. Grfica 10. Comportamiento del descenso de Brix durante la fermentacin de D. Alata. Grfica 11. Comportamiento del descenso de Brix durante la fermentacin de D. Trfida. Grfica 12. Comportamiento del descenso de Brix durante la fermentacin de D. Rotundata. Grfica 13. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentacin de D. Alata. IV 61

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Grfica 14. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentacin de D. Trfida Grfica 15. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentacin de D. Rotundata Grfica 16. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentacin de D. Alata Grfica 17. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentacin de D. Trfida Grfica 18. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentacin de D. Rotundata Grfica 19. Comportamiento de la produccin de alcohol durante la fermentacin de D. Alata Grfica 20. Grfico de medias variedad Dioscorea Alata Grfica 21. Comportamiento de la produccin de alcohol durante la fermentacin de D. Trfida. Grfica 22. Grfico de medias de la variedad Dioscorea Trfida Grfica 23. Comportamiento de la produccin de alcohol durante la fermentacin de D. Rotundata Grfica 24. Grfico de medias de la variedad Dioscorea Rotundata

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LISTA DE TABLAS Pag Tabla 1. Produccin de ame A nivel Mundial ao 2005. Tabla 2. Almidn presente en diferentes alimentos. Tabla 3. Compuestos producidos por el proceso de fermentacin. Tabla 4. Metabolitos microbianos comerciales. Tabla 5. Tamao de clulas en procesos Biotecnolgicos. Tabla 6. Cantidad de ame utilizada en el proceso Tabla 7. Condiciones de la enzima Amilasa Tabla 8. Condiciones de la enzima AMG (Amiloglucosidasa) Tabla 9. Condiciones en el proceso de la fermentacin Tabla 10. Equipos e instrumentos laboratorio Tabla 11.Lista de materias primas y reactivos Tabla 12. Operacionalizacin de las variables 15 19 29 29 34 49 51 51 53 57 57 59

VI

RESUMEN

Hoy en da la bsqueda de energas alternativas y su utilizacin se ha convertido en una de las principales preocupaciones y desafos para la humanidad. De seguir as, con el consumo desaforado de los combustibles fsiles, el futuro de la humanidad y del planeta se prev desastroso debido al acelerado ritmo de contaminacin y al gran impacto que se ha generando en la capa de ozono por su combustin. Por lo planteado anteriormente esta investigacin tiene como finalidad realizar la evaluacin de la obtencin de etanol a partir de tres variedades de ame como sustrato,mediante el proceso de hidrlisis enzimtica y posterior fermentacin, teniendo en cuenta las propiedades que posee este tubrculo y sualta produccin en las zonas regionales, con lo que se busca darle un valor agregado al uso de este producto agrcola. De acuerdo a lo planteado anteriormente, en el primer captulo del proyecto se realiz el planteamiento y la formulacin del problema, en donde se destaca la importancia de evaluar un nuevo sustrato (ame) para la obtencin de etanol y utilizarlo como alcohol carburante y as minimizar las emisiones de gases en la atmsfera reduciendo as el impacto ambiental, tambin se proponen los objetivos los cuales deben ser alcanzables para que la investigacin sea valedera. En el segundo y tercer captulo, se recopilaron las investigaciones realizadas previamente a esta investigacin, las bases tericas que fundamentan la investigacin y se planteo la metodologa empleada para la obtencin de los resultados, adems se establece las fuentes de informacin utilizadas y la descripcin de las variables implicadas en el proceso. En el captulo 5 y 6 se encuentran las conclusiones y recomendaciones que se pudieron extraer del proyecto, que servirn como punto de referencia a futuros investigadores que decidan indagar o explorar en este campo o que deseen llevar a cabo el proceso a escala piloto o industrial

VII

ESTUDIO DE LA OBTENCIN DE BIOETANOL A PARTIR DEL ALMIDN DE AME (DIOSCOREA ROTUNDATA, DIOSCOREA ALATA Y DIOSCOREA TRFIDA), MEDIANTE LA HIDRLISIS ENZIMATICA Y POSTERIOR FERMENTACIN. 1. PROBLEMA DE INVESTIGACIN

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Histricamente las fuentes de energa que se han utilizado en el desarrollo de muchos procesos (el transporte, las fbricas, la calefaccin y las industrias de generacin de energa elctrica) son los combustibles fsiles (petrleo, carbn y gas natural). Por eso estos compuestos son claves en el desarrollo de la vida y sociedad de nuestro planeta. Debido al agotamiento progresivo de los combustibles fsiles, en los ltimos aos se ha generado una gran preocupacin por parte de los pases de todo el mundo por buscar nuevas fuentes de energa, pero hasta el momento no se ha desarrollado una fuente de energa que reemplace por completo a los combustibles fsiles, debido a que poseen un gran potencial energtico. Sin embargo, se han desarrollado innumerables estudios a lo largo de estas cuatro ltimas dcadas y en la literatura cientfica se reporta que una potencial fuente nueva energa es la biomasa, que supone la obtencin de combustibles desde fuentes vivas (plantas, microorganismos, incluso algunos residuos de animales), como el etanol o alcohol etlico, producido a partir de la fermentacin de los azucares que se encuentran en los productos vegetales (cereales, caa de azcar, remolacha, maz entre otros). Este combustible debidamente procesado poco a poco comienza a penetrar como combustible en el mercado internacional1. Cada da que pasa se hace ms evidente la necesidad de encontrar nuevas alternativas que puedan reemplazar a los combustibles fsiles, que ayuden a la conservacin y recuperacin del medio ambiente. Es por esto que la energa a partir de la biomasa, es sin lugar a duda una fuente importante a tener en cuenta, porque se puede reducir la contaminacin proveniente de la utilizacin de energa a partir de los combustibles fsiles. Teniendo en cuenta esto, para la investigacin se utiliz como biomasa un producto vegetal(ame), que por su composicin permite la obtencin de bioetanol, que se puede utilizar como combustible o como aditivo de la gasolina.

Estudio realizado por Global Bioenergy Partnership (Asociacin Global de Bioenerga) [GBEP (2007)]

El ame pertenece a la familia DIOSCOREACEA, gnero Dioscorea. Se encuentra distribuido en las regiones tropicales de alta pluviosidad, contiene fcula abundante y constituye un importante alimento en las regiones tropicales. Las especies ms cultivadas corresponden a Dioscorea Alata, D. Rotundata, D. Cayenensis, D. Esculenta, D. Bulbfera y D. trfida, de los cuales la primera es la preferida en la produccin de tubrculos para el consumo humano. El rea mundial cultivada comprende tres regiones principales: frica occidental, sur de Asia incluyendo parte de China, Japn, Oceana y los pases del Caribe. En Amrica, el ame es solo importante en Brasil, Colombia, Hait, Venezuela y Antillas Francesas. En Colombia se pueden encontrar varias especies de ame, como el ame criollo (D. Alata), ame espino (D. Rotundata), ame papa (D. Bulbfera), ame azcar (D. Esculenta) y ampin (D. Trfida). D. Alata y D. Rotundata son las especies de mayor importancia tanto por el rea sembrada como por la demanda del tubrculo, seguidas por D. Trfida. El cultivo del ame se considera abundante en la Costa Atlntica, las reas de mayor produccin en Colombia son: la zona costera del departamento de Crdoba, la subregin natural de los montes de Mara en los departamentos de Sucre y Bolvar, y algunos municipios de los departamentos del Cesar y la Guajira. Aun cuando actualmente se le conoce en todo el mundo, en Colombia el ame se ha caracterizado como producto de cultivo y consumo tradicional en la Costa Atlntica2. El uso del ame se ve en reflejado en las comidas cotidianas como (mote de ame, dulce de ame y sancocho). El cultivo de este tubrculo involucra a 9.000 familias de pequeos productores cuyos sistemas de comercializacin se caracterizan por bajos volmenes, escasa infraestructura de acopio, transporte y almacenamiento y una reducida transformacin, donde el 78% de la produccin se dirige al mercado en fresco; adems en la regin de la Costa Atlntica, donde se cultivan alrededor de 29.757 ton/ao3; a pesar de la alta produccin en el ao el ame no es utilizado con otros fines a parte del alimenticio, ya que no se conocen transformaciones tecnolgicas que permitan generar otro uso para este. Su condicin de alimento regional que no se sita como de primera necesidad ha estancado su explotacin, que se realiza generalmente en predios de economa campesina con bajo nivel de tecnificacin. Es necesario realizar un anlisis sobre cmo afecta la produccin de biocombustible al campo, y hay que tener presente que se necesitan alimentos para vivir, pero tambin se necesitan combustibles para atender las necesidades
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Evaluacin De Propiedades Tecnofuncionales De Variedades De ame De La Costa Atlntica. Disponible en: http://www.unicordoba.edu.co/pregrado/copia%20alimentos/proyectos/pba.pdf fecha:13/03/2012 3 ALVIS, Armando y VELEZ, Carlos. Informacin Tecnolgica-Vol. 19 N5-2008, pg.: 11-18 Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0718-07642008000500003&script=sci_arttext

de transporte, industria, vivienda, comercio, etc. La eleccin entre alimentos y biocombustibles no se puede plantear en trminos absolutos, porque no se puede renunciar a ninguno. La demanda de alimentos y la demanda de combustibles van en aumento, tanto por el desarrollo econmico, como por el crecimiento poblacional. Ambos mercados, el de alimentos y el de combustibles, existen y van a seguir existiendo; estn y seguirn compitiendo por los productos agrarios que son materia prima para la fabricacin de biocombustibles. Se necesita tanto de los alimentos como de los combustibles. Esta competencia exige volcar la vista al campo, a la agricultura. En el mundo son aproximadamente 5.000millones de hectreas las que se ocupan en agricultura. Sin embargo, todava queda superficie cultivable, aproximadamente 4.000 millones de hectreas, la que actualmente est cubierta por bosques. Pero mejor si no los tomamos en cuenta. Si hoy en da de una hectrea se puede obtener aproximadamente 3.000 9.000 litros de bioetanol/ao y 1.000 5.000 litros de biodiesel, entonces se necesitaran entre 220 y 800 millones de hectreas para producir un volumen de bioetanol y biodiesel igual al volumen de gasolina y diesel consumidos actualmente. Si se mantiene la superficie agrcola actual solamente para la produccin de alimentos, entonces se necesitar incrementar las hectreas arriba mencionadas. Habr otras alternativas? S, elevar la productividad y hacer ms eficiente el uso de combustibles. Fuera de ampliar la frontera agrcola, elevar los rendimientos de produccin agraria y reducir el consumo de combustibles por persona son alternativas viables para enfrentar la crisis. Para elevarla productividad agraria se tiene que aplicar nuevas tecnologas en la produccin. Las nuevas tecnologas incluyen riego, semillas mejoradas, tcnicas ms eficientes, mecanizacin, mejoramiento del empresariado, crditos, etc. La reduccin del consumo de combustibles por persona tiene mucho que ver con el tipo de vehculos que se utilizan4. Debido a la creciente necesidad en el pas para la produccin de bioetanol, es relevante realizar investigaciones relacionadas con la evaluacin de nuevos sustratos y metodologas para la obtencin de azucares fermentables por medio de hidrlisis. El ame en su composicin qumica posee almidn, que es un componente importante de los tubrculos encontrndose en una concentracin aproximada de 15,5 %5, por lo que se puede considerar una buena fuente de dicho polisacrido 6,
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BARRIENTOS, Juan Carlos. Alimentos o combustible Sinergia o dilema? Revista Anlisis ISSN 19996233vol 1 Nr 1 2008.Disponible en www.ibepa.org 5 TREADWAY, R. H. Manufacture of potato starch. In Whistler & Paschal (Eds.), Starch: Chemistry and Technology (pp 87-101). New York: Academic Press Inc.1984. fecha: 30/11/2011 6 GONZALES, Jorge y MOLINA, Manuel. Estudio de los factores que afectan la hidrolisis enzimtica y el proceso fermentativo para la produccin de alcohol a partir de la papa. Revista de ingeniera vol. 16(1), Enero/Julio 2006.

Por tal razn en esta investigacin se evaluar un sustrato rico en almidn. Es necesario realizar este estudio ya que busca dar un uso diferente a este alimento, utilizndolo como materia prima para la obtencin de etanol a partir de la hidrolizacin del almidn mediante el uso de enzimas como la alfa amilasa, Amiloglucosidasa y posteriormente la fermentacin con la Saccharomyces cerevisiae. 1.2 FORMULACIN DEL PROBLEMA Se podr obtener bioetanol a partir de la hidrlisis de almidn de ame a concentraciones de 10.5, 13.5 y 15 en %m/v utilizando las enzimas alfa amilasa, Amiloglucosidasa y la fermentacin con Saccharomyces cerevisiae? 1.3 JUSTIFICACIN Los recursos no renovables (combustibles fsiles) en el pas da a da se estn agotando debido a la gran demanda que estos generan a nivel mundial por las diferentes aplicaciones y usos que estos tienen en procesos industriales. Este proyecto se hace necesario para la bsqueda de alternativas energticas viables con el fin de disminuir el consumo de los combustibles fsiles debido a la contaminacin que estos generan y con el tiempo poder llegar a remplazarlos. Por otra parte generara desarrollo en las investigaciones del pas cerrando poco a poco la brecha tecnolgica con los pases industrializados de Suramrica como Brasil. Este proyecto es importante para investigadores y la comunidad cientfica porque se aplican las bases y conocimientos prcticos adquiridos a lo largo del proceso de aprendizaje, para enfrentar los retos que se nos presenten a lo largo de nuestra carrera profesional. Esto permite tener una visin ms amplia del papel que ocupa el profesional formado en la Universidad de San Buenaventura en la sociedad. La Ingeniera Qumica como ciencia est a la expectativa de nuevas investigaciones, teoras o procesos de fabricacin las cuales conforman una ciencia ms competitiva frente al mbito laboral ya que el papel del ingeniero qumico en la industria es fundamental en el desarrollo de muchos procesos. Mediante la obtencin de etanol a nivel de laboratorio se desarrollaran los pasos adecuados para realizar el proceso en mayores proporciones. Este proyecto se caracteriz por su proyeccin social, debido a la generacin de oportunidades para personas de escasos recursos que pueden desempearse en la siembra y recoleccin de la materia prima, mejorando as su calidad de vida, razn por la cual se identifica con las polticas de la Universidad de San Buenaventura planteado en su PEB La Universidad de San Buenaventura concibe

la proyeccin social como la relacin permanente que la institucin establece con la comunidad o medio externo para articularse en ella; influir en los procesos de transformacin social y en las realidades de su propio desarrollo, comunidades regionales y nacionales.7 En la realizacin de este proyecto se hizo necesaria la utilizacin de conocimientos, informacin, adquiridos durante la formacin universitaria las reas de operaciones unitarias, biotecnologa, tecnologa ambiental, tica, evaluacin de proyectos entre otras. Y con ellas se desarrollaran todas las actitudes y destrezas necesarias para la gestin del proyecto, ayudando por medio de estas a la conservacin del medio ambiente en busca del mejoramiento de su entorno. Adems en esta investigacin se ponen al servicio de la sociedad los conocimientos adquiridos para mejorar la calidad de vida del hombre sin causar dao a la naturaleza. Dentro de la trascendencia de esta investigacin, se hace necesaria relacionarlas con la orientacin y aplicacin de los programas acadmicos vistos en la Facultad de Ingeniera, Arquitectura, Arte y Diseo de La Universidad de San Buenaventura. 1.4 OBJETIVOS 1.4.1 Objetivo general

Evaluar la obtencin bioetanol a partir del almidn de ame (Dioscorea Rotundata, Dioscorea Alata y Dioscorea Trfida) mediante la hidrolisis enzimtica y posterior fermentacin. 1.4.2 Objetivos especficos Realizar la hidrlisis enzimtica de las tres variedades de harina de ame a las concentraciones 10.5, 13.5y 15% m/v utilizando la enzima amilasa y la amiloglucocidasa. Realizar la fermentacin del hidrolizado obtenido, mediante la utilizacin de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Determinar los parmetros (azucares reductores, crecimiento microbiano y etanol producido) de las 3 variedades a las concentraciones 10.5, 13,5 y 15% m/v.

Proyecto Educativo Bonaventuriano. 2010. P49

2. MARCO DE REFERENCIA

2.1

ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS

La produccin de alcohol existe desde que el hombre conoce el fenmeno de la fermentacin. Una de las primeras menciones, se han hallado en papiros egipcios que datan de 3.500 A.C, sin embargo, la preparacin de vinos y cervezas se sugiere desde la prehistoria. La figura 1 ilustra la evolucin del uso de bioetanol a nivel mundial en el siglo 20. Figura 1. Lnea de tiempo de utilizacin de Bioetanol a nivel mundial.

Fuente:http://www.epn.edu.ec/bio2008/Documentos/BIOETANOLPPT.pdf fecha: 28/10/2011

2.1.1 Historia etanol El Programa PROALCOHOL, iniciado en 1975 por el gobierno brasileo a raz de la crisis del petrleo, tena por finalidad reducir la dependencia del pas respecto a las importaciones del combustible fsil. Este programa se bas en los siguientes conceptos: Un volumen de compras y precio garantizados de etanol por parte de Petrobras. El establecimiento de incentivos a la inversin en nuevos centros de produccin. Una subvencin a la compra de vehculos impulsados por etanol puro.

A mediados de los 80s, el descubrimiento de yacimientos de Petrobras, debilitaron el argumento de la independencia del petrleo y la cada de los precios

de este, hizo que el apoyo a la produccin de etanol decayera por el diferencial elevado de precios. Por otro lado, la evolucin del mercado del azcar, hizo para los productores de caa ms atractivo la produccin de ste que del etanol. Durante la dcada del 90, el programa fue revisado a fondo y a partir de 1999 se produjo la apertura del mercado de etanol y el fin de los precios garantizados y con las siguientes modificaciones: Orientacin hacia el sistema de mezcla. Desgravacin fiscal prcticamente total para la venta de etanol. La obligacin de aadir a la gasolina una proporcin mnima de etanol del 22-24%, determinada por el gobierno8.

2.1.2 Estado actual Latinoamrica El sector mundial de la produccin de etanol se encuentra en plena expansin, ejemplo claro de esto se ve en su parque automovilstico que suma hoy casi tres millones de vehculos dedicados (solo etanol) y cerca de 16 millones de vehculos que consumen mezcla etanol gasolina. En los ltimos aos, la industria automovilstica brasilea desarroll vehculos que operan con flexibilidad en el tipo de combustible, popularmente conocidos como "Flex", ya que el motor funciona con cualquier proporcin de gasolina (mezcla E20-E25) y etanol anhidro (E100), disponibles en el mercado a partir de 2003. En agosto de 2008 la flota de carros "Flex" ya haba alcanzado 6 millones de vehculos, incluyendo automviles y vehculos comerciales livianos, representando un 23% de la flota de vehculos livianos de Brasil. En Colombia desde el 2005 se usa E10 en el 70% del territorio y a finales de 2009 estar el 100% del pas usando esta mezcla. La legislacin sobre produccin y uso de biocombustibles tambin se est aplicando en pases como: Argentina, Bolivia, Costa Rica, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Paraguay, Per9. En Colombia las investigaciones para utilizar el etanol como combustible comenzaron en 2001, ao en que el gobierno aprob la ley 693 que obligaba al enriquecimiento en oxgeno de la gasolina. Esto se hizo inicialmente para reducir las emisiones de monxido de carbono de los coches. Regulaciones ms recientes eximieron al etanol elaborado a partir de biomasa de algunos impuestos que gravan la gasolina, haciendo as ms barato el etanol que la gasolina10. Al principio todo el inters en la produccin del etanol vino de la industria de azcar existente,
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LEN, Jos Guillermo. Los Biocombustibles. Conferencia ARPEL 2009. Punta del Este. Uruguay p.6 9 Ibd. p.7 10 Ley 788 de 2002 articulo 88 Exencin de impuestos para el alcohol carburante disponible en:http://www.alcaldiabogota.gov.co/sisjur/normas/Norma1.jsp?i=7260

ya que es relativamente fcil aadir un mdulo para desarrollar etanol al final de una fbrica de azcar, y las necesidades energticas son similares a las que se necesitaran para producir el azcar. El gobierno alienta a convertir gradualmente las fuentes de combustible de los coches a una mezcla del 10 por ciento de etanol y de 90 por ciento de gasolina. Las plantas del etanol estn siendo incentivadas por tratos fiscales. Ha habido inters en plantas de etanol de yuca (mandioca) y de nuevas plantaciones de la caa de azcar, pero an no se ha conseguido producir carbohidratos a bajo precio. Las investigaciones sobre el bioprocesamiento de ame y de tubrculos afines son escasas debido a que por lo general su estudio va ms dirigido como alimento.En la industria del alcohol el ame es muy poco empleado, pero este es de los tubrculos con mayor presencia de almidn, lo que lo convierte en materia disponible para el procesamiento de etanol, algunos de los que se han utilizado con estos fines son la yuca y la papa, por lo tanto se realiz una recopilacin de estudios e investigaciones afines con esta proyecto y que presentamos a continuacin: CASTAO y colaboradores, (2011) Evaluaron la produccin de etanol a partir de harina de yuca en un sistema de hidrolisis enzimtica y fermentacin. Se obtuvo una concentracin de etanol de 14,6% v/v con una productividad de 2.5 g/h (48 horas de proceso) y con una concentracin de harina de ame de 28% m/v empleando la enzima STARGENTM0.01 (mezcla de alfa amilasa y glucoamilasa) en la hidrolisis y la Saccharomyces cerevisiae en la fermentacin. ASTURIZAGA y BOCANEGRA, (2008) Evaluaron los rendimientos en el proceso de obtencin de alcohol a partir de harina de ame ( Dioscorea Bulbfera, Trfida) por va enzimtica. Los resultados en la produccin de alcohol demostraron que la variedad D. Trfida en las concentraciones 10% y 13% m/v present mayores rendimientos en cuanto a volmenes de alcohol, con valores de 786,87 y 792,96 L/Tm de harina respectivamente. De forma similar se demostr que la variedad D. Bulbfera en las concentracin 16% m/v arrojo los menores rendimientos con un valor de 520,66 L/Tm de harina. Empleando las enzimas comerciales Pectinex UltraSP-L, Termamyl 120 L y la AMG 300 L de la Novo Nordisk en la hidrlisis y Saccharomyces cerevisiae en la fermentacin. Assis. T, (2007), en el estudio para la cuantificacin de alcohol a partir de harina de batata obtuvo una concentracin de etanol del 9.4% v/v y un rendimiento de 129 L de etanol/Tm de harina de batata, durante un tiempo de fermentacin de 56 horas, empleando como microorganismo Saccharomyces cerevisiae. Gonzlez y Molina en el 2006, estudiaron la hidrlisis enzimtica y la fermentacin de la papa (Solanum tuberosum), a fin de determinar las mejores condiciones para producir alcohol, quienes en el seguimiento del proceso de fermentacin alcanzaron una concentracin mxima de alcohol de 10,33% v/v. El rendimiento 8

de etanol del proceso fue de 94,5 L de etanol/Tm de papa, utilizando una concentracin de 20% m/v de sustrato. BRINGHENTI. L y CABELLO. C, tambin en el 2006, en el estudio de la fermentacin alcohlica de sustrato amilceo hidrolizado enriquecido con melaza de caa, obtuvieron concentraciones de etanol del 1.6% v/v; 2% v/v; 2.4% v/v; 3.6% v/v y4% v/v a partir de un hidrolizado de almidn residual de harina de yuca del 10%m/v, enriquecido con concentraciones de melaza de caa del 5, 10, 15 y 20% v/v respectivamente, en un volumen de reaccin de 500 ml, usando como microorganismo Saccharomyces cerevisiae. BRINGHENTI. L y CABELLO. C en el 2005, obtuvieron una concentracin de etanol del9.76% v/v a partir de residuos del proceso de obtencin de harina y almidn de yuca usando una concentracin del 18% m/v y enriquecido con un 12% de melaza residual del proceso de produccin de sacarosa de caa de azcar. MAGALY L. CEREDA M., en Brasil 2004.Desarrollaron un estudio sobre la utilizacin del residuo slido obtenido en la extraccin de almidn de yuca que es usado fundamentalmente en la alimentacin animal, el objetivo de este trabajo fue desarrollar la evaluacin tcnica econmica de la produccin de alcohol a partir del subproducto de la obtencin del almidn de yuca. Para esto se us como enzima complementaria la pectinasa para la hidrlisis del mosto, la caracterizacin del subproducto presentndolos siguientes resultados en base seca: 80% de almidn, 11.5% de fibra, 1.14% de cenizas, 0.85% de protenas y 0.45% de azucares. El proceso de hidrlisis tuvo una conversin de 86.31% del almidn inicial y un 80% de rendimiento de azucares totales. Un anlisis mostr que cerca del 75% de la materia seca inicial fue hidrolizado y el residuo presento 37% de almidn, 30% de azucares totales, 30% de fibra en base seca, el mosto obtenido present una concentracin de 13 Brix siendo necesario concentrarlo, la fermentacin alcohlica se realiz en 48 horas, el anlisis econmico demostr un proceso viable, necesitando un ajuste para su realizacin comercial. GRISALES. P. A, et, al., (2001). En el diseo de un proceso de produccin de etanol anhidro a partir de jugo de caa, obtuvieron una concentracin de 6 - 8% v/v de etanol. El jugo de caa contena una composicin de 14% de slidos solubles (14 Brix) y en la fermentacin el microorganismo utilizado fue Saccharomyces cerevisiae. En el trabajo Estudio preliminar para la obtencin de jarabe de glucosa a partir de la hidrlisis enzimtica del almidn de yuca utilizando extractos crudos de alfa amilasa (B. Licheniformis) y glucoamilasa (A. Nger), aplicaron extractos crudos enzimticos a una solucin de almidn de yuca 20% (m/v). Se ensayaron tres relaciones enzimas /sustrato 10, 20 y 30 ml/Kg. de almidn para el extracto de alfa amilasa y 15, 20, 45 ml/ Kg. de almidn para el extracto de glucoamilasa. Los 9

mejores resultados de la hidrlisis del almidn de yuca se lograron con las relaciones de 30 ml/ Kg. de almidn en la, licuefaccin y 45 ml/Kg de almidn en la licuefaccin, con lo que se obtuvo un jarabe de glucosa de 83.34% de equivalente de dextrosa (Lujan D. Alvarino N. Salcedo J., Revista Temas Agrarios, SIN 0127610, 2001)11. 2.2 BASES TERICAS 2.2.1 ame Nombre Cientfico: Dioscorea spp En la figura 2 se puede observar la forma de las hojas y del tubrculo de una de las especies de este gnero. Figura 2. Imagen sobre hojas de Dioscorea (izquierda) y Tubrculo (derecha)

Fuente: www.infojardin.com y www.elapuron.com/blogs/cocina/9/el-ame/ fecha: 13/06/2011

Identificacin del Producto El ame es una de varias especies de plantas del gnero Dioscorea (de la familia Dioscorecea), nativo a regiones clidas de ambos hemisferios. Este tubrculo tropical cuya parte expuesta es en forma de enredadera, es muy popular en centro y sur Amrica, al igual que en el Caribe, frica y partes de Asia. Diversas variedades de ame se cultivan a travs de los trpicos y en parte de las regiones sub-tropicales y templadas. En frica occidental y en Nueva Guinea el de ame es uno de los principales cultivos primarios.

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ASTURIZAGA AVILEZ, Yajaira y BOCANEGRA AMAYA, Carmen. Evaluacin de los rendimientos en el proceso de obtencin de alcohol a partir de harina de ame ( Dioscorea Bulbfera, Trfida) por va enzimtica. Sincelejo. Universidad de Sucre. Facultad de Educacin Y Ciencias. Programa de Biologa, 2008. 108 p.

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Aunque el Camote "SweetPotato" y el ame son similares en muchas formas, (y por ello en pases como los EE.UU. y Canad se presta a confusin), estas son plantas de diferentes especies. Existen ms de 150 especies de ames en el mundo, dependiendo de la variedad del ame, la parte carnosa puede ser de diferentes tonalidades de blanco, amarillo, prpura o rosado, y la piel desde blancuzca a chocolate oscuro. La textura de este tubrculo puede variar de suave y hmedo a spero, seco y harinoso. En nuestro medio el ame se presenta por regla general en trozos y se vende por masa. Ecologa El ame requiere para su cultivo temperaturas entre 18 C y 34 C y condiciones de precipitacin de entre 1,200 mm y 1,300 mm Y suelo franco arenoso (ms arenoso que arcilloso), con altura mxima de 800 ms. Sobre el nivel del mar. Caractersticas El ame es un planta (tubrculo) cuya raz comestible es muy apetecida por su valor alimenticio y rico sabor. La parte superficial de la planta es una enredadera trepadora con tallos (bejucos) que pueden alcanzar hasta ms de 3 m, estas especies tienen hojas de forma acorazonada y se propagan por rajas (trozos), cada una con dos o tres yemas. Variedad Dioscorea spp., Dioscorea Alata (ame de agua), Dioscorea Rotundata (ame blanco), Dioscorea Cayenensis (ame amarillo), Dioscorea Japnica, Diamante 22, Baboso de Oc, Culebra, Mano de Tigre. 2.2.2 Dioscorea Alata (ame Diamante) Tipos silvestres de esta especie se encuentran an en las selvas hmedas de malasia. En el viejo continente su rea de distribucin solo incluye zonas de alta humedad. A Amrica fue introducido por los esclavos africanos y navegantes portugueses en el siglo XVII. En la actualidad el ame es el ms difundido especialmente en las Antillas, Brasil y Venezuela. Esta especie se caracteriza por sus tallos cuadrangulares, con las alas membranosas de borde irregular, con frecuencia manchadas de morado. La lmina es acorazonada, con 3 a 5 nervios principales que salen de la insercin del peciolo. Como es una planta de cultivo muy antiguo se conocen numerosos clones, estos se caracterizan principalmente por la forma de los rizomas (esfricos, planos, cilndricos,

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encorvados y alargados) son de forma irregular generalmente. El color de la pulpa vara de blanco a amarillento12. La figura 3 ilustra el tipo de hojas y la forma del tubrculo de la especie Dioscorea Alata Figura 3. Hojas D. Alata (izquierda) y tubrculo (derecha)

Fuente:http://www.stuartxchange.org/Ubi.html y http://www.flickr.com.Fecha: 13/06/2011

2.2.3 Dioscorea Trfida (ame Baboso). D. trfida es una planta de tallos volubles, delgados que enrollan hacia la izquierda, provistos de dos a ocho alas membranosas, generalmente en mayor nmero y desarrollo en la parte inferior del tallo. Las hojas miden hasta 25 cm de largo, son digitadas, con tres a siete segmentos o lbulos, con el central ms grande. Las plantas son unisexuales. Las inflorescencias estaminadas son racimos simples o muy ramificados, con flores verduzcas de 4 a 6 mm de dimetro; mientras que las inflorescencias pistiladas consisten de dos racimos simples qu nacen de la misma axila con flores de 12 a 24 mm de largo. Esta especie florece ms regularmente que las otras especies del genero Dioscorea spp cultivadas. El fruto es una cpsula, con tres lculos, cada uno con dos semillas diminutas, aladas. El tallo subterrneo es un rgano irregular y corto del que emergen los tallos areos, races y estolones, estos ltimos en crculos sucesivos. El estoln que mide hasta 70 cm de largo, se ensancha formando el tubrculo. Los tubrculos varan mucho en forma y tamao, aun en la misma planta; se observa forma esfrica, fusiforme, claviforme y a menudo con ramificaciones muy cortas. La superficie es rugosa, a veces con raicillas. La pulpa es uniforme, compacta y vara de

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LEN, Jorge. Fundamentos Botnicos de los Cultivos Tropicales. Costa Rica. 1968. 92p.

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color blanco, amarillo hasta morado, con un sabor y apariencia muy agradable despus de cocinado. El peso de los tubrculos est entre 300 y 400g cada uno13. La figura 4 muestra ejemplares que corresponden a las caractersticas descritas anteriormente. Figura 4. Hoja de Dioscorea Trfida (izquierda) y tubrculo (derecha)

Fuente:http://www.tramil.net/fototeca/imageDisplay.php?id_elem=160&famil=DIOSCOREACEAE fecha: 06/05/2012

2.2.4 Dioscorea Rotundata (ame Espino) El ame espino (Dioscorea rotundata) es un cultivo de pequeos y medianos agricultores, que constituye en muchas regiones la principal fuente de ingresos, de empleo rural y de oferta de alimento a sus pobladores y tambin es un producto de exportacin. En Colombia, el ame se usa para alimentacin de la poblacin de la Costa Atlntica; es cultivado por pequeos y medianos agricultores y constituye la principal fuente de ingresos y de empleo rural en muchas zonas. Adems su exportacin a los mercados de Estados Unidos y Europa le genera al pas ms de US$2.5 millones anuales14. La planta de ame tiene un sistema de races fibroso. Los tubrculos durante el perodo de almacenamiento, presentan puntos elevados semejantes a pstulas que van a dar origen a races. El tubrculo es una estructura del tallo y no de la raz cuya funcin es el almacenamiento de grnulos de almidn. Los grnulos de almidn son
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ASTURIZAGA AVILEZ, Yajaira y BOCANEGRA AMAYA, Carmen. Evaluacin de los rendimientos en el proceso de obtencin de alcohol a partir de harina de ame (Dioscorea Bulbfera, Trfida) por va enzimtica. Sincelejo. Universidad de Sucre. Facultad de Educacin Y Ciencias. Programa de Biologa, 2008. 108 p. 14 SNCHEZ, C., HERNNDEZ, L., Descripcin de aspectos productivos, de postcosecha y de comercializacin del ame en Crdoba, Sucre y Bolvar, Corpoica, 2003.

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redondeados o elpticos y algunas especies de ame (D. rotundata) los concentran ms que otras especies (D. Alata). Adems de almidones los tubrculos de ame, dependiendo de la especie, tienen concentraciones de sustancias urticantes, de taninos, fenoles y otras sustancias como esteroides o corticoides15. En la figura 5 se observa la forma de las hojas y el tubrculo de la especie Dioscorea Rotundata. Figura 5. Hojas de D. Rotundata (izquierda) y tubrculo (derecha)

Fuente:http://insumosdeamecoloso.blogspot.com/y species.wikimedia.org.fecha: 13/06/2011

2.2.5 Produccin de ame a nivel Mundial La mayora de los ames cultivados pertenecen a la familia Dioscorecea, y al gnero Dioscorea. Es el principal alimento cultivado en frica occidental, el Caribe, islas del Pacifico sur, sur este de Asia, India y partes de Brasil)16. Esta planta se presenta como una enredadera y se caracteriza por la presencia de tubrculos subterrneos y areos, los cuales junto con la papa, la yuca, la arracacha y la batata ocupan un lugar importante en la alimentacin humana. Est estimado que existen ms de 600 especies en el mundo. Las especies ms cultivadas son: D. Alata, D. Rotundata, D.Cayenensis, D.Esculenta, D.Bulbfera y D. trfida, de los cuales la primera es la preferida en la produccin de tubrculos para el consumo humano. La mayor produccin de ame y los mejores rendimientos de los cultivos se dan en el continente africano, en donde en una escala de mayor a menor productor los primeros 9 pases constituye a este continente, siendo Nigeria el mayor productor con 26587000 toneladas; Colombia ocupa el sptimo lugar con una produccin de 333532 y en el ltimo lugar se encuentra se encuentra la Repblica Democrtica del Congo, con una produccin de 84900. Todas las estadsticas estn reflejadas en la tabla 1.
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GAMERO, Galo. Consideraciones sobre fisiologa de la planta de ame, Corpoica, 2004 ADELUSI A, LAWANSON AO. (1987). Disease induced changes in carotenoid content of edible yam (Dioscorea spp) infected by Botryo diploid theobromaeandAspergillusNiger. Mycopathologia 98:49-58.

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Tabla 1. Produccin de ame A nivel Mundial ao 2005

Fuente: www.fao.org - direccin estadstica, principales productores de alimentos y productos agrcolas. Fecha: 06/05/2012

2.2.6 Produccin de ame en Colombia De acuerdo con las cifras del Ministerio de Agricultura y el Instituto Colombiano Agropecuario (2009), en el pas se cultivan 25,000 hectreas en ame y se producen 200,000 Tm, con un rendimiento medio de 12 a 15 Tm/ha entre las variedades espino y diamante17. La produccin se realiza principalmente en las regiones de las costas Atlntica y Pacfica, siendo los principales productores los
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Articulo exportadores de ame de la mano del ICA (2009) disponible en: www.ica.gov.co

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departamentos de Crdoba, Bolvar y Sucre, como se ilustra en la figura 6. Figura 6. Produccin de ame en los departamentos de Colombia ao 2010

Fuente: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. Anuario estadstico (2010) fecha de actualizacin 27/03/2012

En Colombia el ame es cultivado por pequeos y medianos agricultores, con bajo nivel tecnolgico, generalmente asociado con cultivos de yuca y maz, y constituye la principal fuente de ingresos y de empleo rural en muchas zonas de la Costa Atlntica. La comercializacin de ame es regional para consumo en fresco, aunque una parte se exporta a Estados Unidos, Espaa y Alemania para alimento de la poblacin latina y uso farmacolgico. Adems su exportacin a los mercados de Estados Unidos y Europa le genera al pas ms de US$2.5 millones anuales. En el anexo A se observa la superficie cosechada, produccin y rendimiento obtenido por los departamentos de Colombia entre los aos 1997 2008. 2.2.7 ALMIDN Historia del almidn Exactamente no se sabe desde que poca es conocido como el almidn. Los griegos los llamaron Anylon quizs debido a que el contrario de lo que sucede con la harina, se obtena no por el molino, sino por el lavado 18.Segn rastros arqueolgicos hallados en las tumbas de los reyes egipcios, presentan muestras

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ULLMAN, F, enciclopedia de qumica industrial. tomo VI. Barcelona: Gustavo Gill, 1954 p.

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de pegantes a base de almidn, los cuales datan aproximadamente de ao 3500 A.C. En la industria de almidn se conoce muy poco acerca de su aparicin. Se admite probablemente que los holandeses en el siglo XVI haban fabricado almidn a gran escala, pero usando como materia prima el trigo; el desarrollo debi efectuarse muy lentamente al igual que en otros pases. Despus de la celulosa, el almidn es la sustancia orgnica ms ampliamente distribuida en la naturaleza; la celulosa forma parte del armazn de las plantas, mientras que el almidn representa su reserva de carbohidratos, transformndolos por hidrolisis en glucosa la cual es transformada por medio de la savia, aprovechando su solubilidad. En las plantas existen tres clases de almidn: Almidn de asimilacin, transitorio y de reserva. El almidn de asimilacin es aquel que ha de hervir en la nutricin de la planta y el cual se encuentra en forma de almidn soluble. El almidn en el interior de la planta, es transformado en azucares por medio de enzimas diastticas; pasando primero por la fase de almidn soluble, el cual puede transformarse algunas veces en grnulos muy finos, formando as el almidn transitorio. El resto de almidn es transportado a los sitios de almacenamiento donde tiene como funcin servir de alimento para los brotes jvenes; es llamado almidn de reserva. El almidn se halla en forma de grnulos con la forma y tamao caractersticos de la planta de la cual se obtiene, por lo que un anlisis microscpico es muy til para confirmar el origen del almidn; adems ayuda a determinar la presencia de materiales extraos, afrecho, insectos o residuos de estos. Cuando los grnulos estn intactos, son insolubles en agua fra; si su membrana externa se rompe al ser molidos, estos grnulos se hinchan en agua fra y si se calienta por encima de 55 C, forma un gel19. El almidn es un polisacrido de reserva alimenticia predominante en las plantas, y proporciona el 70-80% de las caloras consumidas por los humanos de todo el mundo. Tanto el almidn como los productos de la hidrlisis del almidn constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta habitual. Del mismo modo, la cantidad de almidn utilizado en la preparacin de productos alimenticios, sin contar el que se encuentra presente en las harinas usadas para hacer pan y otros productos de panadera. En la figura 7 se ilustra la estructura qumica del almidn.

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Figura 7. Estructura del almidn.

Fuente: http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema8/8-4plastidios.htm. Fecha: 24/04/2011

Los almidones comerciales se obtienen de las semillas de cereales, particularmente de maz (Zea mays), trigo (Triticum spp.), varios tipos de arroz (Oryza sativa), y de algunas races y tubrculos, particularmente de patata (Solanum tuberosum), batata (Ipomoea batatas) y mandioca (Manihot esculenta). Tanto los almidones como los almidones modificados tienen un nmero enorme de posibles aplicaciones en los alimentos, que incluyen las siguientes: adhesivo, ligante, enturbiante, formador de pelculas, estabilizante de espumas, agente antienvejecimiento de pan, gelificante, glaseante, humectante, estabilizante, texturizante y espesante. Propiedades del almidn El almidn es un polvo blanco, amorfo, plstico, cuya densidad es 1,6 mg/ml, que a veces se caracteriza por un brillo peculiar. Es insoluble en agua, alcohol y ter. Al microscopio presenta caractersticas definidas, pudindose identificar fcilmente. Qumicamente, es un hidrato del carbono (oxigeno, nitrgeno y carbono). Su procedencia se distingue por el tamao y la forma de los granos. En virtud de su forma podemos dividir los almidones en 5 clases: Almidones de grnulos en forma de valos grandes formando anillos concntricos y con el ncleo (hilum) colocado excntricamente. Ejemplo: la papa. Almidones de grnulos ovoides usualmente formando anillos concntricos, con ncleo irregular. Ejemplo: las leguminosas. Almidones de grnulos ovoides con ncleo central. Ejemplo: el trigo. Almidones de grnulos truncos en uno de los extremos. Grupo del sag. Ejemplo: la yuca. Almidones cuyos grnulos forman ngulos pequeos y poligonales. Ejemplo: el arroz.

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La tabla 2 muestra la concentracin en masa seca de almidn presente en varios alimentos. Tabla 2. Almidn presente en diferentes alimentos
Cantidad de almidon presente en algunos alimentos Alimento % en masa de Almidon Cereal 65-75 Edulcorantes 10-12 Raices y Tuberculos 70-75 Frutas 5-8 Hortalizas 8-15 Legumbres 50-60
Fuente: FAO (1999). Los carbohidratos en la nutricin humana, estudio de alimentacin y nutricin ao 1997.

Estructura y composicin Todos los almidones tienen frmula emprica (C6H10O5)n. el factor n tiene por lo menos un valor igual a 4; llegndose a encontrar frmulas con 100 a ms tomos de carbono. La diferencia entre la celulosa y el almidn radica en que en el almidn, los restos de glucosa estn unidos entre s por uniones glucosidicas 1-4, con orientacin , mientras que la celulosa tiene uniones 1-4 glucosidicas con orientacin . Adems de esto se sabe que el almidn contiene alrededor del 20 % de una fraccin soluble en agua llamado Amilosa y el 80% de una solucin insoluble conocida como amilo pectina. En el granulo de almidn podemos distinguir tres partes: La primera es una envoltura de amilopectina y -amilosa o un almidn a menos soluble y que contiene un Ester fosfrico, el cual es un Ester amilofosfrico. Es difcilmente atacada por enzimas, necesitndose para ello un calentamiento. Con dicho calentamiento forma una pasta y con una solucin alcohlica de yodoyoduro da una coloracin violeta La segunda parte es una sustancia inerte formada por -amilosa, granulosa o almidn. Esta parte es ms soluble que la anterior y no forma una pasta, ni da color con el yodo-yoduro. La tercera parte es hallada solo en los cereales, pero no como constituyente del granulo, la hemicelulosa. Qumicamente es una mezcla de dos polisacridos muy

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similares, la amilosa y la amilopectina; contienen regiones cristalinas y no cristalinas en capas alternadas. Puesto que la cristalinidad es producida por el ordenamiento de las cadenas de amilopectina, los grnulos de almidn creo tienen parecido grado de cristalinidad que los almidones normales. La disposicin radial y ordenada de las molculas de almidn en un grnulo resulta evidente al observar la cruz de polarizacin (cruz blanca sobre un fondo negro) en un microscopio de polarizacin cuando se colocan los polarizadores a 90 entre s. El centro de la cruz corresponde con el hilum, el centro de crecimiento de grnulo20 Amilosa La - amilosa est constituida por cadenas largas no ramificadas en las que todas las unidades de D- glucosa se encuentran unidas mediante enlaces glucosidicos (1,4); por lo tanto la unidad que se repite es la maltosa. El peso molecular de la amilosa depende de su origen botnico, su aislamiento y el mtodo utilizado. Entre los valores aceptados para la amilosa estn entre 1,1 y 1,9 millones de daltons. Amilopectina Presenta una cadena lineal de tipo como en la amilosa; adems tiene alrededor de 4-5% de las unidades de glucosa unidas por enlaces (1,6) dando una estructura ramificada creciente. El peso molecular de la amilopectina es muy variable; las mejores valoraciones del peso molecular promedio (pro difraccin) es de 10 a ms de 20 millones de daltons21. 2.2.8 Hidrlisis Se denomina hidrlisis a las reacciones de la qumica inorgnica, en donde el agua efecta una doble descomposicin con otro compuesto, (el H + va en un componente y el OH- va en el otro). Este trmino tambin puede aplicarse a reacciones en donde un cido se aade al agua, en mayor o menor cantidad para acelerar la reaccin; esta hidrlisis puede llevarse a cabo con cidos inorgnicos, cidos orgnicos o por accin enzimtica, la cual es la ms utilizada industrialmente22.

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Disponible en: http://www.eis.uva.es/~macromol/curso08-09/pls/quees.htm ta MORRISON, Robert. Y BOYD, Robert.Qumica Orgnica. 5 Ed. AddisonWesley Iberoamericana. USA. 1996. 22 da FERMEMA, O. Qumica de los Alimentos, 2 ed. Editorial ACRIBIA, Zaragoza, Espaa 2000. P. 228-240

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Reaccin de hidrlisis enzimtica:

Con la finalidad de transformar las molculas del almidn en azucares fermentables los cuales son asimilados por las levaduras o bacterias. El almidn es sometido a un proceso de hidrolisis mediante la cual ocurre un desdoblamiento ya sea por un exceso de agua o por la presencia de una pequea cantidad de fermento o acido. 2.2.9 Hidrlisis Qumica. El almidn tratado con cidos se rompe en cadenas cortas de dextrina. El grado de degradacin depende de la concentracin del cido, la temperatura, y el tiempo de hidrolisis. A medida que acta el cido, el peso molecular y la viscosidad de los productos decrecen y el poder reductor aumenta. Los cidos utilizados para la produccin de dextrinas son el cido clorhdrico y el cido Ntrico. Si hervimos el almidn con cido Clorhdrico 1N durante 1 hora, el almidn se rompe totalmente y se reduce a glucosa esta reaccin es conocida como hidrolisis intensa. Los productos de degradacin son principalmente el hidroximetulfurtutal, el cido levulinico, y el cido frmico, que da al jarabe un sabor amargo. La recombinacin de unidades de D-glucosa o de esta con fragmentos como maltosas, conducen a la formacin de productos de reversin los cuales pueden ser hidrolizados, un ejemplo de estos productos en la Genciobiosa. Mediante este procedimiento se logra el desdoblamiento de las molculas de almidn por la accin de cido sulfrico o cido clorhdrico diluidos. La clase de cido, su concentracin, la cantidad empleada referida a la cantidad de almidn, as como la presin y la temperatura ejercen gran influencia en la duracin de la sacarificacin. Por lo general, la cantidad de cido empleado es tal que el valor de pH se ajuste a 1.5 paz una solucin al 33% de almidn. El agua utilizada, de ser lo ms pura posible y libre de hierro, ya que el cido fosfrico que existe en el almidn forma despus de neutralizarse fosfatos de hierro insolubles, finamente dividido, quedando en suspensin en el jarabe y es muy difcil su separacin por filtracin23.

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ed. Editorial ACRIBIA, Zaragoza, Espaa 2000. P.

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2.2.10 Hidrlisis enzimtica (sacarificacin de materiales amilceos) La sacarificacin es el proceso que tiene por objeto la transformacin del almidn de las materias primas amilceas en azucares. Dicha transformacin es catalizada por enzimas. Estas enzimas se encuentran en la saliva, los jugos pancreticos, las clulas de la sangre, las semillas y granos de muchas plantas, en hongos y bacterias. La funcin de estas enzimas se encuentra en la saliva, los jugos pancreticos, las clulas de la sangre, las semillas y granos de muchas plantas, en hongos y bacterias. La funcin de estas enzimas es de romper las molculas de almidn, dando productos semejantes a los obtenidos por hidrlisis acida. Las dos clases de amilasas ms conocidas actualmente son: Alfa-amilasas: las cuales desdoblan el almidn en glucosa y maltosa, se caracteriza por la facilidad de fragmentacin de los almidones en dextrinas reductoras, que no dan color con el yodo. Beta-amilasas: convierten el almidn en glucosa. Las amilasas actan muy lentamente sobre el almidn, por lo que debe ser sometido a un proceso de coccin para obtener una buena dispersin y rompimiento de los granos de almidn llevndose a cabo una hidrolisis rpida. La accin de las amilasas sobre el almidn depende del origen del mismo; ya que el almidn consta de una mezcla de 75-80% de amilopectina y el recto de amilosa. Esta ltima se compone de cadenas longitudinales que contienen unidades de glucosa unidas por enlaces -1,4 glucosdicos. Una cadena lineal puede contener de 70 a 100 unidades de glucosa aproximadamente 24 Enzimas. Las enzimas son piezas esenciales en el funcionamiento de todos los organismos vivos, actuando como catalizadores de las reacciones de sntesis y degradacin que tienen lugar en ellos25.La utilizacin de estas en la hidrolisis del almidn presenta una serie de ventajas, adems de las de ndole econmica o tecnolgica, su gran especificidad de accin hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas26. Asimismo se puede trabajar en condiciones moderadas, especialmente de temperatura, lo que evita alteraciones de los componentes. La produccin de jarabes de glucosa a partir de almidn se realiza en dos pasos, primero la

24 25

DE RAFOLS, W. Aprovechamiento Industrial de los productos agrcolas. Barcelona. 1964 MONTES, M y MAGANA, I. Enzimas con Aplicacin Industrial. Disponible en: http://www.cinvestav.mx/publicaciones/avaype/sepoct02/HORCASITAS.PDF.2004. 26 TUCKER, G y WOODS, L. Eds.Enzymes in Food Processing. Blackie and Son Ltd. London.1991.

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licuefaccin del almidn y segundo la sacarificacin (conversin de la molcula de almidn en molculas de glucosa). La licuefaccin se realiza utilizando como catalizador las enzimas -amilasas amilasas, y la sacarificacin se realiza utilizando como catalizador la glucoamilasa o la pollulanasa y tambin se puede utilizar mezclas de enzimas27. Enzimas degradadoras de almidn (amilasas). Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, son las enzimas responsables de la degradacin del almidn, hidrolizan los enlaces glucosdicos 1-4. Las amilasas se pueden dividir en tres grupos: amilasas, las cuales rompen al azar enlaces 1-4 glucosdicos presentes en la parte interior del sustrato o de la cadena de amilasa y amilopectina (endo amilasas); amilasas o examilasas, que rompen enlaces 1 -4 y enlaces 1-6 glucosdicos ordenadamente a partir de los extremos no reductores del sustrato28. Actan sobre los residuos de glucosa externos de la amilasa y amilopectina produciendo solamente glucosa (glucoamilasa y glucosidasa) o maltosa y dextrinas y glucoamilasa que liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no reductores del sustrato. Existen otras enzimas que degradan almidn tales como las desramificantes que hidrolizan enlaces 1-6 glucosdicos. La isoamilasa hidroliza enlaces 1-6 en la amilopectina y la pollulanasa tipo I hidroliza enlaces 1-6 glucosdicos en pululan y amilopectina29. Estas enzimas degradan amilopectina obtenindose as polisacridos de longitud lineal. Enzimas amilasas. La familia de la - amilasas puede ser dividida en dos grupos. Las enzimas que hidrolizan el almidn y las que lo modifican o enzimas transglicolisantes30. Las enzimas hidrolizadas prefieren la hidrolisis acida, en los procesos de industria del almidn y de un nmero de ventajas tales como: especificidad de la reaccin, estabilidad de los productos generados, bajo requerimientos de energa y eliminacin de la etapa de neutralizacin. Estas enzimas se caracterizan por actuar sobre los enlaces glucosdicos e hidrolizan estos enlaces para producir mono u oligosacridos -anomericos (hidrolisis), de enlaces 1-4 o 1-6 glucosdicos (transglicosilacin), o una combinacin de ambas actividades; poseen una estructura (/) o barril TIM conteniendo residuos

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FRAZIER, W. y WESTHOFF D. Microbiologa de los alimentos. Zaragoza, Espaa. Acribia S.A 1993, p. 431-438 28 ARTIME, R. Aplicaciones de las enzimas. Universidad de Salamanca. 2005 29 SATYANARAYANA, T; RAO, J; EZHILVAN NAN, M. 2005. a- Ailases. In: Enzyme Technology, A. Pandey, C. Webb, CR. Soccol, C. La roche (Eds.), Asiatech Publishers Inc; New Delhi, India pp 189 220. 30 CARRERA, J. Mdulos de Biotecnologa. Enzimas industriales, Universidad del Cauca, 1 edicin.

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del sitio cataltico y tienen cuatro regiones altamente conservadas en su secuencia primaria que contienen los aminocidos que forman el sitio cataltico31. La accin de la - amilasas sobre la fraccin de amilasa del almidn, se da en dos etapas. Inicialmente, tiene lugar una rpida degradacin de la amilasa para dar maltosa y maltotriosa. En la segunda fase, ms lenta ocurre hidrolisis de los oligosacridos, formando glucosa y maltosa como productos finales. La accin sobre la amilopectina produce glucosa, maltosa y una serie de dextrinas y oligosacridos de cuatro o ms residuos de glucosa todos con enlaces glucosdicos 1-632. Enzimas - Amilasas.AMG 300L. Es una Amiloglucosidasa de grado alimenticio, producida a partir de una cepa seleccionada de Aspergillus Nger. La enzima hidroliza los enlaces 1-4 y 1-6 del almidn licuado. Durante la hidrolisis, elimina gradualmente las unidades de glucosa de los extremos no reductores desacarificado. La velocidad de hidrolisis depende del tipo de enlace y del rompimiento de la cadena. La AMG es recomendada para la sacarificacin del almidn y la produccin de glucosa33. 2.2.11 Fermentacin. Una fermentacin es una reaccin de oxidacin-reduccin interna equilibrada en la que algunos tomos de la fuente de energa (donador de electrones) se reducen mientras otros se oxidan34, y la energa se produce por fosforilacin a nivel sustrato. Una ruta bioqumica muy usada para la fermentacin de la glucosa es la glucolisis, tambin denominada va de Embdem-Meyerhof en atencin a sus descubridores. El proceso, simplificado, de la fermentacin es:

Ahora bien la glucolisis se puede dividir en tres etapas principales, cada una de las cuales comprende una serie de reacciones individuales catalizadas enzimticamente.

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KURIKI, T; IMANAKAT, T. The concept of the a-amylase family: structure Similarity and common catalytic mechanism. J. Biosci, Bioeng. 1999, p.p87, 557 565. 32 LOPEZ, J. Semilla vegetativa de yuca. En: Ospina, B y Ceballos, H. La yuca en el tercer milenio. Sistemas modernos de produccin, procesamiento, utilizacin y comercializacin, 2002. pp. 49-75. CIAT. Cali, Colombia. 586 pp. 33 CARRERA, Jorge y MERA, Ingrid. Obtencin de glucosa a partir de almidn de yuca Manihot sculenta. Facultad de Ciencias Agropecuarias Vol 3 No.1 Marzo 2005. 34 BROCK y MADIGAN. Michael. Biologa de los Microorganismos. 2004. Editorial prentice hall. 10 edicin. 114 p.

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La etapa 1 incluye una serie de reacciones preparatorias que no implican ni oxidacin ni reduccin y que no liberan energa, pero que conducen a la produccin a partir de glucosa de dos molculas del intermediario clave gliceraldehido-3-fosfato. En la etapa 2 ocurre un proceso redox, la energa se conserva en forma de ATP, y se forman dos molculas de piruvato. En la etapa 3 tiene lugar una segunda reaccin redox y se originan los productos de fermentacin (etanol y CO2 o cido lctico) Etapas I y II: reacciones preliminares y reacciones redox. En la etapa 1, la glucosa es fosforilada por el ATP dando lugar a glucosa-6-fosfato, que es convertida a continuacin a una forma isomrica, la fructosa-6-fosfato, que mediante una segunda fosforilacin se convierte en fructosa-1,6-difosfato, que es un metabolito intermediario clave de la glucolisis. Si se fermentan otros azucares distintos a la glucosa, se convierte antes a fructosa-1,6-difosfatopara poder ser utilizados por la ruta de Embdem-Meyerhof. La enzima aldolasa cataliza la rotura de la fructosa-1,6-difosfato en dos molculas de tres tomos de carbono, el gliceraldehido-3-fosfato y su ismero dihidroxiacetona-fosfato. Existe una enzima que cataliza la interconversin de dihidroxiacetona-fosfato a gliceraldehido-3fosfato pero, para simplificar, se considera solo este ltimo ya que es el que ser metabolizado. En esta primera etapa no ha ocurrido ninguna reaccin redox y que todas las reacciones, incluyendo las del consumo de ATP, tienen lugar sin transferencia de electrones. La primera reaccin redox de la glucolisis tiene lugar en la etapa 2 durante la conversin del gliceraldehido-3-fosfato a acido 1,3-difosfoglicerico. En esta reaccin (que ocurre dos veces, una por cada molcula de gliceraldehido-3fosfato), una enzima cuyo coenzima es NAD+ acepta 2 tomos de hidrogeno y el NAD+ se convierte en NADH; la enzima que cataliza esta transformacin se llama gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. Simultneamente, cada molcula de gliceraldehido-3-fosfato es fosforilada por la accin de una molcula de fosfato inorgnico se convierte en orgnico, prepara el escenario para la conservacin de la energa por fosforilacin a nivel de sustrato; la formacin de ATP es posible porque cada uno de los fosfatos de la molcula de cido 1,3-difoglicerico y cuando ms tarde se convierte en acido 1,3-fosfoglicerico y cuando ms tarde en la va, cada molcula fosfoenol piruvato se convierte en piruvato. En la glucolisis, se consumen dos molculas de ATP en las dos fosforilaciones de la glucosa y se sintetizan cuatro molculas de ATP (dos por cada molcula de cido 1,3-difosfoglicerico convertida a piruvato). Por tanto, la ganancia neta del organismo es de dos molculas de ATP por cada molcula de glucosa.

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Etapa III Produccin de productos de fermentacin Durante la formacin de dos molculas de cido 1-3, difosglicerico, se reducen dos molculas de NAD+ a NADH. Sin embargo, las clulas contienen solo una pequea cantidad de NAD+, y si todo se convirtiera en NADH se detendra la oxidacin de la glucosa, la oxidacin continuada del gliceraldehido-3-fosfato solo se puede proseguir si est presente una molcula de NAD+ para aceptar los electrones liberados. Este bloqueo se supera en la fermentacin mediante la nueva oxidacin de NADH a NAD+, a travs de reacciones que suponen la reduccin del piruvato a una extensa variedad de productos de fermentacin. Se conocen muchas rutas para la oxidacin del piruvato en procariotas fermentativos, pero el resultado final es el mismo; el NADH debe volver a la forma oxidada NAD+, a fin de que las reacciones que liberan energa en la fermentacin puedan continuar. Como coenzima difusible, el NADH puede soltarse de la enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y unirse a una enzima que reduzca el piruvato de nuevo, haciendo que le ciclo de reconversin del NADH a NAD + y de NAD+ a NADH se repita otra vez. En cualquier proceso que produzca energa, la oxidacin debe acompaarse de una reduccin y debe haber un aceptor de electrones por cada electrn cedido. En este caso, la reduccin del NAD+ en un paso enzimtico de la glucolisis se equilibra con su oxidacin en otro paso. Los productos finales deben estar tambin en equilibrio redox con el sustrato inicial, la glucosa. De aqu que los productos que aqu se generan, etanol ms CO2 o lactato ms protones, estn en equilibrio atmico y electrnico con la glucosa inicial35. En la figura 8 podemos ver una descripcin del proceso de glucolisis.

35

BROCK y MADIGAN. Michael. Biologa de los Microorganismos. 2004. Editorial prentice hall. 10 edicin.120-123 p.

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Figura

8.

Esquema

del

proceso

de

glucolisis.

Fuente: BROCK y MADIGAN. Michael. Biologa de los Microorganismos. 2004. Editorial Prentice hall. 10edicin.

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Concepto Microbiolgico de la fermentacin Se entiende por fermentacin aquel proceso en el que los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilizacin de sustancias orgnicas en ausencia o presencia de oxgeno. La descomposicin de los sustratos es llevada a cabo por enzimas producidas por microorganismos para tal finalidad. Se debe observar que el concepto llega a excluir a los microorganismos del proceso, siempre y cuando estn presentes sus enzimas; sin embargo, en estos casos, la velocidad de obtencin y los rendimientos del producto son menores. Clasificacin de los primeros procesos de fermentacin La gran cantidad de procesos y productos que involucra el termino fermentacin hace difcil no solo la definicin del concepto si no tambin su clasificacin. En general, se establecen divisiones con base en: El tipo de producto final por obtener La presencia o ausencia de oxgeno en el proceso.

Productos Finales de la fermentacin Desde el punto de vista comercial se pueden clasificar tomando en cuenta los productos que se obtendrn entre ellos, se pueden mencionar: Clulas microbianas (biomasa) Metabolitos microbianos: metabolitos primarios y secundarias (enzimas, etanol, butanol, acetona, cidos orgnicos, etc. Clulas Microbianas (biomasa).

Esto ocurre en el proceso de fermentacin cuando hay un sobre crecimiento de clulas, y solo utilizan el sustrato para su crecimiento y hay poca produccin de metabolitos36. Metabolitos primarios microbianos. Son molculas de bajo peso molecular que se forman en la fase exponencial o tropofase e intervienen como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anablicas y catablicas del proceso. Algunos ejemplos de stos, Que poseen importancia comercial se encuentran en la tabla 3.

36

HERNNDEZ, Alicia. Microbiologa industrial. 2003. Editorial EUNED. Edicin 1 pg. 37-39

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Tabla 3. Compuestos producidos por el proceso de fermentacin

Algunos compuestos de inters comercial producidos por fermentacin Tipo de Sustancia Productos actico, ctrico fumarico, gluconico, itaconico, lctico cidos orgnicos Aminocidos lisina, metionina, triptfano, valina acetona, butanol, 2,3-butanodiol etanol, glicerol Alcoholes y Solventes bacitracina, estreptomicina, neomicina Penicilina, tetraciclina Antibiticos Esteroides cortisona, hidrocortisona, testosterona acido ascrbico, cianocobalamina caroteno, riboflavina Vitaminas Clulas de hongos, levaduras, bacterias y algas Protena Unicelular (biomasa) Alcaloides, Enzimas, insecticidas, Biolgicos, metano, polisacridos y saborizantes Otros

Fuente: Hernndez, Alicia. Microbiologa industrial. 2003. Editorial EUNED. Edicin 1. pg. 39

Metabolitos Secundarios Microbianos. Son molculas orgnicas complejas que para su formacin requieren un gran nmero de reacciones enzimticas especficas. Estos se forman durante la ideofase (fase durante la cual un cultivo sintetiza productos distintos a los Metabolitos primarios, sustancias que no tienen un papel significativo en el metabolismo celular) y donde los metabolitos secundarios tienden a ser sintetizados de los productos intermedios y finales del metabolismo primario, en la tabla 4 podemos ver algunos de estos metabolitos. Tabla 4. Metabolitos microbianos comerciales
Metabolitos microbianos secundarios comercializados
Metabolito Secundario Penicilina Cefalosporina Tretraciclina Estreptomicina Griseofulvina Actinomicina Pepstatina Ciclosporina A Krestina Betatina Gibberelina Utilidad Comercial Antibiotico Antibiotico Antibiotico Antibiotico Antibiotico (antifungico) Antitumoral Tratamientos antiulcerosos Inmunosupresor Tratamiento de cancer Tratamiento de cancer Regulador de crecimiento vegetal

Fuente: WALKER, J.M. Gingold. Biotecnologa Molecular. Edicin, Acribia, SA. Pg. 5-6

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A simple vista puede resultar extrao que los microorganismos elaboren compuestos que no parecen tener ninguna funcin metablica y que, en realidad no constituyen productos intermediaros del catabolismo, como por ejemplo, el etanol y la acetona. Sin embargo, muchos Metabolitos secundarios poseen propiedades anti-microbianas y por lo tanto, en el medio ambiente natural podran ser implicados en procesos competitivos37. Oxgeno en el proceso de fermentacin Tambin es posible clasificar las fermentaciones con base en la presencia o ausencia de oxigeno molecular durante el proceso. De acuerdo con esta divisin, los procesos se denominan: Fermentacin aerobia. En este tipo de fermentacin el aceptor final de electrones es el oxgeno; es imprescindible su presencia para el desarrollo del microorganismo y la produccin del compuesto deseado. En este tipo de procesos, se produce fundamentalmente biomasa, dixido de carbono y agua. Fermentacin anaerobia. En este tipo de fermentacin el proceso de produccin de metabolito de inters se desarrolla en ausencia de oxigeno; los productos finales son sustancias orgnicas, por ejemplo, cido lctico, cido propionico, cido actico, butanol, etanol, y acetona. Sin embargo, en la mayora de las fermentaciones anaerbicas se requiere un poco de oxgeno al principio del proceso para favorecer el crecimiento y la reproduccin del microorganismo. En los procesos anaerobios, los microorganismos producen mucho menos energa que en los aerobios y, para suplir sus necesidades de energa, metabolizan una mayor cantidad de azucares; por consiguiente, elaboran ms metabolitos. Entonces, a travs de la cantidad de oxgeno, se puede manipular un proceso de fermentacin para incrementar la produccin de la sustancia de inters: Cuando se trabaja con un microorganismo facultativo (capaz de crecer en presencia o ausencia de oxigeno), como Saccharomyces cerevisiae, se obtienen diferentes productos mayoritarios, segn la concentracin de oxgeno en el medio: si es muy limitada, habr una mayor produccin de etanol, mientras que si es alta, se favorece la reproduccin del microorganismo, o sea, la produccin de biomasa38.

37 38

WALKERJ.M. E.B. Gingold. Biotecnologa Molecular, , Edicin, Acribia, S.A. Pg. 5-6 Hernndez, Alicia. Microbiologa industrial. 2003. Editorial EUNED. Edicin 1. pg. 39

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Cultivo en lote Es un sistema cerrado, porque, despus de iniciado el proceso (al mezclar los nutrimentos y el microorganismo), solo se adiciona oxgeno, antiespumantes y bases o cidos para el control de pH. La fermentacin se lleva a cabo en un periodo definido de tiempo, durante el cual varia la composicin del medio de cultivo, la concentracin de biomasa y la de metabolitos. Despus, se interrumpe el proceso y se recupera el producto. Para realizar exitosamente una fermentacin en lote, es necesario conocer la curva de crecimiento del microorganismo: al saber el comportamiento de su crecimiento , se pueden manipular las condiciones de manera que se obtenga el producto deseado, por ejemplo si lo que se requiere es la produccin de metabolitos primarios , se debe alargar la fase logartmica; si son metabolitos secundarios, se extiende la fase estacionaria y, para aumentarla cantidad de biomasa, se buscan las condiciones de mayor produccin de clulas. Cultivo continuo Se puede describir como un sistema abierto, y a diferencia del cultivo por lotes, se adiciona constantemente medio de cultivo fresco a los microorganismos, a una determinada velocidad, y se extrae caldo de fermentacin (medio de cultivo con microorganismos y metabolitos), a las mismas velocidades. As, se logra mantener en el reactor, una poblacin estable de microorganismos en condiciones uniformes. En muchas fermentaciones, el compuesto de inters se produce durante la fase exponencial; al respecto, una de las ventajas del sistema continuo es que se puede mantener estable la poblacin en esta fase por periodos prolongados de tiempo. Para que el cultivo continu sea efectivo es necesario que el proceso se encuentre en estado estacionario. El estado estacionario se define como una condicin de estabilidad, en la que varios factores permanecen constantes a travs del tiempo; entre ellos, el volumen del cultivo, la concentracin celular y de metabolitos, y las condiciones fisicoqumicas necesarias para el desarrollo del proceso. Como resultado de la estabilidad, los procesos fermentativos se pueden mantener por largos periodos, siempre y cuando el sistema se mantenga libre de contaminacin. El cultivo continuo se ha utilizado para fabricar una serie de productos, entre ellos, la cerveza y el etanol; tambin, se ha utilizado en el tratamiento de aguas residuales. Algunas sustancias obtenidas por fermentacin continua son: acetona, cloranfenicol, cido actico, etanol, cido ctrico, estreptomicina, cido gluconico, glucosa-isomerasa, cido itacnico, glicgeno, cido lctico, penicilina, butano, penicilinasa, butanodiol. Protena unicelular, celulasa y vitamina B1239.
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Hernndez, Alicia. Microbiologa industrial. 2003. Editorial EUNED. Edicin 1. pg. 51-54

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Condiciones que deben medirse y controlarse en una fermentacin discontinua. Una vez que el sustrato y el organismo han sido seleccionados es necesario darles las condiciones adecuadas de operacin y optimizacin del sistema. Desde el punto de operacin es importante decidir las siguientes variables: temperatura, pH, Brix, nutrientes y productividad entre otras. Una de estas variables se mide de manera continua y otras intermitentemente. Las variables que se puede medir de manera continua son: temperatura, pH, Brix, nutrientes y las variables que se puede medir de manera intermitente son: biomasa, producto y consumo de sustrato. Temperatura La temperatura ejerce un marcado efecto sobre la velocidad metablica del organismo. La temperatura tiene una influencia directa sobre la velocidad de reaccin y esta puede cambiar la configuracin de los constituyentes celulares, especialmente de las protenas y de los componentes de la membrana. La temperatura optima de crecimiento de las levaduras especialmente de la Saccharomyces cerevisiae es de 30 a 35C. La temperatura afecta al organismo de manera notable ya que los organismos de una especie dada solo pueden crecer en un rango de temperatura y esto afecta de manera notable al organismo. pH La acidez o alcalinidad de una solucin se expresa por su ndice de pH en una escala de 0 a 14. Es importante recordar que el pH es una funcin logartmica, un cambio en una unidad de pH representa un cambio de diez veces en la concentracin de iones hidrogeno. El pH tiene un marcado efecto en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento. El pH ptimo para algunos organismos en especial para las levaduras se encuentra en un rango de 4.0 a 6.0. Un cambio en el valor de pH puede afectar su composicin o su naturaleza de la superficie microbiana al disociarse cidos y bases. Este ltimo21puede afectar la floculacin de la biomasa o la adhesin a las paredes. El pH tiene una gran influencia en los productos finales del metabolismo anaerobio40.

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NIETO, GALARZA. (2009). Evaluacin de las condiciones de la fermentacin alcohlica utilizando Saccharomyces cerevisiae y jugo de caa de azcar como sustrato para obtener etanol. Extrado del sitio web de la escuela politcnica del ejrcito ecuatoriano.http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/990/1/T-ESPE-026782.pdf

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Brix El Brix o grados Balling es otra escala del hidrmetro utilizada en la industria azucarera. Normalmente las escalas Brix se calibran a 15.6 a20C. Conla escala a 20C, cada Brix indica 1 gramo de sacarosa por cada 100 gr de lquido. Aireacin La ausencia o abundancia de oxigeno permite una seleccin tanto de microorganismo como de productos metablicos. Cuando el cultivo se produce en presencia de oxigeno molecular, la fermentacin se denomina fermentacin aerbica y cuando se realiza en ausencia de oxigeno molecular se denomina anaerbico. Si la fermentacin es anaerbico, la mayor parte del carbono se emplea como energa y solo el 2% se asimila como material celular. Saccharomyces cerevisiae es una levadura que posee alta actividad metablica, por lo que en un proceso fermentativo en base aerbica se caracteriza por la produccin de biomasa y en base anaerbica generalmente por la produccin de etanol. Principios del crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos puede verse como el incremento de material celular expresado en trminos de masa o nmero de clulas y procede de una serie de pasos biolgicos coordinados y muy complicados catalizados enzimticamente. El crecimiento depender de la disponibilidad y transporte de nutrientes necesarios para la clula y su subsiguiente captacin y del mantenimiento ptimo de los parmetros medioambientales tales como la temperatura, pH y la aireacin. La cantidad de biomasa o de un componente celular especfico en un biorreactor puede determinarse gravimtricamente (por peso seco, peso hmedo, DNA, o protena) o numricamente para los sistemas unicelulares (por nmero de clulas). El tiempo de duplicacin hace referencia al periodo de tiempo requerido para la duplicacin del peso de la biomasa, mientras que el tiempo de generacin se refiere al periodo necesario para duplicar el nmero de clulas. Los tiempos de duplicacin medios se incrementan con el aumento del tamao celular. La tabla 5 muestra el tamao de las clulas de algunos microorganismos utilizados en procesos biotecnolgicos.

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Tabla 5. Tamao de clulas en procesos Biotecnolgicos Tamao aproximado de las clulas usadas en procesos biotecnolgicos Tipo celular Tamao (m) Bacterias 1x2 Levaduras 7 x 10 Clulas de mamfero 40 x 40 Clulas Vegetales 100 x 100
Fuente: SMITH, John E. Biotecnologa. 2006. Editorial Acribia. Edicin 4. Pg. 53

Un organismo raramente tendr condiciones totalmente ideales para un crecimiento ilimitado; ms bien, el crecimiento depender de un factor limitante, por ejemplo un nutriente esencial, a medida que la concentracin de este factor cae tambin lo har el potencial de crecimiento del organismo41. Levaduras Estn agrupadas en unas 350 especies (clasificadas a su vez en 39 gneros), lo que muestra que dentro de los hongos constituyen un pequeo grupo. Las levaduras son bastante heterogneas en su morfologa y fisiologa; sin embargo, la forma habitual en que se les encuentra es la unicelular. Algunas, adems de la forma unicelular o de levadura, pueden presentar micelio. Ambas formas, en estos casos, dan simultneamente en el medio donde se encuentra el microorganismo. La figura 9 ilustra las distintas formas de levadura que se pueden encontrar. Figura 9. Esquema de distintas formas de levadura.

Fuente: GARCA CORTES, Vera. Introduccin a la microbiologa. 2004. Editorial EUNED. Edicin 2. Pg. 109

Es importante sealar que las condiciones ambientales influyen para que algunos hongos crezcan como filamentos o como levaduras. Este fenmeno, que se conoce como dimorfismo, se presenta en varios hongos patgenos.

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SMITH, John E. Biotecnologa. 2006. Editorial Acribia. Edicin 4. Pg. 53-54

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Las levaduras se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, localizada en el suelo, en la superficie de las frutas, en el nctar de las flores y en ambientes acutico. A continuacin la figura 10 ilustra los componentes internos de la clula de la levadura Figura 10. Diagrama de la estructura de una levadura.

Fuente: GARCA CORTES, Vera. Introduccin a la microbiologa. 2004. Editorial EUNED. Edicin 2. Pg. 109

Requerimientos nutricionales Las levaduras son organismos hetertrofos, por lo tanto, requieren de carbono orgnico para la sntesis obtener la energa y el carbono para la sntesis de sus componentes celulares. Sin embargo, los requerimientos nutricionales especficos de las levaduras pueden variar entre las diferentes especies. Los azucares constituyen el mejor alimento energtico de las levaduras. Muchas pueden catabolizar la glucosa, ya sea en forma aerobia (respiracin) o anaerbica (fermentacin). El proceso tpico es la disimilacin anaerobia, conocido comnmente como fermentacin alcohlica, el cual da como resultado etanol y dixido de carbono.

Las levaduras requieren, como otros seres, minerales para su crecimiento. Se ha determinado que le potasio, el magnesio, el sodio y el calcio se incluyen dentro de los necesarios. En relacin con los elementos traza, se ha demostrado que para obtener un rendimiento ptimo en medios de cultivo sintticos se requiere la presencia de boro, cobre zinc, manganeso, hierro, iodo y molibdeno. La mayor parte de las levaduras crece mejor en medios en los que est disponible una buena cantidad de agua. Sin embargo, muchas de ellas pueden crecer en medios con relativamente poca cantidad de agua como en soluciones con una 35

concentracin elevada de solutos (sal o azcar), por lo que puede decirse que en general requieren para su crecimiento menos humedad que las bacterias 42. Condiciones ambientales requeridas para el crecimiento. Oxigeno Las levaduras crecen bajo condiciones aerobias. Algunas son estrictamente aerobias y otras son facultativas. Las facultativas crecen mejor en aereobiosis y bajo condiciones anaerobias lo hacen ms lentamente. Las levaduras aerobias estrictas se conocen como oxidativas; y las que pueden desarrollarse en medios aerobios como en anaerobios se denominan fermentativas. pH En general se considera que las levaduras, al igual que los mohos, se desarrollan mejor en medios cidos (3,8 - 5,6). Sin embargo, estas pueden tolerar un rango de pH que va desde 2 a 8. Temperatura Existen levaduras que pueden crecer a muy diversas temperaturas, generalmente en un rango que va desde 0 a 50 C. la mayora de las especies saprofitas, sin embargo, tienen temperaturas optimas de crecimiento entre los 22 y los 30 C. Concentracin de solutos Generalmente pueden desarrollarse en medios con concentraciones altas de solutos. Existe un grupo que tolera cantidades de solutos mayores, por lo que se denominan osmfilas. Estas tienen importancia en el deterioro de alimentos tales como la miel de abeja, los siropes y los concentrados de fruta43. Curva de crecimiento de un microorganismo Esta curva representa el comportamiento del crecimiento del microorganismo a travs del tiempo, con base en ella, se determina cuando se produce la mayor cantidad de biomasa o metablicos (primarios o secundarios). La figura 11 ilustra el crecimiento de un microorganismo en el tiempo.

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Fuente: GARCA CORTES, Vera. Introduccin a la microbiologa. 2004. Editorial EUNED. Edicin 2. 112 p. 43 GARCA CORTES, Vera. Introduccin a la microbiologa. 2004. Editorial EUNED. Edicin 2. Pg. 112-114

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Figura 11.Curva de crecimiento de un microorganismo.

Disponible en: http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/generalidades.html Fecha: 10/05/2012

Fase de latencia Tambin conocida como fase lag; coincide con el periodo de adaptacin del microorganismo a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales. Se presenta inmediatamente despus de la inoculacin y su duracin depende del estado fisiolgico de la clula inoculada y de las condiciones ambientales. Si el microorganismo se encuentra en su fase logartmica antes de la inoculacin, la fase lag es muy pequea o puede no presentarse. Durante este periodo no existe aumento en el nmero de clulas, pues el microorganismo utiliza la energa disponible con el fin de sintetizar las enzimas que requiere para su desarrollo en el nuevo medio. Fase logartmica o exponencial. En esta fase las clulas se multiplican a la mxima velocidad y su crecimiento puede ser cuantificado con base en el nmero de clulas que se producen por unidad de tiempo (para levaduras y bacterias) o por el aumento en la biomasa por unidad de tiempo (para hongos filamentosos). La velocidad de crecimiento durante este periodo permanece constante y es independiente de la concentracin del sustrato, siempre y cuando esta sustancia se encuentre en exceso.

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La fase logartmica termina cuando se produce alguna de estas tres situaciones: los nutrimentos se agotan, las condiciones ambientales indispensables para la clula se modifican o cuando la clula produce metabolitos txicos o que inhiben su reproduccin. Fase estacionaria La velocidad de crecimiento (reproduccin) del microorganismo es igual a la velocidad de muerte y se llega a un equilibrio celular. La importancia de esta fase vara con el tipo de fermentacin. Si el objetivo final de la fermentacin es la produccin de etanol, no es necesario (ni rentable) continuar el proceso cuando se alcanza la fase estacionaria, ya que una vez que se obtiene la mxima concentracin de las clulas, la produccin de etanol disminuye. Por el contrario en la produccin de antibiticos, la mayor acumulacin de estas sustancias se presenta durante la fase estacionaria44. Fase de muerte Se inicia cuando los nutrimentos que estn en el medio de cultico no son suficientes para que el microorganismo pueda reproducirse. Otro de los motivos por los cuales empieza esta etapa es la produccin, como parte del metabolismo, de sustancias toxicas que impiden la multiplicacin de las clulas. 2.2.12 Etanol. El compuesto qumico etanol es un alcohol que se presenta como un lquido incoloro e inflamable con un punto de ebullicin de 78C. Al mezclarse con agua en cualquier proporcin, da una mezcla azeotrpica. Su frmula qumica es CH3 CH2 -OH y su frmula molecular es C2H5OH. El etanol est presente en diversas bebidas fermentadas. Desde la antigedad se obtena el etanol por fermentacin anaerbica de una disolucin con contenido en azcares con levadura y posterior destilacin. Dependiendo del gnero de Bebida alcohlica que lo contenga, el alcohol aparece acompaado de distintos elementos qumicos que lo dotan de color, sabor, olor, entre otras caractersticas. Separacin de la Mezcla Agua-Etanol (Destilacin). Para obtener etanol libre de agua se aplica la destilacin azeotrpica en una mezcla con benceno o ciclo hexano. De estas mezclas se destila a temperaturas ms bajas el azetropo, formado por el disolvente auxiliar con el agua, mientras que el etanol se queda retenido. Otro mtodo de purificacin muy utilizado actualmente es la absorcin fsica mediante tamices moleculares A escala de laboratorio tambin se pueden
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HERNNDEZ, Alicia. Microbiologa industrial. 2003. Editorial EUNED. Edicin 1. pg. 43-45

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utilizar disecantes como el magnesio, que reacciona con el agua formando hidrgeno y xido de magnesio. Aplicacin. Adems de usarse como bebida alcohlica, el etanol se utiliza ampliamente en muchos sectores industriales y en el sector farmacutico, como principio activo de algunos medicamentos y cosmticos .Segn su pureza el etanol recibe distintas nominaciones:- Alcohol Industrial: Es alcohol etlico, normalmente de alta graduacin, producido y vendido para cualquier uso, excepto bebidas. Se distribuye generalmente en forma de alcohol puro (96% en volumen), alcoholes naturalizado (mezclado con sustancias amargas o toxicas que lo convierten en no apto para consumo en licores) y mezclas de solventes de marca registrada. Muchas medicinas, productos alimenticios, condimentos y cosmticos no se podran producir sin l. Se utilizan para producir vacunas, tnicos compuestos, jarabes, tintes, antispticos, cloroformo, barbitricos, pegamentos, cosmticos, detergentes, explosivos , tintas, cremas , plsticos y textiles. Alcohol Absoluto: Se usa como reactivo en laboratorio o en biomedicina, como combustible en motores de explosin y tambin en mltiples procesos industriales. Se produce deshidratando alcohol puro de 96%, por medio de cido sulfrico concentrado, cloruro de calcio anhidro o almina. Gasohol: Es un sustituto de la gasolina, hecho de una mezcla de gasolina y de 10% a 20% de etanol45. El gasohol posee un octanaje ms alto que la gasolina normal y quema a menor temperatura, por lo cual produce menores emisiones contaminantes tipo NOx. Toxicologa. El etanol puede afectar al sistema nervioso central, provocando estados de euforia, desinhibicin, mareos, somnolencia, confusin y alucinaciones. Con concentraciones ms altas impide la coordinacin correcta de los miembros, prdida temporal de la visin, etc. En ciertos casos se produce un incremento en la irritabilidad del sujeto intoxicado como tambin en la agresividad; en otra cierta cantidad de individuos se ve afectada la zona que controla los impulsos, volvindose impulsivamente descontrolados y frenticos, finalmente, conduce al coma y puede provocar la muerte. La resistencia al alcohol parece aumentar en las personas adultas, de mayor peso y de menor altura, mientras que los nios son especialmente vulnerables. Se han comunicado casos de bebs que murieron por intoxicacin debida a la inhalacin de vapores de etanol tras haberles aplicado trapos impregnados de alcohol. La ingesta en nios puede conducir a un retardo mental agravado o aun

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E. Tiezzi. Tiempos histricos, tiempos biolgicos.(la tierra o la muerte: los problemas de la nueva ecologa. Fondo de cultura econmica. Mxico. 1990. 215 p.

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subdesarrollo fsico y mental46.En el anexo se encuentra la ficha tcnica del etanol o alcohol etlico 2.2.13 DESTILACIN La destilacin es una operacin unitaria que consiste en la separacin de los componentes de una mezcla lquida (en la que todos los compuestos son ms o menos voltiles) por evaporacin y condensacin sucesivas. La separacin se basa en la diferencia de volatilidades absolutas de los componentes, lo que tiene como consecuencia la formacin de un vapor de composicin diferente a la del lquido del que procede. Lgicamente, cuanto mayor sea la diferencia de volatilidades mayor ser la separacin que se puede conseguir. Para el clculo de la composicin del vapor que se desprende se supondr que ste se encuentra en equilibrio con la fase lquida presente en cada instante. Los distintos mtodos empleados en la destilacin se pueden clasificar del siguiente modo: Destilacin simple: Abierta Intermitente o diferencial. Continua. Cerrada o de equilibrio. Destilacin con enriquecimiento de vapor: Repetida. Condensacin parcial. Rectificacin Continua Intermitente. Destilacin con arrastre de vapor. La destilacin simple se caracteriza porque no se establece ningn tipo de contacto entre el vapor generado por el lquido que hierve y un lquido cualquiera, de composicin diferente a la del equilibrio; es decir, el vapor generado y el lquido en ebullicin estn en equilibrio. Puede ser abierta o cerrada. En la destilacin simple cerrada o de equilibrio, tambin llamada destilacin sbita o destilacin flash, el producto a destilar se calienta y luego se descarga en un recipiente a presin muy reducida, donde experimenta una expansin sbita que conduce a la
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JIMENEZ, Sonia. MARBELLO, Linda Luz y ACEVEDO, Evelin. Evaluacin comparativa de la actividad fermentativa de Clulas libres e inmovilizadas de Saccharomyces cerevisiae Sobre cscaras de naranja y gluten. para la obtencin de Grado el Ttulo de ingeniero Qumico. Cartagena. 2008

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formacin de las dos fases, vapor y lquido, en equilibrio. En la destilacin simple abierta se carga una caldera, de forma intermitente o de forma continua, y el destilado se va recogiendo a la salida de un condensador. Obsrvese que, mientras que en la destilacin simple abierta continua y en la destilacin simple cerrada, la composicin del lquido que hierve y la del destilado que se recoge (en fase vapor o en fase lquida, tras su condensacin) permanecen constantes con el tiempo, en la destilacin simple abierta diferencial, la composicin del lquido cambia de forma continua y, en consecuencia, tambin lo hace la del vapor; por tanto, el destilado que se va acumulando a la salida del condensador tendr una composicin que ser el resultado de la acumulacin de los sucesivos destilados de composicin variable y, por tanto, no estar en equilibrio con el lquido que va que dando en cada momento en la caldera. Destilacin simple abierta diferencial La destilacin simple abierta diferencial es una operacin intermitente en la que la mezcla a destilar se carga en la caldera, donde se suministra el calor necesario para llevarla a su temperatura de burbuja. En ese instante comienza la ebullicin, que se mantiene mientras se va eliminando continuamente el vapor generado. Este vapor se condensa en el exterior dando lugar al producto destilado. Conforme transcurre el proceso se va modificando la composicin del lquido, ya que se eliminan preferentemente los componentes ms voltiles, con lo cual va aumentando, consiguientemente, la temperatura de burbuja de la mezcla. Lgicamente, el vapor (siempre en equilibrio con el lquido en la caldera) tambin cambiar continuamente su composicin, empobrecindose en el componente ms voltil. El calor debe suministrarse en la caldera de modo que en todo instante el vapor generado est en equilibrio con el lquido en la caldera. Debe por tanto compensar las prdidas, el calor latente de vaporizacin y el calor sensible del lquido. Lgicamente, en este proceso tampoco podr haber reflujo (el vapor se debe eliminar instantneamente y separarse del lquido). Estas condiciones pueden ser difciles de conseguir en la prctica. El proceso se contina hasta que se alcanza la separacin deseada. Este tipo de destilacin se usa frecuentemente en trabajos de laboratorio y en plantas piloto. El destilado puede recogerse en distintos recipientes, en funcin de su composicin, lo que se conoce como destilacin fraccionada. Tambin se utiliza con fines analticos en caracterizacin de fracciones de petrleo o distintos productos (por ejemplo en algunas normas ASTM para la determinacin de intervalos de destilacin). La figura 12 muestra como se realiza el proceso de destilacin y la figura 13 un montaje a nivel de laboratorio de un proceso de destilacin simple.

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Figura 12. Diagrama de flujo proceso de destilacin

Figura 13. Equipo de destilacin simple

Fuente:http://www.monografias.com/trabajos83/destilacionsimple/destilacionsimple.shtml fecha:: 24/04/2011

2.3

MARCO LEGAL

A continuacin se hace mencin a la normativa en Colombia relacionadas con el alcohol como combustible. Ley 693 de 2001 (Uso de alcoholes carburantes en Colombia) en donde se estableci lo siguiente: Las gasolinas que se utilicen en el pas, tendrn que contener compues tos Oxigenados tales como alcoholes carburantes. Se decreto que el uso del alcohol carburante recibir un tratamiento especial en las Polticas sectoriales de autosuficiencia energtica de produccin agropecuaria y de Energtica, generacin de empleo. A partir de septiembre 2005, las ciudades de ms de 500.000 habitantes deben tener gasolina oxigenada. Alcohol Carburante.

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ESTMULOS TRIBUTARIOS Ley 788 de 2002 (Reforma Tributaria) en donde se dan incentivos tributarios a la produccin de alcohol carburante, los artculos de mayor importancia en esta reforma fueron: ARTCULO 31: Se declara exento del IVA al alcohol carburante con destino a la mezcla con el combustible motor. ARTCULO 88: Se exoner del pago del impuesto global y de la sobretasa al porcentaje de alcohol carburante que se mezcle con la gasolina motor. Subsidios por us$80 millones para los productores47.

DECRETO ZONAS FRANCAS (Decreto 383 de 2007), en este decreto se establecen estmulos para la implementacin de zonas francas para de biocombustibles Tasa de proyectos agroindustriales en materia renta diferencial y beneficios en materia de exenciones de aranceles en bienes de capital proyectos con potencial exportador). CALIDAD DEL COMBUSTIBLE (Resolucin 447 de 2003), modificada por la resolucin 1565 de 2004 (Ministerios del Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial y Minas y Energa), se establecen los requisitos tcnicos y ambientales de los alcoholes carburantes y los combustibles oxigenados que se vienen distribuyendo en el pas desde el ao 2005 PRECIOS Resolucin 18 0222 de 2006 (Ministerio de Minas y Energa), Se defini una banda de precios que toma el mayor valor entre un precio de estabilidad de $4.594 pesos por galn para el Alcohol Carburante (que es equivalente aproximadamente a US$2.26 dlares por galn), recientemente definido y un precio que reconoce los costos de oportunidad de las materias primas que se utilizan en la produccin del alcohol (Paridad exportacin del azcar refinado). Actualmente se viene ajustando el precio gradualmente con el fin de alcanzar el precio piso48. REGLAMENTACION TECNICA Resolucin 18 0687 de 2003, modificada a travs de la resolucin 18 de Ministerio de Minas y Energa), con esta resolucin Se defini la regulacin tcnica en

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Disponible en: www.secretariasenado.gov.co/senado/basedoc/ley/2001/ley_0693_2001.html Disponible en: Asociacin colombiana de productores y proveedores de caa de azcarprocaa.com

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relacin con la produccin, acopio, distribucin y puntos de mezcla de los alcoholes carburantes y su uso en los combustibles nacionales e importados

2.4

MARCO CONCEPTUAL

ALCOHOL ANHIDRO: es un alcohol que se ha sometido a un proceso de deshidratacin para eliminar el agua contenido en l. ALCOHOL CARBURANTE: es un compuesto inflamable que no tiene color y tiene olor caracterstico de los alcoholes. AZCAR: termino aplicado a cualquier compuesto qumico del grupo de los hidratos de carbono. BIOCOMBUSTIBLE: cualquier combustible slido, liquido o gaseoso producido a partir de materia orgnica. Se produce directamente a partir de plantas o indirectamente de desechos industriales, comerciales, domsticos o agrcolas BIOMASA: se define como la energa solar convertida en materia orgnica por la vegetacin, que se recupera como combustin directa, o transformando la materia orgnica en otros combustibles. CARBOHIDRATOS: son los compuestos orgnicos ms abundantes de la biosfera y a su vez los ms diversos normalmente se los encuentra en las partes estructurales de los vegetales y tambin en los tejidos animales, como glucosa o glucgeno. COMBUSTIBLES FOSILES: sustancias ricas en energa que se han formado a partir de plantas y microorganismo enterrados durante mucho tiempo, los combustibles fsiles, que incluyen el petrleo, el carbn y el gas natural, proporcionan la mayor parte de la energa que mueven a la sociedad moderna. COMBUSTION: es un proceso qumico, una reaccin exotrmica entre una sustancia (combustible) y un gas (oxidante), generalmente O2 para lanzar calor. DESTILACION: mtodo de separacin de mezclas que se basa en el aprovechamiento de las diferencias de composicin de las mezclas liquidas y de vapor originadas por la vaporizacin parcial de una mezcla liquida o por la condensacin parcial de una mezcla vapor. ENZIMA: es un biocatalizador de naturaleza proteica cualquiera de las numerosas sustancias orgnicas especializadas compuesto por polmeros de aminocidos, que actan como catalizadores en el metabolismo de los seres vivos. Con su accin, regulan la velocidad de muchas reacciones qumicas. 44

FERMENTACION: cambios qumicos en las sustancias orgnicas por la accin de las enzimas. GLUCOSA: azcar monosacridos de formula C6H12O6 se encuentra en la miel y en el jugo de numerosas frutas. Se produce la hidrlisis de numerosos glucsidos naturales. HIDRLISIS: tipo de reaccin qumica en que una molcula de agua reacciona, con una molcula de una sustancia A-B en la que A y B representan tomos o grupos de tomos. En la reaccin, la molcula de agua se descompone n los fragmentos H+ y OH-, y la molcula AB se descompone en A+ y B-. Luego estos fragmentos se unen proporcionando los productos finales AOH y BH. pH: es el logaritmo negativo de la concentracin de los iones de hidrogeno. Es una escala numrica utilizada para medir la acidez y basicidad de una sustancia.

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DISEO METODOLGICO

3.1

TIPO DE INVESTIGACIN

El tipo de estudio que se desarrolla es explicativo porque se tomaron 81 muestras, debido a que eran 3 variedades de ame con 3 concentraciones y se midieron a 9 tiempos diferentes en la etapa de hidrolisis, y para la etapa de fermentacin se efectuaron 56 muestras, adems se efectuaron pruebas (DNS, cmara Neuvauer, refractmetro y Dicromato de potasio) para determinar el comportamiento de las variables (azucares reductores, concentracin de clulas, Brix y concentracin de alcohol) que rigen el proceso, se medirn concentraciones de sustratos y cantidades de aguas especficas, se realizaran clculos para determinar la cantidad de azucares que se obtenga de la hidrolisis. Adems se observ la relacin de ciertas variables que afectan el rendimiento del proceso que explicaran los resultados. De acuerdo a Roberto Hernndez Sampier el tipo de investigacin experimental se define como unestudio explicativo porque muchas veces los resultados experimentales no explican lo que en cierto fenmeno ha ocurrido. Este tipo de investigacin va ms all de la descripcin de conceptos o fenmenos o del relacionamiento entre conceptos; estn dirigidos a responder a las causas de los eventos fsicos o sociales. Como su nombre lo indica, su inters se centra en explicar por qu ocurre un fenmeno y en qu condiciones se da ste, o por qu dos o ms variables estn relacionadas. El tipo de diseo que se adopta es el experimental ya que se manipularon las variables independiente como son: la concentracin de reactivos y complejos enzimticos as como los complejos de la levadura manteniendo fijos los valores ptimos de temperatura y pH, con el fin de garantizar la accin efectiva de estos complejos, en los proceso de hidrolisis y fermentacin. Luego se observ cmo se ven afectadas las variables independientes en el proceso. Segn Roberto Hernndez el trmino experimento que va ms de acuerdo con un sentido cientfico del trmino, se refiere a un estudio de investigacin en el que se manipulan deliberadamente una o ms variables independientes (supuestas causas) para analizar las consecuencias de esa manipulacin sobre una o ms variables dependientes (supuestos efectos), dentro de una situacin de control para el investigador El tipo de enfoque es cuantitativo de acuerdo a la teora referenciada, esta investigacin cumple con todos los requisitos descritos. Los fundamentos de la metodologa cuantitativa se pueden encontrar en el positivismo. Donde la clave del positivismo lgico consiste en contrastar hiptesis probabilsticamente y en caso de ser aceptadas y demostradas en circunstancias distintas, a partir de ellas elaborar teoras generales. La estadstica dispone de instrumentos cuantitativos para contrastar estas hiptesis. Por tanto el mtodo 46

cientfico, tras una observacin, genera una hiptesis que contrasta y emite posteriormente unas conclusiones derivadas de dicho contraste de hiptesis. En general los mtodos cuantitativos son muy potentes en trminos de validez externa. La investigacin cuantitativa con los test de hiptesis no slo permite eliminar el papel delazar para descartar o rechazar una hiptesis, sino que permite cuantificar la relevancia clnica de un fenmeno midiendo la reduccin relativa del riesgo. El enfoque cuantitativo pretende acotar la informacin, medir con precisin las variables del estudio49. El enfoque cuantitativo se caracteriza por los siguientes pasos que emplea el investigador: Plantea un problema de estudio delimitado y concreto. Una vez planteado el problema de estudio delimitado y concreto Sobre la base de la revisin de la literatura construye un marco terico. De esta teora deriva hiptesis. Somete a prueba las hiptesis mediante el empleo de los diseos de investigacin apropiados. Para obtener tales resultados el investigador recolecta datos numricos de los objetos fenmenos o participantes. a) Las hiptesis se generan antes de recolectar y analizar los datos. b) La recoleccin de los datos se fundamenta en la medicin. c) Debido a que los datos son productos de mediciones, se representan mediante nmeros (cantidades) y se deben analizar a travs de mtodos estadsticos. d) En el proceso se busca el mximo control para lograr que otras explicaciones posibles distintas a la propuesta del estudio (hiptesis) sean desechadas y se excluya la incertidumbre y minimice el error. e) Los anlisis se interpretan a la luz de las prodiciones inciales (hiptesis) y de estudios previos (teora) f) La investigacin cuantitativa debe ser lo ms objetiva posibles. g) Los estudios cuantitativos siguen un patrn predecible y estructurando (el proceso). h) En una investigacin cuantitativa se pretende explicar y predecir los fenmenos investigados, buscando regularidades y relaciones causales entre elementos. i) Con los estudios cuantitativos se pretende explicar y predecir los fenmenos investigados.

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FERNADEZ, Pita y PRTEGAS Daz, S. Investigacin cuantitativa y cualitativa. Unidad de epidemiologia Clnica y Bioestadstica. La Corua (Espaa). 2002.

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j) Los datos generados poseen los estndares de validez y confiabilidad, las conclusiones derivadas contribuirn a la generacin de conocimiento. k) Este enfoque utiliza la lgica o razonamiento deductivo, que comienza con la teora y de esta se deriva expresiones lgicas denominadas hiptesis que el investigador busca someter a prueba. l) La bsqueda cuantitativa ocurre en la realidad externa del individuo 50. 3.2 POBLACIN Y MUESTRA

La poblacin tenida en cuenta para la produccin de etanol a nivel de laboratorio, fueron 3 kg del ame fresco de cada una de las 3 variedades (ame espino, ame diamante y ame baboso) que se comercializa en el mercado Bazurto de Cartagena, teniendo en cuenta que no tuvieran ningn tipo de problema de descomposicin, y para la extraccin del almidn solo se utilizo1,3 kg por cada variedad. La caracterizacin de las muestra se determin mediante un muestreo no probabilstico, debido a que no todos los sujetos de la poblacin tienen la misma probabilidad de ser elegidos, por lo tanto no garantizan la representativa de la muestra y as no permiten realizar estimaciones inferenciales sobre la poblacin. En este caso las concentraciones en cada punto del Erlenmeyer vara, por lo cual, al tomar la muestra no se garantiza que sta tenga un valor promedio o real, para ello se seleccionaron las muestras siguiendo determinados criterios procurando que sta sea representativa. Las muestras tomadas en la etapa de fermentacin fueron de 5ml en cada uno de los biorreactores por cada tipejo. 3.3 METODOLOGA UTILIZADA EN EL PROYECTO

La investigacin de la obtencin de etanol a partir de 3 variedades de ames se dividi en tres etapas: obtencin de la harina de ame, la hidrlisis enzimtica y la fermentacin, a continuacin se describir la metodologa llevada a cabo en estas tres etapas. 3.3.1 Obtencin de la harina de ame Para la obtencin de la harina de ame se pesaron 1.34 kg de cada una de las variedades y se procedi a ser pelados, a continuacin se procedi a lavarlos con una solucin de amoniaco 0.1M, con el fin de eliminar la babosidad del ame o el residuo mucilaginoso del tubrculo, luego se cortaron en trozos pequeos para poder rallarlo con ms facilidad y as lograr un completo secado, luego de secado fue molido, se procedi al proceso de tamizado para obtener las partculas ms
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Hernndez Sampier, Roberto Metodologa de la investigacin Editorial MC. Graw-Hill Mxico 2006

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finas, y finalmente fue empacado en bolsas ziploc. En la tabla 6 se ilustra la cantidad de ame utilizada, con el peso antes y despus del proceso de pelado. Tabla 6. Cantidad de ame utilizada en el proceso
Peso del ame (kg) Peso sin cascara 1,05 1,09 1,09

Variedades Peso con cascara D. Rotundata 1,34 D.Alata 1,34 D. Trifida 1,34
Fuente: los autores del proyecto

Peso de la cascara 0,29 0,25 0,25

A continuacin en la figura 14 se ilustra la metodologa utilizada en la obtencin de la harina de ame. Figura 14. Proceso de extraccin de harina de ame

Fuente: los autores del proyecto.

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3.3.2 Hidrlisis enzimtica Basado en investigaciones anteriores citadas en el captulo 2 de acuerdo al contenido de humedad los mejores rendimientos de etanol se han obtenido en el rango de concentraciones entre 10 y 16% en peso seco de la harina de ame, de acuerdo a estos lineamientos en esta investigacin se evaluaron los sustratos a 10.5, 13.5 y 15%m/v. La cantidad de harina de ame con la cual se trabaj fue de 68.25, 87.5 y 97.5 gramos para un volumen de agua de 650ml, que corresponde a las concentraciones de 10.5, 13.5 y 15%m/v respectivamente, esto se realiz por cada especie de ame. Este proceso de hidrolisis de la harina de ame se realiz en dos etapas: Licuefaccin y sacarificacin. Licuefaccin. Para esta primera etapa se utiliz la enzima Alfa amilasa suministrada por la empresa Procesos y Fermentacin S.A (Cartagena) en las cantidades y en las condiciones ptimas estipuladas en la ficha tcnica del fabricante de acuerdo a su actividad enzimtica, en la tabla 7 se observa las condiciones utilizadas de la enzima alfa amilasa en la etapa de hidrlisis. En el proceso de hidrolisis las soluciones preparadas se montaron en frascos de 750 ml con un volumen de reaccin de 650 ml, en total fueron 9 Biorreactores, 3 por cada variedad de ame D. Alata, D. Trfida y D. Rotundata (diamante, baboso y espino respectivamente) con sus respectivas concentraciones 10.5%, 13.5% y 15% m/v. Ya con las soluciones preparadas se les midi el pH y se ajust a 6.5 con una solucin de HCl 0.1N, luego se colocaron en horno con control de temperatura entre 90 95 C con un tiempo de residencia de 24 horas. Durante el tiempo de residencia de la enzima se realizaron mediciones; de los Brix, mediante el Refractmetro (modelo VBR90A) y azucares reductores, mediante la tcnica del cido 3,5 Dinitrosalicilico (DNS). Al momento de realizar la lectura de azucares reductores fue necesario diluir las muestras en 100 ml para que el espectrofotmetro pudiera captar un valor de absorbancia visible. En el anexo E se observa la tcnica de DNS, junto con la curva de calibracin empleada en la lectura de azucares reductores.

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Tabla 7. Condiciones de la enzima Amilasa Cantidad de enzima por concentracin (ml) 10,5% 13,5% 15% 0,042 0,042 0,042 0,054 0,054 0,054 0,072 0,072 0,072

Enzima Alfa D. Alata Amilasa D. Alfa Rotundata Amilasa Alfa D. Trfida Amilasa

Variedad

Temperatura 90 95 90 95 90 95

pH 6,5 6,5 6,5

Fuente: los autores del proyecto

Sacarificacin. Para esta etapa se agreg la enzima Amiloglucosidasa (AMG 300 L) para la obtencin de glucosa en mayor proporcin mediante la sacarificacin, esta fue suministrada por la empresa Nutrianlisis (Bogot) en las cantidades y en las condiciones ptimas estipuladas en la ficha tcnica del fabricante de acuerdo a su actividad enzimtica para este proceso, en la tabla 8 se ilustra las condiciones a las que se utilizo la enzima Amiloglucosidasa en la etapa de sacarificacin. Para la etapa de sacarificacin fue necesario ajustar el pH a 4.5 con una solucin de HCl 0.1N y se debi ajustar la temperatura a 55, ir al anexo B. Durante este proceso el tiempo de residencia de la enzima fue de 4 horas donde los azucares reductores se tornaron constante, durante este tiempo se efectuaron mediciones de grados Brix, y tambin se efectuaron mediciones de azucares reductores a partir de la tcnica del cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS). Tabla 8. Condiciones de la enzima AMG (Amiloglucosidasa) Cantidad de enzima por concentracin (ml) 10,5% 13,5% 15% 2,4 3,3 4,02 2,4 2,4 3,3 3,3 4,02 4,02

Variedad Enzima D. Alata AMG D. Rotundata AMG D. Trfida AMG

Temperatura C 55 55 55

pH 4,5 4,5 4,5

Fuente: los autores del proyecto

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En la figura 15 se presenta el resumen general del proceso de hidrlisis enzimtica. Figura 15. Esquema general del proceso de hidrlisis (D. Alata, D. Rotunda y D. Trfida)

Accin Enzimtica

Licuefaccin: Alfa amilasa

Sacarificacin: AMG 300

3 Biorreactores controlando Temperatura a 90 0C, pH de 6.5 muestreo durante 24horas. DNS y 0 Brix

3 Biorreactores controlando Temperatura a 55 0 C, pH de 4.5 muestreo durante 4horas. DNS y 0 Brix

Fuente: los autores del proyecto

3.3.3 Fermentacin Culminando el proceso de hidrlisis se procedi a filtrar cada uno de las biorreactores, para la obtencin del caldo glucosado que posteriormente sera fermentado, el volumen final de este caldo fue de 350 ml por cada uno de los 9 frascos, A continuacin los frascos se llevaron al proceso de esterilizado por 2 horas y posteriormente se sellaron lo ms hermtico posible, para que no se contaminaran con algn microorganismo hasta ser usados, en la figura 16 se observa los biorreactores despus de esterilizados.

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Figura 16. Hidrolizados Esterilizados

Fuente: autores del proyecto

Teniendo en cuenta que la investigacin era a escala de laboratorio y que el volumen del medio final fue de 350 ml se procedi a utilizar las relaciones correspondientes para este volumen, se utiliz 1 g de levadura y se le proporcionaron los nutrientes caractersticos para su crecimiento ((NH4)2SO4 (0,5g/l), KH2PO4 (0,25g/l) y (0,2g/l)MgSO4 . 7 H2O. se procedi a la adicin de levadura activa seca se humedeci en cada uno de los 9 fermentadores de 750 ml, agitndose hasta disolucin completa para estimular su crecimiento, periodo que alcanza los 20min hasta notar un aumento del volumen tres veces mayor al inicial esta etapa se le denomina etapa de inoculacin en donde se desea conseguir que el microorganismo reconozca el sustrato y se adapte ms fcil al medio y as estimular su crecimiento, el tiempo de fermentacin fue de 52 horas. En la tabla 9 se muestran las condiciones utilizadas en la fermentacin. Tabla 9. Condiciones en el proceso de la fermentacin

Variables Volumen del Rx pH Temperatura Cantidad de levadura Nutrientes para el crecimiento

Fuente: los autores

Cantidad/unidad 350 ml 4,66 - 5,06 26C 1g (0,5g/l) (NH4)2SO4 (0,25 g/l) KH2PO4 (0,2 g/l) MgSO4. 7H2O

Los fermentadores se sellaron con tapones elaborados con gasa y algodn; se adaptaron cnulas estriles las cuales permitiran la toma de las muestras y no hubiese contacto con el medio y este fuera contaminado, los tapones fueron

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asegurados con cinta de enmascarar para lograr el mayor hermetismo posible. En la figura 17 se ilustran los fermentadores sellados y hermetizados. Figura 17. Fermentadores usados

Fuente: los autores del proyecto

El proceso fermentativo se llev a cabo durante 52 horas, este tiempo fue un valor tomado de distintas referencias citadas en el captulo 2 (Marco de referencia) donde aconsejan que este sea entre 2 y 3 das, aunque la gran mayora de las investigacin de fermentaciones de tubrculos este tiempo no sobrepasa las 50 horas, durante el proceso fermentativo se tomaron 3 muestras diarias, con el fin de conocer y evaluar el comportamiento de las variables en esta etapa, se evaluaron los valores de pH, los Brix, la concentracin de etanol y el crecimiento microbiano. La toma de muestras en esta etapa se midieron tres veces por da de cada uno de los fermentadores y los anlisis que realizaron fueron: lecturas de pH en donde se utiliz un peachimetro digital, para la medicin de los Brix se utiliz el Refractmetro (Modelo VBR90A), se le aplico tambin la tcnica de DNS para conocer la concentracin de azucares reductores presentes en la fermentacin, adems para la medicin de la concentracin de etanol se aplic el mtodo de dicromato de Potasio mediante espectrofotometra (Spectronic 20D+ Instruments), y para el crecimiento microbiano se realiz por conteo directo en la cmara de Neuvauer. En la figura 18 se ilustra en donde se conservaban las muestras para su posterior anlisis.

54

Figura 18. Toma de muestras

Fuente: los autores del proyecto

Lecturas de pH En la etapa de inoculacin se hizo el ajuste respectivo de pH en cada uno de los medios para el buen funcionamiento de la levadura y estuvo en un rango de 4.66 a 5.06. Las lecturas se efectuaron mediante la utilizacin de un pH metro digital y estas se realizaron 3 veces por da. Se not durante todo el proceso para las 3 especies q hubo variaciones de pH debido a que en la fermentacin hay formacin de cido lctico pero en este caso prevaleci la formacin de etanol. En la figura 19 se ilustra la toma de la lectura de pH. Figura 19. Lecturas de pH

Fuente: los autores del proyecto

55

3.3.4 Destilacin El liquido fermentado se procedi a filtrar mediante papel filtro para eliminar los slidos presentes (biomasa) y el liquido final se procedi ha realizar la separacin del producto de nuestro inters (etanol) mediante el proceso de destilacin, para esto se realiz el montaje del equipo de destilacin en el laboratorio de ingeniera de la Universidad de San Buenaventura, el alcohol separado se procedi a envasar en frascos con sus respectivas etiquetas con la variedad y su respectiva concentracin. En la figura 20 se ilustra el montaje del equipo de destilacin. Figura 20. Montaje del equipo de Destilacin.

Fuentes: autores del proyecto

3.4

RECOLECCION DE LA INFORMACIN

3.4.1 Fuentes primarias. Las fuentes primarias que se utilizaron para la realizacin de la investigacin se obtuvo a partir de los diferentes experimentos y pruebas a realizar en el laboratorio, como la tcnica de DNS que permiti conocer la cantidad de azucares presentes durante la etapa de hidrolisis y fermentacin, tambin el mtodo colorimtrico para cuantificar el etanol (Dicromato de potasio), en donde con el anlisis de los resultados pudo establecer que tan viable es el proyecto. Tambin se utiliz las asesoras y consultoras con docentes especialistas en el tema de investigacin, que aportaron informacin de gran importancia para elaborar y ejecutar el proyecto de forma adecuada. 3.4.2 Fuentes secundarias. Se utilizaron recursos bibliogrficos, libros, revistas, artculos especializados, etc. Otra fuente de informacin que ayudarn al desarrollo de la investigacin est relacionada en su mayora por el internet, donde se ha obtenido la mayor parte de la informacin, as como tesis, manuales, prensa. 56

3.5

INSTRUMENTOS

3.5.1 Instrumentos y equipos Se utilizaron una gran cantidad de equipos e instrumentos durante la investigacin la tabla 10 muestra cada uno de estos elementos. Tabla 10. Equipos e instrumentos de laboratorio
EQUIPOS espectrofotmetro Refractmetro Densmetro Medidor de Ph Balanza Analtica Secador de Bandejas Refrigerador Equipo de filtracin al vacio Incubador Equipo de Destilacin Simple
INSTRUMENTOS Beaker Esptula Vidrio de Reloj Polica Mortero Erlenmeyer mechero Molino Rallador Matraz de 500 y 1000 ml Peras de Succin

3.5.2 Materias primas y reactivos Los reactivos utilizados en el proyecto se muestran a continuacin en la tabla 11. Tabla 11. Lista de materias primas y reactivos
MATERIAS PRIMAS Y REACTIVOS harina de ame Amilasa Amiloglucosidasa Saccharomyces cereviciae Acido Sulfrico Depurado Yoduro de Potasio Sodio Sulfito Anhidro Tiosulfato de Sodio Pentahidratado Fenol o acido Fenico Hidrxido de Sodio Dicromato de Potasio Glucosa Anhidra Acido 3,5- Dinitrosalicilico
Fuente: los autores del proyecto

57

3.6

HIPTESIS

3.6.1 Hiptesis nula Estableciendo los parmetros fisicoqumicos y biolgicos (concentracin glucosa, pH, humedad, temperatura) ser posible obtener etanol con 10% v/v. 3.6.2 Hiptesis alternativa Estableciendo los parmetros fisicoqumicos y biolgicos (concentracin glucosa, pH, humedad, temperatura) ser posible obtener etanol con una %v/v diferente al 10%v/v. 3.7 VARIABLES

3.7.1 variables independientes Concentracin de levadura /sustrato Concentracin de almidn de ame en la solucin Concentracin de enzima / sustrato Temperatura pH 3.7.2 Variables dependientes Concentracin de etanol Concentracin de Azucares reductores Grados Brix Concentracin de microorganismos Rendimiento

58

3.8

OPERACIONALIZACION DE VARIABLES

La Tabla 12 muestra la operacionalizacin de todas las variables que se tomaron para la investigacin. Tabla 12. Operacionalizacin de las variables

Variable
Variable independiente Concentracin de harina de ame en la solucin Concentracin de enzima Concentracin de levadura sustrato Temperatura pH Variable dependiente Concentracin de etanol Rendimiento de etanol Concentracin de microorganismo Concentracin de azucares reductores Grados Brix
Fuente: autores del proyecto

Dimensin
Fsica Fsica Fsica Fsica Qumica

Indicador
g/l L g C pH
0

Fsica Fsica Fsica Fsica Fsica

g/L l/kg UFC/ml g/L

3.9

PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIN

Para la realizacin del proyecto de grado, se analiz la informacin recolectada (internet, revistas, monografas), los datos obtenidos de las experiencias en el laboratorio y el estudio de las condiciones tcnicas para el desarrollo del proceso. Esta informacin se organiz en tablas, cuadros y graficas en Excel. Se describieron cada uno de los cambios observados durante el proceso. Se analizaron las variables antes mencionas, las cuales son claves en la sntesis del producto deseado. El anlisis de las variables, en conjunto con los resultados que se obtuvieron en experimentos y pruebas en el laboratorio (DNS o azucares reductores, Brix anlisis colorimtrico con Dicromato de potasio), mostraron que tan viable puede ser el proyecto, adems de las recomendaciones que se ofrecern para el mejoramiento del mismo.

59

RESULTADOS

4.1 Comportamiento de Dioscorea Alata en la hidrlisis enzimtica. En la grfica 1 se observa el comportamiento de ART de la variedad de ame Dioscorea Alata, en donde se refleja cmo estos van en aumento a medida que se adicionan las enzimas y transcurre el tiempo. Al examinar los resultados de esta variedad se observa que la concentracin de 15%m/v presento los valores ms bajos de concentracin de azucares al iniciar la hidrolisis enzimtica con un valor de 1,57g/L que indica que hubo problemas de experimentacin a la hora de la preparacin de la solucin, existan partculas ms grandes y no se tuvo en cuenta y esto dificulto la degradacin de la enzima a lo largo de la etapa de la licuefaccin, afectando la conversin de almidn en azucares reductores. En la concentracin de 10.5% la conversin de almidn en ART a lo largo de todo el proceso fue normal, presentando como valor final de 57.12g/L, inicialmente haba una concentracin de 4,32 g/L, la concentracin de 13.5% m/v inicio con los valores ms altos de ART y se observa un aumento en la concentracin de forma abrupta, pero a partir de la 10 horas se empez a regular y a las 24 horas posee una concentracin de ART similar al de la concentracin de 15%m/v. Con la adicin de la enzima alfa amilasa se refleja su gran importancia en la primera etapa de la hidrolisis (licuefaccin) por como aumenta la velocidad y alteracin qumica de la composicin qumica del almidn de ame, haciendo referencia de la concentracin de azucares reductores finalizando as esta primera etapa y dando as paso a la ejecucin de la etapa de sacarificacin, en donde se adiciono la enzima AMG 300L que cobra un papel definitivo en este proceso, dando una aumento en la concentracin de azucares de manera transcendental y vertiginoso en todas las variedades. En esta variedad las concentraciones de azucares con la adicin de la enzima AMG 300L varan desde 35,02g/L a 57.12g/L para la concentracin de 10,5%, en la concentracin de 13,5%m/v los valores oscilan entre 53,82g/L a 69,68g/L y para la concentracin de 15%m/v los valores oscilaron entre 47,32g/L y 61,32g/L, finalizando as la etapa de hidrolisis, con este anlisis se observa que la mayor concentracin para esta variedad lo presento la concentracin de 13,5% con un valor de 69,68g/L

60

Grfica 1. Comportamiento de azucares reductores en la enzimtica de D. Alata

80,00 70,00 60,00 50,00 [ART] g/L 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 -10,00 0 5 10 15 20 25 30

hidrlisis

Amilasa

D. Alata 10,5% D. Alata 13,5%

AMG

D. Alata 15%

-20,00

HORAS

Fuente: autores del proyecto

En la grfica 2 se presenta el comportamiento de los 0Brix de las tres concentraciones (10,5%, 13,5% y 15%) usadas, en donde se refleja una notable diferencia en los valores mximos debido a la accin de la enzima en cada una de las concentraciones, aunque al iniciar el proceso no hay diferencias significativas en la cantidad de slidos solubles en el jugo glucosado aun as la de mayor Brix al iniciar el proceso la tiene la concentracin de 13.5%m/v que coincide con la de mayor concentracin de ART al iniciar.

61

Grfica 2. Comportamiento Brix en la hidrolisis enzimtica de D. Alata

12,00 11,00

10,00
9,00 8,00 7,00 BRIX 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 -1,00 0 5 10 15 HORAS 20 25 30 D. Alata 10,5%

Amilasa

AMG

D. Alata 13,5% D. Alata 15%

Fuente: autores del proyecto

En el anexo C se encuentran los datos correspondientes a la concentracin de azucares reductores y de grados Brix, se observa de acuerdo a estos datos que los grados 0Brix son directamente proporcional a los de azucares reductores, aunque el mximo valor lo presento la concentracin de 11,21% con 0Brix. 4.2 Comportamiento de Dioscorea Trfida en la hidrlisis enzimtica. La grfica 3 muestra el comportamiento que se dio durante el proceso de hidrlisis enzimtica del ame baboso a concentraciones de (10.5%, 13.5% y 15%). Se observa que menor concentracin de ART la posee la concentracin de 15%m/v se puede deber al aglutinamiento de las partculas de almidn y fue ms difcil evidenciar la presencia de ART al inicio de esta etapa. A pesar de que hubo un aumento progresivo en las 3 concentraciones, con la adicin de la enzima AMG en la segunda etapa se observan cambios representativos en la produccin de azucares, se observa un aumento en la conversin de almidn en ART debido a la actividad enzimtica, y en la concentracin de 10.5%m/v aumento significativamente con respecto a la concentracin de 15%m/v, aun as la concentracin de 13.5%m/v presento los valores ms altos de ART comparada con las otras 2 concentraciones.

62

Grfica 3. Comportamiento azucares reductores en la hidrlisis enzimtica de D. Trfida.

80,00 70,00 60,00 50,00 [ART] g/L 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0 -10,00 5 10 15 HORAS 20 25 30 D.trifida 10,5% D.trifida 13,5% D.trifida15%

Amilasa

AMG

Fuente: los autores del proyecto

En el anexo C se encuentran los datos tabulados de la produccin de azucares reductores y grados Brix, los comportamientos de los Brix son directamente proporcionales a la produccin de azucares. La grfica 4 ilustra la cantidad de slidos solubles generada para cada una de las concentraciones de ame dentro de las cuales la del 15%, oscilo entre 1,6 y 13. Esta presento el mejor resultado con 12,99, la concentracin de 13,5% entre 1,24 y 11 con 10,88 como valor final y la de 10,5% entre 0,92 y 9 con 8,64 como valor final.

63

Grfica 4. Comportamiento Brix en la hidrlisis enzimtica de D. Trfida

14,00 12,00 10,00

Amilasa

8,00
BRIX 6,00 4,00 D.trifida 10,5% D.trifida 13,5% D.trifida15%

AMG
2,00 0,00 0 -2,00 5 10 15 HORAS 20 25 30

Fuente: los autores del proyecto

4.3 Comportamiento de Dioscorea Rotundata en la hidrlisis enzimtica. La grfica 5 ilustra el comportamiento de azucares reductores de la variedad de ame Dioscorea Rotundata, en donde se observa que el comportamiento es similar al de las otras 2 variedades aumentando las concentraciones a medida que transcurre el tiempo y se desarrolla la hidrolisis enzimtica, en donde los valores para la concentracin de 10,5% el valor inicial es de2,82gr/L a 67,57g/L, para la concentracin de 13,5% el valor mnimo fue de 11,82g/L y el mximo fue de 71,32g/L, y los mejores rendimientos los presento la concentraciones de 15% con un valor inicial de 21,37g/L y un valor final de 78,82g/L que a diferencia de las otras variedades las mejores concentraciones de azucares reductores las presento la concentracin de 15%.

64

Grfica 5. Comportamiento azucares reductores en la hidrlisis enzimtica de D. Rotundata.

80,00 70,00 60,00 50,00 [ART] g/L 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 -10,00 -20,00 Fuente: autores del proyecto 0 5 10 15 20 25 30 D. Rotundata 10,5%

Amilasa

AMG

D. Rotundata 13,5% D. Rotundata 15%

HORAS

La grfica 6 muestra que el comportamiento de los 0Brix de las tres concentraciones (10,5%, 13,5% y 15%) usadas, para esta variedad tuvo un comportamiento similar al de las otras 2 variedades, aunque a diferencia tuvo el mayor valor final de los Brix de todo el proceso de hidrolisis enzimtico, donde la accin de la enzima fue ms efectiva, el valor fue de 15,70 Brix y lo present la concentracin de 15%

65

Grafica 6. Comportamiento Brix en la hidrlisis enzimtica de D. Rotundata

18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 BRIX D. Rotundata 10,5% 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0 5 10 15 Horas 20 25 30 D. Rotundata 13,5% D. Rotundata 15%

Amilasa

AMG

-2,00
Fuente: autores del proyecto

4.4

Lectura de pH

4.4.1 Lectura de pH para Dioscorea Alata. En la grfica 7. Se ilustra el comportamiento del pH en el proceso fermentativo de esta especie, mostrando disminucin a travs del tiempo, a partir de las 44 horas presento variaciones mnimas y los valores se tornaron constante. En el anexo B se reportan los datos correspondientes a la variacin de pH a travs de todo el proceso fermentativo para Dioscorea Alata.

66

Grfica 7. Comportamiento del pH durante la fermentacin de D. Alata

5,2 5 4,8 pH 4,6 4,4 4,2 4 0 10 20 30 HORAS Fuente: los autores del proyecto 40 50 60 D. Alata 10,5% D. Alata 13,5% D. Alata 15%

4.4.2 Lectura de pH para Dioscorea Trfida La grfica 8. Muestra un comportamiento similar del pH a la anterior especie, se ilustra disminucin a lo largo del tiempo, pero a partir de las 28 horas presento valores promedios a 4.27 para las concentraciones 10.5% y 15% hasta finalizar el proceso fermentativo. En el anexo C se reportan los datos correspondientes a la variacin de pH a travs de todo el proceso fermentativo para Dioscorea Trfida.

67

Grfica 8. Comportamiento del pH durante la fermentacin de D. Trfida

5,1 4,9

pH

4,7
D.trifida 10,5% 4,5 4,3 4,1 0 10 20 30 HORAS 40 50 60 D.trifida 13,5% D.trifida15%

Fuente: los autores del proyecto

4.4.3 Lectura de pH para Dioscorea Rotundata. En la grfica 9. Se nota claramente que hay una disminucin pronunciada del pH, y este no logra a estabilizarse, es evidente que en la concentracin de 13.5% de esta especie comparada con las otras 2 especies sufri un descenso de pH ms rpido en donde pudo verse afectado el microorganismo y reteniendo la produccin de Etanol.

68

Grfica 9. Comportamiento del pH durante la fermentacin de D. Rotundata

5,10
4,90 4,70 4,50 4,30 4,10 0 10 20 HORAS Fuente: los autores del proyecto 30 40 50 60

pH

D. Rotundata 10,5% D. Rotundata 13,5% D. Rotundata 15%

4.5 Lectura de Brix. 4.5.1 Lectura de Brix para Dioscorea Alata. En la grfica 10. Se ilustra el comportamiento de los Brix de las 3 concentraciones (10,5%, 13,5% y 15% m/v) de la especie D. Alata donde se nota una disminucin progresiva de los Brix a lo largo del proceso fermentativo, los valores finales en cada una de las concentraciones (10.5%, 13.5 y 15%) fueron 0.80, 1.12 y 1,13 respectivamente. Se destaca que la concentracin de 10.5% presento la mayor disminucin 0.80 indicando que la fermentacin fue completa.

69

Grfica 10. Comportamiento del descenso de Brix durante la fermentacin de D. Alata.

16,00

14,00
12,00 10,00 Brix 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 -2,00 0 10 20 30 HORAS 40 50 60 D. Alata 10,5% D. Alata 13,5%

D. Alata 15%

Fuente: los autores del proyecto

En el anexo B se presentan los datos correspondientes a los Brix en la etapa de fermentacin para la especie Dioscorea Alata. 4.5.2 Lectura de Brix para Dioscorea Trfida La concentracin 13,5% presento un comportamiento irregular donde a partir de las 30 horas los Brix no hubo variacin considerable, pero a las 44 horas descendi nuevamente para finalizar as el proceso con un valor de 2.2 Brix, el cual es el valor ms pequeo de esta especie, lo cual indica que su fermentacin fue completa.

70

Grfica 11. Comportamiento del descenso de Brix durante la fermentacin de D. Trfida

16,00 14,00 12,00 10,00

Brix

8,00 6,00 4,00

D.trifida 10,5% D.trifida 13,5% D.trifida15%

2,00 0,00
0 10 20 30 HORAS Fuente: los autores del proyecto 40 50 60

En el anexo C se presentan los datos correspondientes a los Brix en la etapa de fermentacin para la especie Dioscorea. 4.5.3 Lectura de Brix para Dioscorea Rotundata. La siguiente grafica 12. Muestra que el comportamiento de esta especie es similar al de las otras 2 especies, con disminucin a lo largo del proceso y refleja para las concentraciones de trabajo (10.5, 13.5 y 15% m/v) valores similares destacando que la concentracin de 10% presento siempre los valores ms bajos, esto es gracias a que el alcohol genera modificaciones en la organizacin y permeabilidad de las clulas presentes por concentracin, afectando su composicin lipdica y el funcionamiento de protenas de membrana involucradas en el transporte de azcares y aminocidos51.

51

AGUILERA, A.; BENITEZ, T. 1986.Role of mitochondria in ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol. Vol 142. pp 389392.

71

Grfica 12. Comportamiento del descenso de Brix durante la fermentacin de D. Rotundata.

20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 BRIX 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 -2,00 0 10 20 30 HORAS Fuente: los autores del proyecto 40 50 60 D. Rotundata 10,5% D. Rotundata 13,5%

D. Rotundata 15%

En el anexo D se presentan los datos correspondientes a los Brix en la etapa de fermentacin para la especie Dioscorea Rotundata. 4.6 Lectura de Azucares Reductores en la fermentacin

4.6.1 Lectura de Azucares Reductores para Dioscorea Alata. En la grfica 13 se ilustra como fue el consumo de azucares reductores para la especie D. Alata, el descenso de azucares en general fue muy similar, se observa que la concentracin 10,5% disminuyo rpidamente con un consumo notable de azcar. A las 28 horas presentaba una cada de 9,31 g/L y a las 50 horas un valor de 3,12 g/L siendo este ultimo el valor ms bajo y tambin se evidencia que la concentracin de 15% presento a las 50 horas menos consumo de azucares reductores por lo tanto se espera que tenga una menor produccin de etanol en comparacin a las dems variedades. Los valores finales de concentracin de azucares reductores fue de 3.12g/L, 6.52g/L y 3,75g/L para 10.5%, 13.5% y 15% respectivamente.

72

Grfica 13. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentacin de D. Alata
90,00 80,00 70,00 60,00 [ART] g/L 50,00 40,00 D. Alata 10,5% D. Alata 13,5% D. Alata 15%

30,00
20,00 10,00 0,00 -10,00 0 10 20 30 40 50 60

HORAS

Fuente: los autores del proyecto

Los datos correspondientes al consumo de azucares se encuentra en el anexo B, evidenciando la disminucin de esta y que los valores finales de las concentraciones 10.5% m/v y 15% m/v son los de menor valor, aunque quien presento mayor produccin de etanol es la concentracin de 13.5% 4.6.2 Lectura de azucares reductores para D. Trfida En la grfica 14, se ilustra el consumo de glucosa para la especie D., y se observa un mayor consumo en las concentraciones de 13% y 15% m/v un comportamiento similar, al finalizar el proceso de fermentacin, el valor final para estas dos concentraciones fue de 2,16g/L y 2,60g/L que indica eficiencia en la fermentacin.

73

Grfica 14. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentacin de D. Trfida
90,00 80,00 70,00 60,00 [ART] g/L 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0 10 20 30 HORAS 40 50 60 D.trifida 10,5% D.trifida 13,5% D.trifida15%

-10,00

Fuente: los Autores del proyecto

En el anexo C se encuentra los datos correspondientes al consumo de Azucares evidenciando la disminucin de la concentracin de azucares reductores a lo largo de la fermentacin y que los valores finales de las concentraciones 13.5% m/v y 15% m/v existe poca diferencia. 4.6.3 Lectura de azucares reductores para Dioscorea Rotundata. A continuacin en la grfica 15, se ilustra el comportamiento del consumo de glucosa para Dioscorea rotundata en donde se puede inferir que es similar al de las otras 2 especies, don la diferencia que al final el valor ms bajo lo obtuvo la concentracin de 10,5% con 2,22 g/L. Los valores finales de concentracin de glucosa fueron 5,89g/L y 4,34g/L para las concentraciones restantes 13,5% y 15% m/v respectivamente.

74

Grfica 15. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentacin de D. Rotundata
100,00

80,00

60,00 [ART] g/L

D. Rotundata 10,5%
40,00 D. Rotundata 13,5% D. Rotundata 15%

20,00

0,00 0 -20,00 10 20 30 HORAS 40 50 60

Fuente: los autores del proyecto

En el anexo D se presenta los datos correspondientes a la concentracin de glucosa en el tiempo, para el proceso de fermentacin de la especie Dioscorea Rotundata. 4.7 Conteo de microorganismos Los datos para cada una de las variedades se encuentran en los anexos B. C, y D del documento. 4.7.1 Conteos de microorganismos para Dioscorea Alata. La grafica muestra el comportamiento de la levadura durante el proceso de fermentacin para el D. Alata en sus tres concentraciones (10.5%, 13.5% y 15%), durante el inicio del proceso se observa que el crecimiento del microorganismo es lento y pequeo, esto es debido a que la levadura est reconociendo y se est adaptando al medio de donde debe tomar los nutrientes necesarios para desarrollarsu proceso productivo, esto corresponde del tiempo 0 al 10, aqu la clula reconoci al alimento enseguida y empez a crecer por lo tanto no hubo fase de adaptacin. como se puede observar en la grfica 16.

75

Grfica 16. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentacin de D. Alata

1,81E+07 1,61E+07 1,41E+07 1,21E+07

UFC

1,01E+07 D. Alata 10,5% 8,10E+06 6,10E+06 4,10E+06 2,10E+06 D. Alata 13,5% D. Alata 15%

1,00E+05
0 10 20 30 HORAS 40 50 60

Fuente: los autores del proyecto

Durante este proceso tambin podemos observar una segunda fase en donde se origina un crecimiento exponencial para las tres concentraciones, en donde se puede apreciar que la concentracin de D. Alata 13.5% es la primera que comienza con el crecimiento con 3,16E+6 UFC/ml, para esta concentracin el crecimiento total va desde 1,00E+06 hasta 1.32E+07 UFC/ml. A las 44 horas se ve un descenso en la concentracin de clulas que puede ser el resultado de la formacin de metabolitos secundarios durante el proceso. Tambin se puede destacar que el mayor crecimiento se produce en la concentracin de 15% con un valor de 1.4E+07 UFC/ml. Para esta concentracin el crecimiento va desde 1.40E+06/ml hasta 1,40E+07/ml. Esta variedad de ame fue la que obtuvo la menor formacin de microorganismo durante el proceso. 4.7.2 conteos de microorganismos para Dioscorea Trfida. En la primera etapa la adaptacin del microorganismo fue similar al de la del D. Alata, para esta especie la levadura demoro un poco ms tiempo en adaptarse al medio, sin embargo la fase lag para esta especie es pequea y la levadura toma accin y en la segunda fase se produce un incremento para las concentraciones

76

de 10.5 y 15 % en donde el crecimiento fue constante, para la concentracin de 13.5% en las primeras 10 horas tuvo una etapa de adaptacin normal, pero a las 20 horas se produjo un descenso en la concentracin de las levaduras hasta 1.19E+06 UFC/ml esto se puede deber a que en el momento de tomar las muestras no hubo un rgido control y haya habido un aumento en la cantidad de oxigeno disminuyendo la actividad de la levadura e impidiendo su crecimiento normal, aunque posteriormente se produjo un incremento en la produccin de levadura para esta concentracin y finalmente termino con 1.77E+07 UFC/ml como se puede ver en la grfica 17. . Grfica 17. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentacin de D. Trfida
2,40E+07
2,10E+07 1,80E+07 1,50E+07 UFC 1,20E+07 9,00E+06 6,00E+06 3,00E+06 0,00E+00 -3,00E+06 0 10 20 30 HORAS 40 50 60 D.trifida 10,5% D.trifida 13,5% D.trifida15%

Fuente: los autores del proyecto

El crecimiento total de la concentracin 10.5% fue desde 1,18E+06/ml hasta 1,68E+07 UFC/ml, para la concentracin de 13.5% fue desde 2,31E+06/ml hasta 1,77E+07 UFC/ml y finalmente la concentracin de 15% desde 4,50E+06/ml hasta 2,02E+07 UFC/ml, siendo este ltimo el de mayor crecimiento para esta especie. 4.7.3 conteos de microorganismos para Dioscorea Rotundata. El crecimiento para esta especie en la primera fase fue pequeo pero acelerado ya que la levadura tuvo una muy buena adaptacin al medio, prcticamente no hubo fase lag con esta especie. Esto origino un incremento constante de la produccin de biomasa este medio en general para las tres concentraciones como se ve en la grfica 18.

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Grfica 18. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentacin de D. Rotundata

2,83E+07 2,43E+07 2,03E+07 1,63E+07 1,23E+07 8,30E+06 4,30E+06 3,00E+05 0 Fuente: los autores del proyecto 20 HORAS 40 60 D. Rotundata 10,5% D. Rotundata 13,5% D. Rotundata 15%

Durante la fase logartmica se logr un buen rendimiento en la produccin de biomasa donde se obtuvieron los siguientes crecimientos, para la concentracin de 10,5% 1,30E+06 UFC/ml hasta 1,76E+07 UFC/ml, para la de 13,5% de 5,35E+06 UFC/ml hasta 1,95E+07 UFC/ml y para la de 15% 8,00E+06 hasta 2,46E+07UFC/ml. Esta especie fue la que genero mayor produccin de Biomasa durante el proceso de fermentacin con la concentracin 15% con un valor de 2,46E+07 UFC/ml. 4.8 4.8.1 Produccin de etanol Produccin de etanol de Dioscorea Alata.

La produccin de etanol durante el tiempo de Fermentacin para las concentraciones de harina de ame del 10.5%, 13.5% y 15%M/v de la variedad D. Alata se representan en la grfica, observndose una Concentracin final de etanol de 3,22% v/v; 3,64% v/v y 3,27% v/v respectivamente, observndose la produccin de alcohol a partir de las 4 horas hasta alcanzar un valor mximo a las 50 horas para las tres concentraciones de D. Alata donde se observa que las tres tienen valores muy similares. Sin embargo la que mayor valor obtuvo fue la D. Alata 13,5% con 3,64% v/v.

UFC

78

Grfica 19. Comportamiento de la produccin de alcohol durante la fermentacin de D. Alata

5,00

4,00

3,00 %V/V

2,00

D. Alata 10,5% D. Alata 13,5% D. Alata 15%

1,00

0,00

0
-1,00

10

20

30
HORAS

40

50

60

Fuente: los autores del proyecto

La grafica 19.Muestra el incremento de la produccin de etanol durante el proceso de fermentacin con Saccharomyces cerevisiae, en donde esta especie obtuvo los menores porcentajes de alcohol de las tres variedades presentadas para el estudio. La grafica 20. Ilustra la diferencia de medias para la variedad D. Alata, el anlisis de varianza realizado para esta especie dio como resultado un valor de p> a 0,05 lo que indica que no existen diferencias significativas entre las medias de alcohol de un nivel de concentraciones a otro.

79

Grafica 20. Grfico de medias, variedad Dioscorea Alata

Fuente: los autores

4.8.2 Produccin de Etanol de Dioscorea Trfida. La produccin de alcohol para esta especie se produjo entre el tiempo 4 y 50 de fermentacin en donde la concentracin de 15% tuvo el menor valor con 3,4% v/v Lo cual sedebe a un menor consumo de los Azucares reductores por parte de Saccharomyces cerevisiae. Las concentraciones 13,5% y 10,5%m/v dieron los mayores resultados para esta variedad con 4,43% v/v y 3,53% v/v, superando con la de 13,5% a las concentraciones obtenidas por D. Alata. En La grafica 21 muestra el comportamiento del D. Trfida durante la produccin de alcohol y no se observa mucha variacin en la produccin de etanol, los mejores resultados se present en la concentracin de 13,5% para esta especie.

80

Grfica 21. Comportamiento de la produccin de alcohol durante la fermentacin de D. Trfida

5,00

4,00

3,00 %V/V D.trifida 10,5% 2,00 D.trifida 13,5%

D.trifida15%
1,00

0,00 0 10 20 30 HORAS Fuente: los autores 40 50 60

La grafica 22. Ilustra la diferencia de medias para la variedad D. Trfida, el anlisis de varianza realizado para esta especie dio como resultado un valor de p> a 0,05 lo que indica que no existen diferencias significativas entre las medias de alcohol de un nivel de concentraciones a otro.

81

Grfica 22. Grfico de medias, de la variedad Dioscorea Trfida

Fuente: los autores

4.8.3

Produccin de etanol de Dioscorea Rotundata.

En la grfica 23, se observa como aumenta la concentracin de alcohol a partir de las 4 horas hasta alcanzar un punto mximo a las 50 horas para las tres concentraciones de D. Rotundata donde el menor valor lo obtiene 10.5% m/v con un 3,62% v/v, este valor es mayor al valor obtenido por la concentracin 13.5%de los datos obtenidos por la variedad D. Alata. Las concentraciones 15% m/v y 13.5%m/v presentaron los mejores resultados, esto es de 4,55% v/v y 3,7% v/v respectivamente, con lo que se puede asumir que la concentracin ms rentable para el proceso de obtencin de alcohol es la de 15%m/v de D. Rotundata. En la grafica

82

Grfica 23. Comportamiento de la produccin de alcohol durante la fermentacin de D. Rotundata

6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 -1,00 Fuente: los autores del proyecto 10 20 30 HORAS 40 50 60 D. Rotundata 10,5% D. Rotundata 13,5% D. Rotundata 15%

La grafica 24 ilustra la diferencia de medias para la variedad D. Rotundata, el anlisis de varianza realizado para esta especie dio como resultado un valor de p> a 0,05 lo que indica que no existen diferencias significativas entre las medias de alcohol de un nivel de concentraciones a otro. Grfica 24. Grfico de medias, para la variedad Dioscorea Rotundata

Fuente: los autores

%V/V

83

4.9

Rendimientos del proceso

Para calcular el rendimiento del proceso se procede de la siguiente manera de acuerdo a la ecuacin entonces ( ) Yp/s: Rendimiento producto- sustrato P: concentracin de etanol (g/L) S: concentracin de glucosa (g/L) Hay que tener en cuenta que al iniciar el proceso de fermentacin en P 0 no hay produccin de etanol. Esta ecuacin se aplic para cada una de las especies y para las 3 concentraciones de trabajo. 4.9.1 Rendimiento para Dioscorea Alata

Concentracin 10.5% m/v

( )

( (

Remplazando los valores ) )

Concentracin 13,5% m/v ( ( ) )

Concentracin 15% m/v ( ) ( ) 4.9.2 Rendimiento para Dioscorea Trfida

Concentracin 10.5% m/v

( )

( (

Remplazando los valores ) )

Concentracin 13,5% m/v ( ) ( )

84

Concentracin 15% m/v ( ( 4.9.3 ) )

Rendimientos para Dioscorea Trfida

Concentracin 10.5% m/v Remplazando los valores ( ) ( ) ( ) Concentracin 13,5% m/v ( ) ( ) Concentracin 15% m/v ( ) ( ) De acuerdo al clculo de los rendimientos de cada una de las 3 especies a las diferentes concentraciones de trabajo (10.5%, 13.5% y 15%) m/v la concentracin que presento mayor rendimiento fue la concentracin de 15% con 49.5% que representa un 96.8% del rendimiento terico, lo cual supera el rendimiento alcanzado a nivel industrial que vara entre 87 y 95%, siendo el rendimiento terico o estequiomtrico 51.1%52 4.10 ANLISIS ESTADSTICO

Para el anlisis estadstico de esta investigacin se utilizaron como herramientas tecnolgicas los software Statgraphics 5.1 y Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), el primero para realizar el anlisis de varianza (ANOVA)en donde se trabaj con un nivel de significancia o error estadstico del 5% (0,05) que permiti determinar si los datos arrojados en la investigacin existen o no variaciones significativas de las variables que interesan a los investigadores, se realizaron 3 anlisis de varianza, es decir uno por cada especie.

VZQUEZ, H.J. y DACOSTA, O. Fermentacin alcohlica: Una opcin para la produccin de energa renovable a partir de desechos agrcolas. Ingeniera, investigacin y tecnologa. v.8 n.4 Mxico oct./dic. 2007
52

85

El anlisis de varianza en cada una de las especies determino que no hay estadsticamente diferencias significativas entre las medias de etanol de una concentracin a otra (10.5%, 13.5% y 15%), tambin se determino con el anlisis de varianza que la variedad que ofrece los mejores resultados en cuanto a la produccin de etanol es la Dioscorea Trfida y con las concentraciones de 10.5 y 13.5 %m/v, ya que con la concentracin de 15%m/v se desaprovecha mucha materia prima y no hay diferencias significativa en los resultados que con las otras dos concentraciones, en el anexo G se encuentran los resultados del ANOVA de las 3 variedades. El segundo software se utiliz para contrastar las hiptesis propuestas en el captulo 3 en donde la Hiptesis nula afirmaba que la concentracin de etanol es igual a 10% y la hiptesis alternativa es diferente al 10%; para comprobar las hiptesis fue necesario realizar inicialmente la prueba no paramtricas Kolmogorov-Smirnov para una muestra que se busca comprobar si los datos proviene de una distribucin normal y as aplicar la prueba T de Student que es la prueba que permite el contraste de las Hiptesis, la primera prueba dio positivo, es decir que los datos si provienen de una distribucin normal y si se puede aplicar la prueba T de Student. La prueba se realiz a las 3 especies y a cada una de las concentraciones, para un total de 9 pruebas y se acept la hiptesis alternativa en las 9 pruebas, es decir, que la concentracin es diferente de 10%. En el anexo H se reportan los resultados de las pruebas no paramtricas Kolmogorov-Smirnov y de las pruebas T de Student.

86

CONCLUSIONES

Se obtuvo etanol a partir de tres variedades de ame (Dioscorea Alata, Dioscorea Trfida y Dioscorea Rotundata) con valores mximos de concentracin de 4.55%v/v a la concentracin de 15%m/v, 4.43%v/v a la concentracin de 13.5%m/v y 3.66%v/v a la concentracin de 13.5%m/v, en las variedades Dioscorea Rotundata, Dioscorea Trfida y Dioscorea Alata respectivamente. Durante la etapa de hidrolisis enzimtica (licuefaccin y sacarificacin) los azucares reductores y Brix aumentan significativamente, alcanzndose mximos valores al final del proceso de 78.82g/L en concentracin de 15%m/v en la variedad Dioscorea Rotundata, 73.84g/L en la concentracin de 13.5% en la variedad Dioscorea Trfida; mientras que para la variedad Dioscorea Alata e obtuvieron valores de 61.68g/L a la concentracin de 13.5%m/v. Al calcular los parmetros cinticos, los valores mnimos obtenidos de azucares reductores al final de la fermentacin fueron de 4.34g/L para la concentracin de 15% en la variedad Dioscorea Rotundata, 9.18g/L en la concentracin de 13.5% m/v y para la variedad Dioscorea Trfida valores mnimos 3.32g/L y el crecimiento de microorganismos presento valores mximos al final de la etapa exponencial en la variedad Dioscorea Rotundata de 1.90x107UFC/ml en la concentracin de 15%m/v, en la variedad Dioscorea Trfida, fue de 1.69x107UFC/ml en la concentracin de 15%y en la variedad Dioscorea Alata, el valor fue de 1.25x107UFC/ml. Es posible obtener bioetanol con cualquier de las especies de ame (Dioscorea Rotundata, Dioscorea Alata y Dioscorea Trfida) utilizadas en esta investigacin, cualquiera de las concentraciones utilizadas.

87

RECOMENDACIONES

Para este tipo de investigacin es recomendable el empleo de la enzima Pectinex ultra, antes de usar la enzima alfa amilasa, para complementar y que haya una ataque oportuno sobre el almidn en la hidrolisis y as obtener mayores resultados y altas concentracin en cuanto a la conversin de azucares reductores que garantizan mayor produccin de alcohol. Se recomienda reducir el tiempo de residencia de la enzima alfa amilasa debido a que esta trabaja entre 88 a 95C el mantener esta temperatura por mucho tiempo implica altos costos de combustible. Para la cuantificacin de etanol es importante emplear el mtodo cromatografa de gases debido a que es un mtodo ms exacto y representa mayor confiabilidad en los resultados. Evaluar los rendimientos durante el proceso de obtencin de alcohol usando otro tipo de microorganismos como las bacterias Zymomonas mobilisque transforman la glucosa en etanol con un rendimiento del 5 al 10 % mayor que la mayora de las levaduras. En cuanto a la celulosa liberada (cascara del ame) est tambin se puede utilizar para la produccin de etanol o de compostaje y as aprovechar los residuos de cualquier proceso en donde se trabaje con ame, este estudio se recomienda para futuros investigadores en donde le daran un valor agregado a este promisorio tubrculo. Se recomienda trabajar con la especie Dioscorea Trfida debido a que presento un comportamiento estable durante toda la investigacin, adems hay que tener en cuenta que este proyecto es un estudio preliminar y se desea que quede como lnea base para futuras investigaciones.

88

BIBLIOGRAFA

ACEVEDO, Evelin. JIMENEZ, Sonia y MARBELLO, Linda Luz .Evaluacin comparativa de la actividad fermentativa de Clulas libres e inmovilizadas de Saccharomyces cerevisiae Sobre cscaras de naranja y gluten. Para la obtencin de Grado el Ttulo de ingeniero Qumico en la Universidad de San Buenaventura. Cartagena. 2008 ADELUSI A, LAWANSON AO. Disease induced changes in carotenoid content of edible yam (Dioscorea spp) infected by Botryodiplodia the obromae and Aspergillus Niger. Mycopathologia 98:49-58.1987 AGUILERA, A.; BENITEZ, T.Role of mitochondria in ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiology. 1986. Vol. 142. pp 389392. ALVIS, Armando y VELEZ, Carlos. Informacin Tecnolgica-Vol. 19 N5-2008, pg.: 11-18 Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S071807642008000500003&script=sci_arttext ARTIME, R. Aplicaciones de las enzimas. Universidad de Salamanca. 2005 ASTURIZAGA AVILEZ, Yajaira y BOCANEGRA AMAYA, Carmen. Evaluacin de los rendimientos en el proceso de obtencin de alcohol a partir de harina de ame (Dioscorea Bulbfera, Trfida) por va enzimtica. Sincelejo. Universidad de Sucre. Facultad de Educacin Y Ciencias. Programa de Biologa, 2008. 108 p. BROCK y MADIGAN. Michael. Biologa de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall. 10 Edicin.2004 CARRERA, J. Mdulos de Biotecnologa. Enzimas industriales, Universidad del Cauca, 1 edicin. CARRERA, Jorge y MERA, Ingrid. Obtencin de glucosa a partir de almidn de yuca Manihot esculenta. Universidad del Cauca. Facultad de Ciencias Agropecuarias Vol. 3 No.1 Marzo 2005 CIEMAT - Departamento de Energas Renovables DE RAFOLS, W. Aprovechamiento Industrial de los productos agrcolas. Barcelona. 1964 Disponible en: www.abengoabioenergy.com

89

Disponible: http://www.secretariasenado.gov.co/senado/basedoc/ley/2001/ley_0693_2001.html Disponible en: Asociacin colombiana de productores y proveedores de caa de azcar- procaa.com Disponible en: http://www.eis.uva.es/~macromol/curso08-09/pls/quees.htm Estudio realizado por Global BioenergyPartnership (Asociacin Global de Bioenerga) [GBEP (2007)] Evaluacin De Propiedades Tecnofuncionales De Variedades De ame De La Costa Atlntica. Disponible en: http://www.unicordoba.edu.co/pregrado/copia%20alimentos/proyectos/pba.pdf FERMEMA, O. Qumica de los Alimentos, 2da ed. Editorial ACRIBIA, Zaragoza, Espaa 2000. Pg. 228 FERNADEZ, Pita y PRTEGAS Daz, S. Investigacin cuantitativa y cualitativa. Unidad de epidemiologia Clnica y Bioestadstica. La Corua (Espaa). 2002. FRAZIER, W. y WESTHOFF D. Microbiologa de los alimentos. Zaragoza, Espaa. Acribia S.A 1993, p. 431-438 GARCA CORTES, Vera. Introduccin a la microbiologa. Editorial EUNED. Edicin 2. Pg. 112-114. 2004 GAMERO, Galo. Consideraciones sobre fisiologa de la planta de ame, Corpoica, 2004 GONZALES, Jorge y MOLINA, Manuel. Estudio de los factores que afectan la hidrolisis enzimtica y el proceso fermentativo para la produccin de alcohol a partir de la papa. Revista de ingeniera vol. 16(1), Enero/Julio 2006. HERNNDEZ, Alicia. Microbiologa industrial. Editorial EUNED. Edicin 1 pg. 3739. 2003. HERNANDEZ SAMPIERI, Roberto Metodologa de la investigacin Editorial MC. Graw-Hill Mxico 2006 KURIKI, T; IMANAKAT, T. The concept of the a-amylase family: structure Similarity and common catalytic mechanism. J. Biosci, Bioeng.1999. p.p 87, 557 565. LEN, Jos Guillermo. Los Biocombustibles. Conferencia ARPEL. Punta del Este. Uruguay. 2009. pg.6.

90

LOPEZ, J. Semilla vegetativa de yuca. En: Ospina, B y Ceballos, H. La yuca en el tercer milenio. Sistemas modernos de produccin, procesamiento, utilizacin y comercializacin, 2002. pp. 49-75. CIAT. Cali, Colombia. 586 pp. MARCILLA GOMIS, A. Introduccin a las operaciones de separacin calculo por etapas. MONTES, M y MAGANA, I. Enzimas con Aplicacin Industrial. Disponible en: http://www.cinvestav.mx/publicaciones/avaype/sepoct02/HORCASITAS.PDF. 2004 MORRISON, Robert. y BOYD, Robert. Qumica Orgnica. 5taEd. AddisonWesley Iberoamericana. USA. 1996. NIETO, GALARZA. Evaluacin de las condiciones de la fermentacin alcohlica utilizando Saccharomyces cerevisiae y jugo de caa de azcar como sustrato para obtener etanol. Para la obtencin de Grado el Ttulo de ingeniero en biotecnologa. Extrado del sitio web de la escuela politcnica del ejrcito ecuatoriano.http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/990/1/T-ESPE 026782.pdf. 2009. Proyecto Educativo Bonaventuriano. 2010. Pg. 49. TUCKER, G y WOODS, L. Eds. Enzymes in Food Processing. Blackie and Son Ltd. London.1991. TREADWAY, R. H. (1984). Manufacture of potato starch. In Whistler & Paschal (Eds.), Starch: Chemistry and Technology (pp 87-101). New York: Academic Press Inc. SATYANARAYANA, T; RAO, J; EZHILVAN NAN, M. 2005.a- Amylases. In: Enzyme Technology, A. Pandey, C. Webb, CR. Soccol, C. La roche (Eds.), Asiatech Publishers Inc; New Delhi, India pp 189 220. SMITH, John E. Biotecnologa. 2006. Editorial Acribia. Edicin 4. Pg. 53-54 VZQUEZ, H.J. y DACOSTA, O. Fermentacin alcohlica: Una opcin para la produccin de energa renovable a partir de desechos agrcolas. Ingeniera, investigacin y tecnologa. v.8 n.4 Mxico oct./dic. 2007 WALKER J.M. E.B. Gingold. Biotecnologa Molecular, , Edicin, Acribia, S.A. Pg. 5-6

91

ANEXOS

92

ANEXO A. SUPERFICIE COSECHADA, PRODUCCIN Y RENDIMIENTO DEL CULTIVO DE AME EN COLOMBIA AOS 1997 2008

93

ANEXO B. FICHAS TCNICAS DE LAS ENZIMAS AMILASA Y AMILOGLUCOSIDASA Amilasa cerveza, industria de aminocidos, antibiticos Aplicaciones industria textil y adhesivos Apariencia: liquido no viscoso de grado alimenticio Caractersticas Color: marrn oscuro Densidad : 1,20 -1,25 g/ml Actividad: 120 KNU/g (1 KNU: cantidad de enzima que rompe 5,26 g de almidn Por hora, avalado por el mtodo estndar de Novozymes A/S). PH: 6,5 Parmetros ptimos Temperatura 90-105 C Calcio 50-70 ppm Amiloglucosidasa Industria alimenticia: produccin de glucosa y fructosa Aplicaciones industria del papel: proteccin contra daos mecnicos Industria de la Cerveza: produccin de cerveza clara Apariencia: liquido no viscoso de grado alimenticio Caractersticas Color: marrn Densidad : 1,20 g/ml Actividad: 1 unidad Novo Amiloglucosidasa (AGU): cantidad de la enzima que Propiedades Parmetros ptimos Hidroliza 1mol de maltosa/min a condiciones estndar. PH: 4.5 Temperatura 55 - 60 C

fermentaciones,

vitaminas,

Propiedades

94

ANEXO C. RESULTADOS PARA LA ESPECIE D. ALATA. A continuacin se registraron los resultados obtenidos durante la etapa de hidrolisis enzimtica y de la fermentacin para la especie Dioscrea Alata a. Azucares reductores en la hidrolisis enzimtica Amilasa Concentraciones Tiempo Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% (H) 0 4,32 16,82 1,57 25 4 7,47 34,32 12,52 26 10 15,32 36,62 32,52 27 18 22,82 42,32 41,72 28 24 33,52 51,52 45,32

AMG Concentraciones 10,5% 13,5% 15% 35,02 53,82 47,32 42,32 61,32 54,32 48,27 66,82 58,32 64,12 69,68 61,32

b. Comportamiento De Grados Brix Durante La Hidrlisis Enzimtica. Amilasa AMG Concentraciones Concentraciones Tiempo Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% (H) 10,5% 13,5% 15% 0 0,7 0,9 1,0 25 5,4 7,6 8,9 4 1,3 1,4 2,2 26 6,7 8,3 10,3 10 2,6 3,7 5,0 27 7,0 8,9 10,9 18 4,1 6,2 7,5 28 7,1 9,2 11,2 24 4,9 7,1 8,2

c. Comportamiento De pH Durante El Proceso De Fermentacin De D. Alata. D. Alata Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 4,97 5,06 5,06 4 4,84 4,90 4,96 8 4,70 4,79 4,84 19 4,55 4,64 4,74 23 4,44 4,49 4,56 28 4,31 4,36 4,41 44 4,21 4,25 4,29 50 4,13 4,11 4,16

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d. Descenso de Azucares Reductores durante el proceso de Fermentacin de D. Alata D. Alata Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 65,32 70,32 60,32 4 50,81 61,74 50,30 8 42,22 48,34 45,08 19 29,17 36,27 35,27 23 21,12 29,73 21,28 28 9,31 18,64 12,98 44 6,22 8,28 7,52 50 3,12 6,52 3,75

e. Descenso de Grados Brix durante el proceso de Fermentacin de D. Alata. D. Alata Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 7,3 9,5 12,3 4 6,8 8,8 11,7 8 6,0 8,3 11,0 19 4,6 7,3 9,1 23 4,2 5,5 8,5 28 2,9 4,1 5,6 44 1,4 2,1 4,0 50 0,7 0,8 1,1 f. Crecimiento de Biomasa durante el proceso de Fermentacin de D. Alata. D. Alata Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 8,00E+05 1,00E+06 1,40E+06 4 1,00E+06 2,00E+06 1,56E+06 8 1,10E+06 3,16E+06 1,50E+06 19 4,50E+06 6,90E+06 9,54E+06 23 6,80E+06 1,04E+07 1,25E+07 28 8,80E+06 9,69E+06 1,33E+07 44 1,15E+07 1,31E+07 1,36E+07 50 7,00E+06 1,32E+07 1,40E+07

96

g. Produccin de Alcohol durante el proceso de Fermentacin de D. Alata. D. Alata Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 0,0 0,0 0,0 4 1,5 2,1 2,3 8 1,8 2,4 2,5 19 2,1 2,6 2,8 23 2,6 3,0 3,0 28 3,0 3,1 3,4 44 3,1 3,4 3,5 50 3,2 3,5 3,7

97

ANEXO D. RESULTADOS PARA LA ESPECIE D. TRFIDA. A continuacin se registraron los resultados obtenidos durante la etapa de hidrolisis enzimtica y de la fermentacin para la especie Dioscrea Trfida a. Resultados de la Hidrlisis Enzimtica Para la D. Trfida Amilasa AMG Concentraciones Concentraciones Tiempo Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% (H) 10,5% 13,5% 15% 0 5,85 14,32 2,5 25 48,82 53,32 48,62 4 8,52 38,32 20,9 26 55,32 58,32 52,82 10 19,82 42,32 35,8 27 61,32 66,32 58,32 18 25,62 47,32 41,4 28 67,42 73,84 67,18 24 44,42 51,32 45,8

b. Comportamiento de Grados Brix durante la Hidrlisis enzimtica de D. Trfida. Amilasa AMG Concentraciones Concentraciones Tiempo Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% (H) 10,5% 13,5% 15% 0 0,9 1,2 1,6 25 6,2 8,5 10,6 4 1,5 1,9 2,8 26 7,0 9,2 11,4 10 3,6 4,3 6,1 27 7,9 9,9 12,0 18 4,8 7,1 8,3 28 8,6 10,9 13,0 24 5,5 7,8 9,2 c. Comportamiento de pH durante el proceso de Fermentacin de D. Trfida. D. Trfida Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 4,66 5,02 4,87 4 4,58 4,93 4,75 8 4,46 4,88 4,67 19 4,33 4,75 4,55 23 4,29 4,61 4,43 28 4,25 4,53 4,27 44 4,21 4,41 4,23 50 4,18 4,24 4,21

98

d. Descenso de Azucares Reductores durante el proceso de Fermentacin de D. Trfida. D. Trfida Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 68,82 74,52 68,94 4 62,05 63,81 57,75 8 48,68 52,55 46,83 19 43,51 44,66 41,15 23 34,19 36,12 34,57 28 26,31 23,60 20,31 44 14,83 12,08 11,27 50 9,75 2,16 2,60 e. Descenso de Grados Brix Trfida. durante el proceso de Fermentacin de D. D. Trfida Concentraciones 10,5% 13,5% 8,8 11,1 8,4 10,7 7,7 10,0 5,9 8,1 4,9 5,5 4,3 4,5 3,1 4,0 2,4 2,2

Tiempo (H) 0 4 8 19 23 28 44 50

15% 13,1 12,4 12,2 10,2 8,7 6,2 3,2 2,6

99

f. Crecimiento de Biomasa durante el proceso de Fermentacin D. Trfida. D. Trfida Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 1,18E+06 2,31E+06 4,50E+06 4 1,51E+06 2,59E+06 4,57E+06 8 1,61E+06 2,79E+06 6,61E+06 19 7,60E+06 1,19E+06 1,30E+07 23 1,09E+07 1,45E+07 1,69E+07 28 1,45E+07 1,65E+07 1,86E+07 44 1,54E+07 1,76E+07 1,91E+07 50 1,68E+07 1,77E+07 2,02E+07 g. Produccin de Alcohol durante el proceso de Fermentacin de D. Trfida. D. Trfida Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 0,0 0,0 0,0 4 1,9 2,4 2,7 8 2,2 2,7 3,1 19 2,7 2,7 3,5 23 3,0 3,3 3,7 28 3,2 3,5 3,9 44 3,3 3,7 4,0 50 3,5 3,9 4,2

100

ANEXO E. RESULTADOS PARA LA ESPECIE D. ROTUNDATA. A continuacin se registraron los resultados obtenidos durante la etapa de hidrolisis enzimtica y de la fermentacin para la especie Dioscorea Rotundata a. Resultados de la Hidrlisis Enzimtica Para la D. Rotundata. Amilasa AMG Concentraciones Concentraciones Tiempo Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% (H) 10,5% 13,5% 15% 0 2,82 11,82 21,37 25 54,22 58,17 63,32 4 7,02 34,62 45,82 26 63,32 67,82 70,32 10 18 24 14,07 31,72 50,92 40,32 48,32 53,62 53,82 56,32 59,82 27 28 66,77 67,57 69,22 71,32 71,07 78,82

b. Comportamiento de Grados Brix durante la Hidrlisis enzimtica de D. Rotundata. Amilasa Concentraciones 10,5% 13,5% 15% 1,5 1,8 2,4 2,9 4,2 7,8 6,2 8,6 10,6 8,7 10,0 11,3 9,4 11,1 12,0 AMG Concentraciones 10,5% 13,5% 10,7 12,6 11,5 13,4 12,0 14,1 12,3 14,7

Tiempo (H) 0 4 10 18 24

Tiempo (H) 25 26 27 28

15% 13,9 14,4 15,1 15,7

101

c. Comportamiento de pH durante el proceso de Fermentacin de D. Rotundata. D. Rotundata Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 4,97 4,7 5,04 4 4,81 4,63 4,98 8 4,757 4,55 4,84 19 4,607 4,47 4,72 23 4,521 4,41 4,66 28 4,421 4,36 4,58 44 4,411 4,29 4,46 50 4,281 4,21 4,23 d. Descenso de Azucares Reductores durante el proceso de Fermentacin de D. Rotundata. D. Rotundata Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 67,32 70,27 79,87 4 50,92 60,05 65,32 8 47,22 51,18 51,86 19 46,12 44,82 41,81 23 43,72 30,81 33,15 28 31,07 23,76 26,76 44 25,32 13,04 16,30 50 2,22 5,89 4,34

102

e. Descenso de Grados Brix Rotundata.

durante el proceso de Fermentacin de D. D. Rotundata Concentraciones

Tiempo (H) 0 4 8 19 23 28 44 50

10,5% 12,5 11,9 11,4 9,7 8,3 7,6 5,2 1,2

13,5% 15,2 14,9 14,2 12,2 9,8 8,5 7,0 2,4

15% 16,0 15,4 14,7 12,8 12,2 9,3 7,7 3,3

f. Crecimiento de Biomasa durante el proceso de Fermentacin D. Rotundata. D. Rotundata Concentraciones Tiempo (H) 10,5% 13,5% 15% 0 1,30E+06 5,35E+06 8,00E+06 4 1,49E+06 6,37E+06 9,04E+06 8 4,10E+06 7,04E+06 1,06E+07 19 1,10E+07 1,30E+07 1,58E+07 23 1,41E+07 1,60E+07 1,90E+07 28 1,56E+07 1,80E+07 2,00E+07 44 1,58E+07 1,88E+07 2,30E+07 50 1,76E+07 1,95E+07 2,46E+07

103

g. Produccin de Alcohol durante el proceso de Fermentacin de D. Rotundata. D. Rotundata Concentraciones Tiempo (H) 0 4 8 19 23 28 44 50 10,5% 0,0 1,7 2,0 2,5 2,7 3,2 3,4 3,6 13,5% 0,0 2,0 2,3 2,6 3,0 3,4 3,9 4,2 15% 0,0 2,4 3,0 3,1 3,4 4,0 4,4 4,9

104

ANEXO F. AZUCARES REDUCTORES (METODO DEL DNS) Referencia: MILLER, G.L. 1959. Use of dinitrosalicylieachlreagattforDetermination of reducing sugar.AnalyeChen, 31:426429.(Fer. Labo MT205) Fundamento: El cido 3.5, dinitrosalicilico en presencia del calor se reduce un color amarillo caf. La lectura se realiza a 575 nm. Interferencias,. Ventajas y desventajas: Altas concentraciones de protenas interfieren en la determinacin de los Azcares reductores. Otra desventaja es el costo de los reactivos Principalmente en del cido 3,5 dinitrosalicilico y fenol. Una de las ventajas de este mtodo es que el calor final desarrollado es estable hasta 24 horas. Adems de que es un mtodo sencillo y rpido.
Materiales y equipo Tubos de ensayo con tapa Pipeta de 1ml. Pipeta de 5ml. Pipeta o distribuidor automtico Matraz aforado de 100ml o 1000ml Frasco color mbar Macerador de tejidos Potter Espectrofotmetro para leer a 575 nm Balanza analtica Agitador de tubos (vrtex) Centrifuga Bao de Mara Bao de Hielo Reactivos
Reactivos 1 g cido 3.5 dinitrosaliclico 1 g Hidrxido de sodio (NaOH) 0.5 g Sulfito de sodio anhidro 0.2 Fenol 100cm 3 Agua destilada C.B.P.

Curva estndar Establecer una escala estndar de 0 a 1mg/cm 3 dentro de una serie de tubos de ensayo introducir: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1 cm 3 de la solucin estndar y Completar a 1 cm 3 con agua destilada.

105

Tubo concentracion (Mg de azucar/1) 0 1 2 3 4 5

Muestra 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Agua destilada ml 1 0 0,8 200 0,6 400 0,4 600 0,2 800 0 1000

Clculos Con los valores obtenidos de la curva estndar de D.O. se hace una regresin lineal, sacar el coeficiente de correlacin (el cual no debe ser menor a 0,99), la pendiente y la ordenada al origen. Sustituir estos valores en la ecuacin de la recta: ( ) Dnde: Y = absorbancia, M = pendiente. X = concentracin (mg de azcar/1) b = ordenada al origen. Reordenando la ecuacin (1) en trminos de X, tenemos: ( ) Sustituir las lecturas que se obtengan en la ecuacin (2) para conocer X concentracin de azcares. Curva de Calibracin

106

ANEXO G. MTODO COLORIMTRICO DICROMATO DE POTASIO EVALUACIN DE LA PRODUCCIN DE ETANOL (Mtodo Colorimtrico de Dicromato de potasio). Para cuantificar la cantidad de etanol producido en la fermentacin se realizara aplicando el Mtodo Colorimtrico de Dicromato de Potasio. PROCEDIMIENTO: Se colocan 4 ml de solucin oxidante (mezcla formada por 4.165 g de Dicromato de potasio y 250 ml de cido sulfrico, aforado con agua destilada a un litro) en tubos de ensayo; luego se adicionan 2 ml de solucin saturada de carbonato de potasio gota a gota por las paredes del tubo hasta que cese el burbujeo y agitar por 10 segundos, seguidamente agregan 2 ml de la muestra a analizar, previamente centrifugada a 3000rpm durante 20 minutos y diluida al 5% v/v con agua destilada. Despus, todos los tubos se agitan a 1500 rpm durante 10 segundos. Para homogenizar la solucin se calienta en un bao de mara termostato a una temperatura ambiente se procede a leer la absorbancia a 440 nm en el espectrofotmetro UV-Vis, se recomienda realizar este procedimiento por duplicado. Los datos obtenidos se deben llevar a una curva patrn que se trazara a partir de estndares de etanol, los cuales se elaboran por medio de una solucin patrn de etanol al 1% (7894 ppm) en el rango de 315.76 ppm hasta 1894.56 ppm (hacer por duplicado y sacar promedio) a los que se les aplica el mtodo descrito anteriormente. Con las absorbancias obtenidas de la serie de patrones estimar la ecuacin de la recta (coeficiente de determinacin R2) y luego hallar las diferentes concentraciones.

107

ANEXO H. ANLISIS DE VARIANZA PRUEBA ANOVA SIMPLE Anlisis Estadstico para el alcohol producido D. Rotundata Este procedimiento realiza un anlisis de la varianza simple para Alcohol. Realiza varios test y grficos para comparar los valores medios de Alcohol para los 3 diferentes niveles de Concentraciones. El F-test en la tabla de ANOVA comprobar si hay alguna diferencia significativa entre las medias. Si hay, los Test de Rangos Mltiples le indicarn las medias que son significativamente diferentes unas de otras. Si le preocupa la presencia de valores atpicos, puede elegir el test Kruskal-Wallis que compara las medianas en lugar de las medias. Los diferentes grficos le ayudarn a juzgar la significacin prctica de los resultados, y le permitirn buscar las posibles violaciones a las asunciones subyacentes en el anlisis de la varianza.

Resumen Estadstico para Alcohol

Esta tabla muestra los datos estadsticos de Alcohol para cada uno de los 3 niveles de Concentraciones. El anlisis de la varianza simple est pensado principalmente para comparar las medias de los diferentes niveles, listados aqu bajo la columna Media. .

108

Tabla ANOVA para Alcohol segn Concentraciones

La tabla ANOVA descompone la varianza de Alcohol en dos componentes: un componente entre grupos y un componente dentro de los grupos. El F-ratio, que en este caso es igual a 0,755223, es el cociente de la estimacin entre grupos y la estimacin dentro de los grupos. Puesto que el p-valor del test F es superior o igual a 0,05,no hay diferencia estadsticamente significativa entre las medias de alcohol de un nivel de Concentraciones a otro para un 95,0%. Grafica 23.Grfico de dispersin para D. Rotundata

109

Grafica 24. Grfico de cajas y bigotes para D. Rotundata

Anlisis Estadstico para el alcohol producido D. Alata Este procedimiento realiza un anlisis de la varianza simple para Alcohol. Realiza varios test y grficos para comparar los valores medios de Alcohol para los 3 diferentes niveles de Concentracin. El F-test en la tabla de ANOVA comprobar si hay alguna diferencia significativa entre las medias. Si hay, los Test de Rangos Mltiples le indicarn las medias que son significativamente diferentes unas de otras. Si le preocupa la presencia de valores atpicos, puede elegir el test KruskalWallis que compara las medianas en lugar de las medias. Los diferentes grficos le ayudarn a juzgar la significacin prctica de los resultados, y le permitirn buscar las posibles violaciones a las asunciones subyacentes en el anlisis de la varianza.

110

Resumen Estadstico para Alcohol producido ame D. Alata

Esta tabla muestra los datos estadsticos de Alcohol para cada uno de los 3 niveles de Concentracin. El anlisis de la varianza simple est pensado principalmente para comparar las medias de los diferentes niveles, listados aqu bajo la columna Media. Tabla ANOVA para Alcohol segn Concentracin.

La tabla ANOVA descompone la varianza de Alcohol en dos componentes: un componente entre grupos y un componente dentro de los grupos. El F-ratio, que en este caso es igual a 0,283889, es el cociente de la estimacin entre grupos y la estimacin dentro de los grupos. Puesto que el p-valor del test F es superior o igual a 0,05,no hay diferencia estadsticamente significativa entre las medias de alcohol de un nivel de Concentracin a otro para un 95,0%.

111

Grafica 26. Grfico de dispersin para D. Alata.

Grafica 27. Grfico de cajas y bigotes para D. Alata

112

Anlisis Estadstico para el alcohol producido D. Trfida. Este procedimiento realiza un anlisis de la varianza simple para Alcohol. Realiza varios test y grficos para comparar los valores medios de Alcohol para los 3 diferentes niveles de Concentraciones. El F-test en la tabla de ANOVA comprobar si hay alguna diferencia significativa entre las medias. Si hay, los Test de Rangos Mltiples le indicarn las medias que son significativamente diferentes unas de otras. Si le preocupa la presencia de valores atpicos, puede elegir el test Kruskal-Wallis que compara las medianas en lugar de las medias. Resumen Estadstico para Alcohol producido ame D. Trfida.

Esta tabla muestra varios estadsticos de Alcohol para cada uno delos 3 niveles de Concentraciones. El anlisis de la varianza simple est pensado principalmente para comparar las medias de los diferentes niveles.

113

Tabla ANOVA para el etanol segn las concentraciones

La tabla ANOVA descompone la varianza de Alcohol en dos componentes: un componente entre grupos y un componente dentro de los grupos. El F-ratio, que en este caso es igual a 0,0705905, es el cociente de la estimacin entre grupos y la estimacin dentro de los grupos. Puesto que el p-valor del test F es superior o igual a 0,05,no hay diferencia estadsticamente significativa entre las medias de alcohol de un nivel de Concentraciones a otro para un 95,0%. Grafica 29. Grfico de dispersin para D. Trfida.

114

Grafica 30. Grfico de cajas y bigotes para D. Trfida

115

ANEXO H. PRUEBAS NO PARAMETRICAS Y PRUEBA T DE STUDENT. A continuacin se encuentran reportada las pruebas de no paramtricas y la prueba T de Student en donde se comprueba que en todas se acepta la Hiptesis alternativa.

Dioscorea. ALATA 10,5% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra Etanol N Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 8 2,1675 1,07449 ,164 ,164 -,156 ,463 ,983

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,07449 Error tp. de la media ,37989

N etanol 8

Media 2,1675

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t etanol -20,618 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -7,83250 Inferior -8,7308 Superior -6,9342

116

D. ALATA 13,5% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra etanol 8 Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 2,0513 1,36307 ,163 ,122 -,163 ,460 ,984

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,36307 Error tp. de la media ,48192

etanol

N 8

Media 2,0513

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t -16,494 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -7,94875 Inferior -9,0883 Superior -6,8092

etanol

117

D. ALATA 15% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra etanol 8 Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 1,7238 1,20983 ,165 ,143 -,165 ,467 ,981

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,20983 Error tp. de la media ,42774

etanol

N 8

Media 1,7238

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t -19,349 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -8,27625 Inferior -9,2877 Superior -7,2648

etanol

118

D. TRFIDA 10,5% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra Etanol 8 Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 1,8000 1,27250 ,121 ,109 -,121 ,343 1,000

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,27250 Error tp. de la media ,44990

Etanol

N 8

Media 1,8000

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t Etanol -18,226 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -8,20000 Inferior -9,2638 Superior -7,1362

119

D. TRFIDA 13,5% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra Etanol 8 Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 2,0463 1,50003 ,107 ,107 -,095 ,301 1,000

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,50003 Error tp. de la media ,53034

Etanol

N 8

Media 2,0463

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t Etanol -14,997 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -7,95375 Inferior -9,2078 Superior -6,6997

120

D. TRFIDA 15% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra Etanol 8 Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 1,8763 1,23848 ,157 ,116 -,157 ,443 ,989

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,23848 Error tp. de la media ,43787

N Etanol 8

Media 1,8763

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t Etanol -18,553 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -8,12375 Inferior -9,1591 Superior -7,0884

121

D. ROTUNDATA 10.5% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra Etanol 8 Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 1,6213 1,16104 ,217 ,217 -,131 ,615 ,844

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,16104 Error tp. de la media ,41049

Etanol

N 8

Media 1,6213

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t Etanol -20,412 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -8,37875 Inferior -9,3494 Superior -7,4081

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D. ROTUNDATA 13.5% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra Etanol 8 Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 1,9050 1,32571 ,123 ,123 -,119 ,348 1,000

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,32571 Error tp. de la media ,46871

Etanol

N 8

Media 1,9050

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t Etanol -17,271 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -8,09500 Inferior -9,2033 Superior -6,9867

123

D. ROTUNDATA 15% Pruebas no paramtricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra Etanol 8 Media Parmetros normales(a,b) Diferencias ms extremas Desviacin tpica Absoluta Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintt. (bilateral) a La distribucin de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos. 2,4300 1,49834 ,092 ,079 -,092 ,260 1,000

Prueba T
Estadsticos para una muestra Desviacin tp. 1,49834 Error tp. de la media ,52974

Etanol

N 8

Media 2,4300

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10 95% Intervalo de confianza para la diferencia t Etanol -14,290 gl 7 Sig. (bilateral) ,000 Diferencia de medias -7,57000 Inferior -8,8226 Superior -6,3174

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ANEXO I.ESTIMACIN DE COSTOS El estudio fue realizado a escala de laboratorio y a continuacin en la tabla 13 se presentan los costos de los reactivos y materiales. Tabla 13. Estimacin de costos de proyecto FUENTES DE FINANCIACIN Recursos propio Recursos propio Recursos propio Recursos propio Recursos propio Recursos propio Recursos propio Recursos propio Recursos propio Recursos propio

RUBROS Kg D. Alata . Diamante Kg D. Trfida . Baboso Kg D. Rotundata . Espino Reactivos Gasa Estril Jeringas de 10 ml Cinta de Enmascarar Algodn Venoclisis de Macrogoteo Tubos Cnico con tapa COSTO TOTAL
Fuente: los autores del proyecto

COSTOS 4800 5400 7200 724000 12000 10000 10000 3000 25000 44080 845480

Al observar los costos presentados en la tabla anterior, se puede realizar una proyeccin a escala industrial ya que los costos de materia prima no son tan elevados lo cual puede sustentar viabilidad para proyectos futuros, claro est que se propone como alternativa la siembra de clulas productoras de las enzimas; alfa amilasa y glucoamilasa, debido a que los costos de estas enzimas comercialmente son bastante elevados y la siembra de clulas supone costos ms bajos por los requerimientos del cultivo.

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