Cceres Viviana, Ferrer Zully, Yaez Luz

UFPS, Facultad de ciencias agrarias y Del ambiente, Ingeniera Biotecnolgica, Gentica Molecular, 2013

Informe

Zully Viviana Caceres-1610010; Zully Zenith Ferrer-1610614; Luz Francy Yaez-1610653

TRANSFORMACION BACTERIANA CON EL PLASMIDO pGLO

INTRODUCCION En esta prctica, se utiliz un procedimiento conocido como transformacin Gentica, esta ocurre cuando una clula capta y expresa una nueva porcin de material gentico (ADN). Y proporciona al organismo una nueva caracterstica que es identificable despus de la transformacin. Los genes se pueden obtener de ADN de humanos, animales o de plantas, e introducirse en las bacterias En este laboratorio se utiliz un procedimiento que transform la bacteria E. coli con un gene que codifica para una protena fluorescente de color verde (GFP). Este gen ha sido extrado de una medusa o agua viva que es fluorescente y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria. La protena fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformacin, la bacteria expresa el gen de la medusa adquirido y produce la protena fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.

OBJETIVOS

Conocer los principios bsicos y aplicaciones de la trasformacin bacteriana de E.coli. Aprender cmo pasar genes de un organismo a otro con la ayuda de un plsmido y familiarizarse con la tcnica de transformacin de las clulas tratadas con calcio. Analizar e interpretar loos resultados y calcular la eficiencia de la transformacin. Comprender la regulacin de la expresin gentica del operon arabinosa.

Informe de laboratorio. Profesora Liliana Yanet Suarez Contreras

Cceres Viviana, Ferrer Carrillo Zully Yez Meneses Francy

MATERIALES Y METODOLOGIA Para la realizacin de esta prctica se requiere una placa sembrada con E.coli, solucin de transformacin, asas de siembra, pipeta, gradilla de espuma/corcho, cubeta con hielo picado, bao mara a 42C, termmetro y 4 placas con agar marcadas as.: 1) +pGLO/LB/AMP, la 2) +Pglo/LB/AMP/ARABINOSA, UNA 3ra como pGLO/LB/AMP. Y finalmente 4) Pglo/LB/. Ya finalizada la etapa preparatoria y preparacin de las cajas con los medios descritos anteriormente se prosigue a la fase de preparacin de las bacterias; para ello se rehidrata la cepa de E.coli aadindole la solucin de transformacin para ser sembrada. El kit ya trae la cepa. Como siguiente paso se prepara el plsmido aadiendo la solucin de transformacin en el tubo que contiene el plsmido y se rotulan 2 tubos eppendorf uno para +pGLO y otro pGLO. Se sumergen los tubos en hielo. De la caja con la bacteria previamente activada, se toma una colonia y se inocula en cada uno de los tubos. De la solucin preparada con el plsmido pGLO se toma con un asa estril y se inocula en el tubo marcado como: +pGLO. Se incuba en el hielo por 10 min asegurndose que estn en contacto con el hielo. En seguida se realiza un choque trmico en bao Mara a 42C durante 50 seg. Exactos y luego a hielo durante 2 min. Despus se agregan 250 L de LB a cada tubo. Se tapa y se deja 20 min a temperatura ambiente. Con la micropipeta estril se pasan 100 ml de cada tubo a las placas correspondientes y con el asa estril se extiende el lquido por toda la superficie de la caja. Se envuelven las cajas con envoplast e incubar a 37C hasta el da siguiente.

Transformacin bacteriana

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RESULTADOS Y DISCUCIONES

Control/ grupo +PGLO (LB/ ampicilina)

+PGLO (LB/ ampicilina/ar abinosa))

-PGLO (LB/ampicilin a)

-PGLO (LB)

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El gen para sintetizar la protena fluorescente GFP se puede activar en las clulas transformadas simplemente aadiendo arabinosa al medio de cultivo. La seleccin de las clulas que se han transformado con el plsmido pGLO se realiza observando el crecimiento en placas con antibitico. Las clulas transformadas aparecern blancas (fenotipo salvaje) en placas que no contengan arabinosa, y de color verde fluorescente cuando se aada arabinosa al agar. Todo el proceso se puede observar con una lmpara de luz ultravioleta. Adems de un cromosoma, las bacterias pueden contener uno o ms pequeos fragmentos circulares de ADN denominados plsmidos. Un plsmido suele contener genes que proporcionan alguna caracterstica beneficiosa a la bacteria portadora, para facilitar su supervivencia. El plsmido pGLO contiene el gen para la sntesis de la protena GFP y un gen de resistencia al antibitico ampicilina y un sistema especial de regulacin de genes que se puede usar para controlar la expresin de la protena fluorescente en las clulas transformadas. CONCLUSIONES

Transformacin gentica es un cambio causado por genes, e implica la insercin de uno o ms genes en un organismo, con el objetivo de modificar sus caractersticas. El mecanismo de transformacin, les permite a las bacterias adaptarse a nuevos medios. Por ejemplo: la resistencia bacteriana a los antibiticos que se debe a la transformacin plasmdica En el laboratorio es imprescindible trabajar bajo condiciones de esterilidad y tener un buen manejo de la pipeta para evitar posibles errores los volmenes medidos. Los resultados pocos visibles del grupo B, puede ser debido a un error en el procedimiento al agregar el plsmido, quizs en poca cantidad. El plsmido PGLO es el que codifica la protena verde fosforescente. El procedimiento establecido es viable, ya qie se obtuvieron resultados satisfactorios para el grupo A y C.

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Se observo crecimiento de todas las cepas, inclusive aquellas donde no tenan que crecer, esto puede ser debido a que la bacteria se ha modificado y ahora es resistente al antibitico y no brillaron ya que no tenan el plasmido. CUESTIONARIO

Cuestin 1: 1. Puedo modificar genticamente un organismo? Qu organismo?

si se puede modificar genticamente un organismo, este puede ser una planta, animal, hongo o bacteria a la que se le ha agregado por ingeniera gentica uno o unos pocos genes con el fin de producir protenas de inters industrial o bien mejorar ciertos rasgos, como la resistencia a plagas, la calidad nutricional, la tolerancia a heladas, entre otras caractersticas. 2. Para modificar genticamente un organismo, se debe insertar un nuevo gen en cada clula del organismo. Qu organismo ser ms apropiado para ser modificado genticamente, uno pluricelular o uno unicelular? La complejidad de los genomas eucariticos hace que el estudio de un gen y de su expresin sea muy difcil. Las bacterias adems de poseer un cromosoma grande, comnmente poseen pequeos pedazos circulares de DNA llamados plsmidos. El ADN del plsmido usualmente contiene genes para una o ms caractersticas que pueden ser beneficiosos para la sobrevivencia de la bacteria [2]. Los plsmidos se utilizan en ingeniera gentica por la facilidad con la que se manipulan. Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica contienen uno o dos genes que les confieren resistencia a antibiticos (marcadores seleccin) y permiten seleccionar clones recombinantes [1].

3. Los cientficos a menudo quieren saber si los organismos modificados genticamente pueden pasar sus nuevas caractersticas a su descendencia y futuras generaciones. Para obtener esta informacin, qu organismo ser ms apropiado para el experimento?, uno que crezca y se reproduzca rpidamente, o uno que lo haga ms lentamente? Las especies que se eligen como modelo tienen las siguientes caractersticas en comn:

Fcil manutencin y manipulacin en el laboratorio. Ciclos de vida cortos. Gran nmero de descendencia.
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Disponibilidad de variabilidad fenotpica y genotpica. Fenotipo de inters sencillo de observar o medir. Tcnicas de estudio puestas a punto para estas especies [1].

4. La seguridad es otro factor importante al elegir el organismo. Qu caractersticas debe tener o no tener el organismo para asegurarnos de que no nos daar ni a nosotros ni al medio ambiente? Caractersticas No debe presentar riesgos sanitarios, como: Resistencia a antibiticos: riesgo terico que el gen que da resistencia al antibitico pase a la bacteria del tracto intestinal humano, directa e indirectamente, un ejemplo, es va bacterias del tracto intestinal de los animales con maz transgnico no procesado. Alergenicidad: riesgo de aparicin de alergias insospechadas. No debe presentar riesgos ecolgicos. Afectacin a la biodiversidad: riesgo de contaminacin, ejemplo, por el polen de plantas transgnicas hacia otras no transgnicas del mismo cultivo, pudiendo alterar la diversidad biolgica. Cruzamiento lejano: riesgo de transferencia de la resistencia a herbicidas hacia especies silvestres afines. Contaminacin: como consecuencia del riesgo de transferencia, la resistencia a herbicidas puede difundirse en plantas silvestres que, si son indeseables para los cultivos, podran dar lugar al incremento de usos de herbicidas, con el riesgo de contaminacin de suelos y de aguas. Adems, otras de las caractersticas se debe a la gran versatilidad en la ingeniera, puesto que los genes que se incorporan al organismo husped pueden provenir de cualquier especie, incluyendo bacterias 5. Teniendo en cuenta las cuestiones anteriores, cul ser la mejor opcin para realizar la modificacin gentica: una bacteria, una lombriz, un pez o un ratn? Razona la respuesta. Una bacteria por poseer un genoma sencillo, lo hace fcil de manipular y de esta manera una buena herramienta en ingeniera gentica.

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Una bacteria sera la mejor opcin debido a que al realizar el proceso de transformacin de clulas (por ejemplo de E. coli) se demuestra la habilidad de este DNA para modificar permanentemente la herencia gentica de las clulas que lo adquieren, para ello se transformar con un plsmido que contiene su propio ori y un gen de resistencia a antibitico. Adems como se reproducen con rapidez y son fciles de desarrollar, las bacterias transgnicas producen hoy infinidad de sustancias importantes y tiles para la salud y la industria. En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse plsmidos de unas a otras, pudiendo as compartir esos genes beneficiosos (los plsmidos son abundantes en bacterias). 6. Qu son las clulas electrocompetentes? En la naturaleza, la transformacin puede ocurrir en ciertos tipos de bacterias. En la biologa molecular, sin embargo, la transformacin se induce artificialmente a travs de la creacin de poros en las paredes celulares bacterianas. Las clulas bacterianas que son capaces de captar ADN a partir del medio ambiente se denominan clulas competentes. Clulas electrocompetentes se pueden producir en el laboratorio y la transformacin de estas clulas se puede lograr a travs de la aplicacin de un campo elctrico que crea poros en la pared celular a travs de la cual puede pasar el ADN. [4]

7. Cules son las ventajas de la elecroporacion comparada con la transformacin con calcio? El mtodo del fosfato clcico es un meodo quimico en el cual se realiza una mezcla de DNA con iones calcio, con una subsiguiente adicin de fosfato a la mezcla y la presentacin de la solucin final a las clulas en cultivo. En esta situacin se precipitan el DNA y los iones calcio formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las clulas. La eficiencia de transfeccin puede ser mayor al 50% dependiendo del tipo celular y del tamao y calidad del precipitado que se forma. Este mtodo tienen como ventaja, frente a los otros mtodos, su simplicidad, facilidad de produccin y su relativa baja toxicidad. La electroporacin es un mtodo fsico; sta tcnica que se basa en la aplicacin de un elevado voltaje a las clulas durante un periodo de tiempo muy corto, tiempo durante el cual las clulas despolarizan sus membranas y se forman pequeos orificios por los que penetran las molculas (protenas, DNA,...). Esta tcnica se aplica a millones de clulas a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada de las molculas del 100% de las clulas que sobreviven (centenares de miles a millones).

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REFERENCIAS

[1] GALVN CEJUDO, Aurora, et al. Transformacin de Escherichia coli con un plsmido recombinante. [en lnea]. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Crdoba. [Citado en 2011-06-07]. Disponible en internet: http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/48%20TRANSFORMACI%C3%93N%20E%20COLI%20CON%20PL%C3%81 SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf (1)
[2]

[3] Transformacin bacteriana. [en lnea]. [Citado en 2011-06-10]. Disponible en internet:< http://bc.inter.edu/facultad/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/TRANSFORMACI% C3%93N%20%20%20BACTERIANA.htm> (2) [4] https://www.jove.com/science-education/5060/transformacin-bacteriana-la electroporacin?language=Spanish

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