Wykorzystanie testu MTT do oceny stopnia cytotoksycznoci grzybw pleniowych

Natalia Grajewska, Magdalena Twaruek, Ewelina Soszczyska, Jan Grajewski

Uniwersytet Kazimierza Wielkiego, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Zakad Fizjologii i Toksykologii, ul. Chodkiewicza 30, 85-064 Bydgoszcz

Test kultur komrkowych MTT

Najczciej do oceny toksycznoci wykorzystywano testy biologiczne in vivo, wykonywane na zwierztach. Obecnie alternatyw dla tych bada stanowi systemy oceny biologicznej aktywnoci toksyn, oparte na kulturach komrek, tkanek lub mikroorganizmach.
Kolby kukurydzy poraone grzybami pleniowymi

Test cytotoksycznoci MTT wykorzystywany jest w specjalistycznych laboratoriach oceniajcych przydatno lekw oraz toksyczno wielu substancji. Test ten wykorzystuje si rwnie do oceny stopnia cytotoksycznoci wtrnych metabolitw grzybw pleniowych - mikotoksyn w artykuach ywnociowych, surowcach rolinnych, paszach a take materiaach budowlanych.
Zagrzybione pomieszczenia mieszkalne

Proces ten zachodzi w mitochondriach ywych komrek. Redukcja MTT do formazanu nastpuje w sposb proporcjonalny do iloci komrek. Tylko komrki aktywne metabolicznie przeprowadzaj ten proces. Jeeli, wic komrki zostay wczeniej uszkodzone, upoledzone metabolicznie lub zniszczone przez toksyn, to reakcja ta jest mniej intensywna lub nie zachodzi w ogle, co mona stwierdzi po zmianie barwy i oznaczy fotometrycznie. Intensywno barwy roztworu jest wprost proporcjonalna do liczby ywych komrek.

Analiza prb
Pena analiza obejmuje badanie prby (materia skaony lub podejrzany o skaenia) i kontroli (materia czysty), jako odniesienia dla oceny cytotoksycznoci, poniewa test ten moe oprcz skae mikotoksynami, wykry rwnie inne skaenia powodujce cytotoksyczno, a take wywoujce szereg reakcji alergicznych.
Przygotowanie ekstraktw
Pocztkowy i kocowy etap redukcji MTT do formazanu

Test MTT zosta opracowany w latach 80. XX w. przez Mosmanna i jest jedn z najczciej stosowanych metod sucych do szybkiej, ilociowej oceny cytotoksycznoci prby wobec komrek (metoda przesiewowa, screening). Nie informuje o rodzaju wystpujcych mikotoksyn, ale o ich biologicznych skutkach w postaci cytotoksycznoci. Charakteryzuje si wysok czuoci ze wzgldu na wykorzystanie komrek nerek wiskich (SK), wraliwych na wikszo najczciej spotykanych mikotoksyn.

Przygotowanie pytki wstpnego rozcieczenia

Komrki SK

Przeniesienie kolejnych rozciecze na pytk testow z komrkami SK

Wydruk wartoci ekstynkcji analizowanych prb z programu Micro Win 2000

120

Zasada dziaania testu MTT

Test ten jest ilociowym kolorymetrycznym testem toksycznoci, ktrego podstaw jest przeksztacenie soli tetrazoliowych (MTT) o zabarwieniu tym do fioletowo zabarwionego, nierozpuszczalnego w wodzie formazanu (rozpuszczalny w DMSO lub izopropanolu). Wykorzystuje si w nim aktywno dehydrogenazy bursztynianowej, enzymu mitochondrialnego, obecnego w ywych komrkach, ktry przeksztaca sl tetrazoliow (MTT, bromek 3-(4,5dimetylotiazol-2-yl)-2,5 difenylotetrazoliowy), w form zredukowan formazan, wytrcajcy si w postaci krysztaw.

MTT

Inkubacja 48 h

100

80

60

Dodanie MTT, inkubacja 4 h

40

20

Dodanie DMSO
R E D U K C J A

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 IC 50

Asp. ochraceus 13CW

Asp. ochraceus 6ER

Asp. terreus 8AR/8ER

Wykres ekstynkcji prb grzybw pleniowych

Pomiar fotometryczny przy dugoci fali 510 nm

FORMAZAN

Studzienki do kontroli komrek s ciemnofioletowe i odpowiadaj 100% aktywnoci podziaowej. Studzienki zawierajce skaon (cytotoksyczn) prb s odbarwione, lub ich barwa jest znacznie mniej intensywna. Wartoci absorpcji prbek poniej 50% aktywnoci podziaowej uwaa si za toksyczne. Na podstawie stopni rozcieczenia oznacza si graniczne stenie toksyczne, tzn. najmniejsz testowan prbk, ktra spowodowaa toksyczne dziaanie na komrki.

Nigrospora oryzae

Aureobasidium pullulans Fusarium oxysporum Fusarium moniliforme

GRAJEWSKI J., TWARUEK M. 2004. Zdrowotne aspekty oddziaywania grzybw pleniowych i mikotoksyn. Alergia 3(21), s. 45-49 KRZYSZTO-RUSSJAN J. i in. 2009. Porwnanie uytecznoci testw MTT i EZ4U stosowanych do oceny cytotoksycznoci ksenobiotykw. Testy diagnostyczne, tom 65, 6, s.395-402 GAREIS M. 2006. Diagnostischer Zellkulturtest (MTT-Test) fur den Nachweis von zytotoxischen Kontaminanten und Ruckstanden. J.Verbr. Lebensm. 1, s.354-363 GRAJEWSKA N. 2010. Cytotoksyczno grzybw izolowanych z kukurydzy, praca magisterska
Finansowanie Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyszego, projekt midzynarodowy niewspfinansowany. Decyzja nr 761/N-Austria/2010/0

Ustilago maydis Czapek KONTROLA

Przykady pytek testowych z ekstraktami grzybw pleniowych