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El estudio de la Fisiologa de la Conducta implica muchas disciplinas (Fisiologa, Neuroanatoma, Bioqumica, Psicologa, Endocrinologa e Histologa). Llevar a cabo un proyecto de investigacin en Neurociencia comportamental requiere dominar muchas tcnicas experimentales. Los investigadores disponen de una enorme y sorprendente variedad de mtodos de investigacin; de los que vamos a ver los ms utilizados e importantes.
1. ABLACIN EXPERIMENTAL
Ablacin experimental: Extirpacin o destruccin de una parte del encfalo de un animal de laboratorio. Se supone que las funciones que ya no pueden realizarse son las que dicha regin controlaba previamente. En la mayora de los casos esta tcnica no implica extraer el tejido cerebral; se destruye y se deja en su sitio. La ablacin experimental es el ms antiguo de los mtodos utilizados en Neurociencia y se utiliza frecuentemente en nuestros das.
Existen mtodos ms especficos para marcar y lesionar neuronas. Bilogos moleculares han ideado procedimientos para incorporar sustancias qumicas txicas a los anticuerpos (Ac), los cuales al unirse a determinadas protenas que se encuentran solo en ciertos tipos de neuronas del cerebro, hacen que las sustancias qumicas txicas destruyan las clulas a las que estn unidas las protenas. En lesiones subcorticales mediante corriente de RF a travs de un electrodo o por infusin de una sustancia qumica con una cnula, siempre se causan daos adicionales en el encfalo. Por ello no debemos limitarnos a comparar la conducta de los animales lesionados con la de animales de referencia sanos. La causa de alguna de las alteraciones comportamentales puede ser por un dao fortuito de una regin cerebral situada por encima de la lesin. Para evitar esta situacin se produce una lesin falsa, en la que a los animales de referencia se les hace el mismo proceso quirrgico que al animal de estudio excepto activar el dispositivo de lesin e iniciar la infusin. Si la conducta de los animales con lesin cerebral es diferente a la de los animales de referencia con lesin falsa, se concluye que las lesiones son la causa de las alteraciones comportamentales (la lesin falsa tiene la misma finalidad que un tratamiento placebo en estudios farmacolgicos). Lesin falsa: Procedimiento placebo que reproduce todas las etapas para producir una lesin cerebral, excepto la que en realidad la provoca. La mayora de las veces se producen lesiones permanentes, pero a veces resulta provechoso impedir temporalmente la actividad de una determinada regin del encfalo. Para ello, lo ms sencillo es inyectar un anestsico local o un frmaco llamado muscimol en el lugar adecuado del encfalo. El anestsico bloquea los potenciales de accin en los axones que entran o salen de esa regin y es eficaz para producir una lesin temporal (lesin reversible). El muscimol, que estimula los receptores GABA (principal neurotransmisor inhibidor en el encfalo), inactiva una regin del encfalo al inhibir las neuronas all localizadas.
CIRUGA ETEREOTXICA
Ciruga estereotxica: ciruga cerebral que utiliza instrumental estereotxico para situar un electrodo o cnula en una posicin especfica del encfalo. Stereotaxis significa disposicin slida y se refiere a la capacidad de localizar objetos en el espacio. El aparato estereotxico consta de un soporte que inmoviliza la cabeza del animal y un brazo que desplaza el electrodo o cnula en los tres ejes espaciales a lo largo de distancias cuantificables. Para ello es necesario conocer el atlas estereotxico. No existen dos encfalos iguales en una misma especie pero existen semejanzas para predecir la localizacin de una estructura cerebral concreta respecto a las caractersticas externas de la cabeza. El crneo se compone de huesos que crecen juntos y forman suturas (puntos de unin). En los recin nacidos hay un punto blando donde se unen las suturas sagital y coronal, llamado fontanela. Cuando esta abertura se cierra, la unin se denomina bregma. Bregma: unin de las suturas sagital y coronal del crneo. Se suele utilizar como punto de referencia en ciruga estereotxica. de esquemas de secciones del encfalo de un determinado animal, con medidas que proporcionan coordenadas para la ciruga estereotxica. Incluye fotografas o esquemas que corresponden a secciones frontales, tomadas a diferentes distancias rostrales y caudales a bregma. Cada pgina del atlas estereotxico est identificada conforme a la distancia de la seccin anterior o posterior respecto al bregma, y la cuadrcula de cada pgina indica las coordenadas de las estructuras cerebrales en el plano ventral a la parte superior del crneo y lateral a la lnea media
Localizando una estructura neural (que no se puede ver en el animal de experimentacin) en una de las pginas del atlas estereotxico, se puede determinar su localizacin respecto al bregma (que s se puede ver). Hay que tener en cuenta que debido a la edad, y variaciones en la cepa de los animales, la localizacin que proporcionan los atlas es solo aproximada, por lo que siempre hay que probar con una nueva serie de coordenadas, seccionar y teir el encfalo, comprobar la localizacin exacta de la lesin, corregir los valores y volver a intentarlo.
Instrumento estereotxico
Dispositivo que permite a un cirujano situar un electrodo o con el objetivo de la lesin sealizado. una cnula en una parte concreta del encfalo. Funciona siguiendo unos principios sencillos. Incluye un soporte para la cabeza que mantiene el crneo del animal en la ubicacin adecuada, un soporte para el electrodo y un mecanismo de graduacin por el que se mueve este ltimo soporte en distancias ponderadas a lo largo de los tres ejes espaciales: anterior-posterior, dorsal-ventral y lateral-medial. Se utilizan diferentes tipos de soportes de cabeza segn la especie. Una vez obtenido las coordenadas estereotxicas a partir de un atlas estereotxico, se anestesia al animal, se le coloca el instrumento y se hace una incisin en el cuero cabelludo. Se localiza el bregma, se marcan los nmeros apropiados en el Aparato y ciruga estereotxica en una rata y un humano. aparato de estereotaxia, se taladra el crneo y se introduce el dispositivo en el encfalo hasta las coordenadas correctas. Esta ciruga no solo tiene un fin lesivo. Los electrodos en el encfalo pueden destruir o estimular neuronas; adems se pueden inyectar frmacos que estimulen neuronas o bloqueen receptores especficos. Tambin se pueden implantar cnulas o electrodos permanentes. Los neurocirujanos, en ocasiones efectan lesiones subcorticales por ejemplo, para reducir los sntomas del Parkinson-. Para ello se valen de mltiples puntos de referencia y verifican la localizacin del electrodo (u otro dispositivo) insertado en el encfalo mediante RM o registrando las actividades de las neuronas en esta regin antes de producir la lesin cerebral.
Encfalo y crneo de una rata, as como su atlas estereotxico,
MTODOS HISTOLGICOS
Despus de la lesin cerebral y posterior observacin de la conducta, hay que seccionar y teir el tejido cerebral para localizar el lugar de la lesin con el microscopio. A menudo, las lesiones cerebrales yerran su objetivo, por lo que hay que verificar la localizacin exacta del dao cerebral despus de examinar el comportamiento del animal. Para ello es necesario mediante mtodos histolgicos, seccionar, teir y examinar el encfalo
Tincin
Al microscopio una seccin cerebral sin teir muestra los contornos de algunas masas celulares grandes y los fascculos de fibras ms destacados, pero no los detalles ms finos. Por ello, la neuroanatoma microscpica requiere tinciones histolgicas especficas. Para verificar una lesin cerebral se utiliza una de las ms simples: la tincin de los somas celulares. Franz Nissl (neurlogo alemn), a finales del siglo pasado descubri el azul de metileno, con el que se poda teir los somas celulares del tejido cerebral. El material que capta el tinte (sustancia de Nissl) est formado por ARN; ADN y protenas asociadas localizadas en el ncleo y dispersas en forma de grnulos, por el citoplasma. Adems del azul de metileno, existen ms tintes con el mismo propsito, el ms utilizado es el violeta de cresilo. * Los tintes no se desarrollaron con fines histolgicos, en principio se fabricaron para teir telas. El descubrimiento de las tinciones de somas celulares hizo posible identificar masas nucleares en el encfalo. La tincin no tie selectivamente los somas celulares neuronales: todas las clulas, ya sean neuronas o neuroglia, se tien por igual. El investigador debe determinar cual es cual, en funcin de su tamao, forma y localizacin. Los fascculos de fibra tienen un aspecto ms claro porque no absorben el tinte.
Microscopia electrnica
El microscopio ptico tiene escasa capacidad de resolucin espacial para apreciar pequeos detalles, ya que, debido a la propia naturaleza de la luz, una magnificacin o aumento mayor de aproximadamente 1.500 no aade ningn detalle. Para estructuras anatmicas pequeas como las vesculas sinpticas y detalles de orgnulos celulares se necesita un microscopio electrnico de transmisin. Hace pasar un haz de electrones enfocado de un lado a otro de una lmina fina del tejido a examinar y el haz de electrones proyecta una imagen del tejido en una pantalla fluorescente, que puede fotografiarse o escanearse mediante un ordenador. Las microfotografas electrnicas aportan informacin sobre detalles estructurales del orden de unas pocas decenas de nanmetros. Un microscpico electrnico de barrido proporciona menos amplificacin que el electrnico de transmisin estndar, el cual transmite el haz de electrones a travs del tejido. . En cambio, muestra los objetos en tres dimensiones. Para ello, el microscopio explora el tejido mediante un haz de electrones que se desplaza, un detector recibe la informacin del haz y un ordenador produce una imagen tridimensional muy detallada.
Luego se sacrifica al animal, se secciona el encfalo y se acoplan las secciones sobre el portaobjetos. Para poder ver las molculas de PHA-L al microscopio, se aplica un mtodo inmunocitoqumico especial. Mtodo inmunocitoqumico: Mtodo histolgico que utiliza anticuerpos (AC) radioactivos o AC ligados a una molcula teida para indicar la existencia de determinadas protenas de pptidos. Los mtodos inmunocitoqumicos sacan provecho de las reacciones inmunitarias. El sistema inmunitario produce Ac en respuesta a los antgenos (Ag). Los Ag son protenas (o pptidos), como las que se encuentran en la superficie de las bacterias o virus. Los Ac (tambin son protenas) son producidos por los leucocitos para destruir microorganismos invasores, o bien se sitan sobre su superficie y, al igual que los receptores de los neurotransmisores se localizan sobre la membrana de las neuronas. Cuando los Ag presentes en la superficie del microorganismo invasor entran en contacto con los Ac que los reconocen, estos desencadenan el ataque de los leucocitos sobre el invasor. Bilogos moleculares han puesto a punto mtodos de produccin de produccin de Ac para cualquier pptido o protena. Las molculas de los Ac estn unidas a distintos tipos de molculas de colorantes, algunos de los cuales reaccionan con otras sustancias y tien el tejido de color marrn, mientras que otros son fluorescentes. Para determinar en que parte del encfalo se localiza el pptido o la protena (el Ag), se sumergen secciones frescas de tejido cerebral en ina solucin que contiene las molculas de Ac/colorante, y los Ac se unen a su Ag. Al microscopio (bajo una luz de una determinada longitud de onda, en el caso de tintes fluorescentes) se pueden ver las partes del encfalo (incluso neuronas individuales) que contienen el Ag. Si seguimos con la funcin del estudio de la funcin del HVM en la conducta sexual de las hembras, tendremos que averiguar cuales son las estructuras que reciben informacin de las neuronas del HVM, entre ellas la sustancia gris periacueductal (SGPA), y ver que sucede cuando se lesiona cada una de ellas. El dao de alguna de ellas igual tambin altera la conducta sexual de las ratas. Se inyecta PHA-L en dichas estructuras y se observa hacia donde se dirigen sus axones. Finalmente se descubrir la va principal que va desde el HVM hasta las neuronas motoras cuya actividad es necesaria para copular.
Los mtodos antergrado y retrgrado descritos identifican un solo eslabn de una cadena de neuronas (neuronas cuyos axones entran o salen de una regin cerebral determinada), mientras que los mtodos de marcado transneuronal identifican las cadenas de neuronas que establecen conexiones sinpticas (una serie de dos, tres o ms neuronas que forman conexiones sinpticas en serie una con otra). El mtodo de marcado transneuronal retrgrado ms eficaz emplea un virus de la seudorrabia (forma debilitada del virus del herpes del cerdo (originalmente se concibi como vacuna) utilizado para el marcado transneuronal retrgrado. Marca una serie de neuronas que estn interconectadas mediante sinapsis). Para el marcado transneuronal antergrado, se utiliza una variedad del virus del herpes simple, que se inyecta directamente en una regin cerebral, es captado por las neuronas del lugar y las infecta. Luego se extiende a travs de las neuronas infectadas, y finalmente es liberado, contagiando la infeccin a las neuronas con las que establece conexiones sinpticas. Cuanto ms espera el investigador tras inyectar el virus, mayor es la cantidad de neuronas que llegan a infectarse. Despus de sacrificar al animal y seccionado su encfalo, se aplican mtodos inmunocitoqumicos para localizar una protena producida por el virus. La combinacin de estos mtodos permiten descubrir circuitos de neuronas interrelacionadas, contribuyendo a obtener un diagrama de cableado neural del encfalo. Junto con otros mtodos de investigacin se puede tratar de descubrir las funciones de cada uno de los componentes de dicho circuito.
Resultado de los mtodos de marcado. Representacin de una de las aferencias al HVM y una de sus eferencias, puestas de manifiesto por los mtodos de marcado antergrado y retrgrado.
Para la exploracin TAC, se coloca la cabeza del paciente en un amplio cilindro de forma ovalada, que contiene un aparato de rayos X. Enfrente del paciente (al otro lado de la cabeza) hay un detector de rayos X. El haz de rayos pasa a travs de la cabeza y el detector mide la cantidad de radioactividad que se transmite. Este haz explora la cabeza desde todos los ngulos y un ordenador convierte los valores en imgenes del crneo y su contenido. Resonancia Magntica (RM): Tcnica con la que se pueden obtener imgenes precisas del interior del cuerpo. Implica la interaccin entre ondas de radio y un intenso campo magntico. Se parece al TAC pero no utiliza rayos X. En lugar de ello, hace pasar un campo magntico intenso a travs de la cabeza del paciente. Cuando se coloca e cuerpo de un sujeto en un intenso campo magntico, los ncleos de algunos tomos de molculas del organismo rotan siguiendo una determinada alineacin. Si entonces se hace pasar una onda de radiofrecuencia a travs del cuerpo, dichos ncleos emiten ondas de radio. Las diferentes molculas emiten energa a diferentes frecuencias, de modo que el equipo de RM se ajusta para detectar la radiacin procedente de los tomos de hidrgeno. Ya que la concentracin de estos tomos en los distintos tejidos es diferente, el equipo puede utilizar la informacin para elaborar imgenes de secciones del encfalo. A diferencia del TAC cuyas imgenes se limitan a un plano horizontal, las de RM pueden obtenerse tambin en un plano sagital o uno frontal. En la RM se puede distinguir entre las regiones de sustancia gris y blanca, de modo que pueden verse los principales fascculos de fibras (tales como el cuerpo calloso). Pero los fascculos de fibras ms pequeos no pueden verse, salvo con una versin especial de la RM (que incluso puede marcar haces de fibras).
Por encima del cero absoluto, todas las molculas se mueven en direcciones aleatorias debido a la agitacin trmica (a mayor T, mayor movimiento aleatorio). Imgenes Tensoriales de Difusin (ITD): Mtodo de neuroimagen que emplea una RM modificada para poner de manifiesto haces de axones mielnicos en el cerebro humano in vivo. Estas imgenes se benefician del hecho de que el movimiento de las molculas de agua en los fascculos de sustancia blanca no es aleatorio sino que tiende a realizarse en una direccin paralela a la de los axones que constituyen dichos fascculos. La RM utiliza la informacin relativa al movimiento de las molculas de agua para determinar la localizacin y orientacin de los fascculos de axones de la sustancia blanca.
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A veces se fijan dispositivos complejos al crneo del animal cuando se implantan microelectrodos. Estos incluyen mecanismos de tornillos que permiten desplazar el electrodo (o su conjunto) al interior del encfalo, de forma que pueda registrar diferentes partes de este mientras realiza las observaciones. Las seales elctricas que detectan los electrodos son dbiles y tienen que amplificarse. Los amplificadores permiten que estas seales puedan verse en un osciloscopio y almacenarse en la memoria de un ordenador. Lo que se hace es registrar la actividad de las neuronas serotoninrgicas y noradrenrgicas durante diferentes fases del sueo, y con ello se aprecia que la frecuencia de descarga de estas neuronas decae casi hasta cero durante el sueo REM; lo que nos sugiere que tales neuronas tienen un efecto inhibidor sobre dicho tipo de sueo. Es decir, el sueo REM no puede ocurrir hasta que esas neuronas dejan de descargar.
Caso: Una seora sufri un ataque cardaco como consecuencia de una arteriosclerosis (endurecimiento de las arterias); un trombo fue lo que provoc el ataque.
Pasado un tiempo tuvo varios ataques isqumicos transitorios con sntomas neurolgicos (entumecimiento del brazo derecho y dificultades para hablar). Mediante un angiograma, se apreci que su arteria cartida izquierda estaba casi obstruida, con lo cual deba someterse a intervencin quirrgica (endoarteriectoma cartida) para eliminar la placa obstructiva y restablecer el aporte sanguneo. En la intervencin se le colocaron electrodos en el cuero cabelludo para ser controlada mediante EEG. Se le practic una incisin en el cuello dejando al descubierto su cartida interna, en el punto donde la cartida comn se divide en interna y externa. Se coloc una cinta de plstico alrededor de la cartida comn, y se pinz para detener el flujo de sangre, pero haba cierta lentitudes las ondas del EEG. As que se opt por utilizar una sonda de derivacin (mediante una incisin por encima y debajo de la obstruccin) para poder trabajar en la arteria lesionada sin para el flujo sanguneo. A continuacin se extirp la masa amarillenta causante del problema, se cerr la incisin y se extrajo la sonda. La mayora de cirujanos prefieren pinzar la arteria ocluida mientras trabajan (el trabajo es ms rpido y las complicaciones menos probables). Dado que hay conexin del aporte sanguneo a cada uno de los hemisferios (mediante arterias comunicantes especiales), se suele poder sellar una de las cartidas durante algunos minutos sin causar dao. Pero a veces el flujo de un lado no es suficiente para abastecer al otro; el nico modo de saberlo es mediante el EEG, ya que si el cerebro no est recibiendo el aporte sanguneo suficiente, en el EEG se ven las caractersticas ondas lentas. Fue lo que sucedi en este caso y debido a ello se opt por hacer una 1 derivacin. Sin ello, la intervencin podra haber causado una apopleja en lugar de prevenirla. La paciente se recuper bien de la intervencin.
Los electroencefalogramas (EEG) o escritos de la electricidad de la cabeza son los registros del potencial elctrico cerebral obtenido mediante electrodos situados sobre el cuero cabelludo. Se pueden utilizar para el diagnstico de la epilepsia o para estudiar las fases del sueo y vigilia, las cuales se asocian con patrones de actividad elctrica caractersticos. Otra aplicacin del EEG es supervisar el estado del encfalo durante intervenciones que, en principio, pueden daarlo.
Magnetoencefalografa
Procedimiento que detecta grupo de neuronas activadas sincrnicamente gracias al campo magntico inducido por su actividad elctrica. Utiliza un conjunto de elementos superconductores de interferencia cuntica o SQUID. Cuando una corriente elctrica fluye a travs de un conductor, induce un campo magntico. Es decir, cuando los potenciales de accin se transmiten a lo largo de los axones o los potenciales postsinpticos se transmiten por las dendritas o se propagan de un lado a otro de la membrana somtica de la neurona, tambin se producen campos magnticos. Estos campos son muy pequeos, pero se han elaborado detectores superconductores (SQUID) capaces de detectar campos magnticos de aproximadamente una milmillonsima parte del tamao del campo magntico de la tierra. La magnetoencefalografa se realiza mediante neuromagnetmetros (instrumentos que contienen varios SQUID dispuestos de manera que un ordenador pueda examinar su emisin y calcular el origen de seales determinadas en el encfalo. Estos equipos pueden utilizarse en la prctica clnica, por ejemplo, para localizar el foco de crisis epilpticas y poder extirparlas quirrgicamente; o bien en experimentos para cuantificar la actividad cerebral regional asociada a la percepcin de diversos estmulos o a la ejecucin de varias conductas o tareas cognitivas.
Otro mtodo para identificar las regiones activas del encfalo se beneficia del hecho de que cuando las neuronas son estmuladas (por ejemplo, por los botones terminales que establecen sinapsis con ellas) determinados genes del ncleo, a los que se les llama genes de expresin temprana, son activados y se producen protenas especficas. Estas protenas se unen a los cromosomas del ncleo y la presencia de estas protenas nucleares indican que las neuronas acaban de ser activadas. Una de estas protenas nucleares producida durante la activacin neural recibe el nombre de Fos (protena que se produce en el ncleo de una neurona en respuesta a la estimulacin sinptica). Supongamos que queremos utilizar el mtodo Fos para ver que neuronas se activan durante la actividad sexual de una rata hembra. Para ello, se instalan ratas hembras con machos y se les permite aparearse; luego se extrae el encfalo de las ratas, se secciona y se sigue un procedimiento para teir la protena Fos. En la amgdala medial de una rata hembra que acaba de aparearse pueden observarse puntos oscuros, lo que indica la presencia de protena Fos. Parece ser que estas neuronas se han activado debido a la cpula quiz por la estimulacin fsica de los genitales que han tenido las ratas- (si hacemos memoria, cuando se inyect un marcado retrgrado oro fluorado- en el HVM, se encontr que esta regin recibe aferencias de la amgdala medial). La actividad metablica de regiones cerebrales especficas tambin puede estimarse en el cerebro humano utilizando neuroimagen funcional (mtodo computarizado para detectar cambios qumicos o metablicos en regiones concretas del cerebro). Tomografa por emisin de positrones (TEP): Mtodo de neuroimagen funcional que revela la localizacin de un marcador radioactivo en un encfalo vivo. Fue el primer mtodo de neuroimagen inventado. Primero se le inyecta al paciente 2-DG radioactiva (con el tiempo la sustancia se degrada y sale de las clulas. La dosis administrada a los humanos es inocua). Se coloca la cabeza en un aparato similar al TAC, y al descomponerse las molculas radioactivas de 2-DG, emiten partculas subatmicas (positrones), que son detectadas por el equipo de TEP. El ordenador determina cuales son las regiones del encfalo que han absorbido la sustancia radioactiva y crea una imagen de una seccin del encfalo, mostrando el nivel de actividad de diversas regiones de dicha seccin. Un inconveniente es su coste de funcionamiento. Por seguridad, las sustancias radioactivas utilizadas tienen una vida media muy corta se descomponen y pierden su radioactividad rpidamente-. (la vida media de la 2-DG es de 110 minutos y la del agua radioactiva (tambin utilizada para obtener imgenes TEP) es de solo 2 minutos). Teniendo en cuenta su rpida descomposicin, tienen que producirse en el lugar donde se van a utilizar, mediante un acelerador de partculas denominado ciclotrn. Por lo que al coste de la TEP hay que aadirle el del ciclotrn y los salarios del personal que se encarga de l. Otro inconveniente es la relativamente baja resolucin espacial de En la fila superior de estas imgenes de TEP, seccin horizontal, de encfalos humanos las imgenes (la imagen es borrosa). La resolucin temporal tambin pueden verse tras imgenes de una persona en reposo. En la fila inferior, las mismas es baja porque han de obtenerse muestras de los positrones que va personas mientras abran y cerraban el puo derecho. Se observa una elevada absorcin emitiendo el cerebro durante bastante tiempo, lo que implica que de 2-DG radioactiva en las regiones del cerebro encargadas de control del movimiento, lo que indica un alto grado de actividad metablica en dichas reas. Los colores indican probablemente pasen desapercibidos acontecimientos rpidos, diferentes ndices de absorcin. efmeros, que suceden en el cerebro.
En esta RMf del encfalo humano se muestra un aumento localizado del promedio de la actividad de la actividad neural en varones (izquierda) y mujeres (derecha) mientras discernan si un par de palabras escritas rimaba.
Estas desventajas no se dan en la resonancia magntica funcional (RMf): Mtodo de neuroimagen funcional. Es una modificacin del procedimiento de RM que permite calcular el metabolismo regional en el encfalo, por lo general detectando cambios en el nivel de oxgeno en sangre. Es el mtodo con mejor resolucin temporal y espacial. La actividad cerebral se evala indirectamente al detectar los niveles de oxgeno en los vasos sanguneos del encfalo. El aumento de actividad de una regin del encfalo estimula el aporte sanguneo a dicha regin, lo que eleva el nivel de oxgeno en sangre local. El trmino tcnico para referirse a este tipo de exploracin es BOLD (seal dependiente del nivel de oxgeno en sangre). La RMf tiene una resolucin mayor que la TEP y la exploracin se puede realizar mucho ms rpida, por ello proporciona una informacin ms acerca de la actividad en una regin determinada del cerebro. Pero la exploracin con TEP ofrece algo que la RMf no puede: estima la concentracin de determinadas sustancias qumicas en diversas partes del encfalo.
El ac. Clnico, que hemos visto antes como una neurotoxina, tambin puede utilizarse para estimular las neuronas (produce lesiones excitotxicas al estimular las neuronas hasta destruirlas. Dosis altas de una solucin concentrada destruyen las neuronas; dosis bajas de una solucin diluida solo las estimula). En el experimento que comentbamos, la estimulacin del HVM sustituye la accin de las hormonas sexuales femeninas. Es decir, quiz las hormonas sexuales femeninas ejerzan sus efectos en dicho ncleo. La estimulacin de una regin especfica del cerebro con electricidad o sustancias qumicas excitadoras afecta a muchos tipos diferentes de neuronas, y no es probable que el resultado sea similar a la actividad cerebral normal, que implica la activacin y la inhibicin coordinada de muchas neuronas diferentes. Lo ideal sera estimular o inhibir los grupos neuronales que nos interesan en una regin dada del cerebro.
Fotoestimulacin
Los ltimos avances estn proporcionando los medios para estimular o inhibir tipos especficos de neuronas en regiones especficas del encfalo. En muchos organismos (incluso unicelulares) han evolucionado protenas fotosensibles. Una de ellas, la rodopsina-canal-2 (ChR2), que se encuentra en las algas verdes, controla un canal inico que, cuando se abre, permite el flujo a travs de ella de iones de sodio, potasio y calcio. Cuando una luz azul incide en el canal inico de ChR2 se abre, y la corriente de iones Na y Ca cargados positivamente despolariza la membrana. Otra protena fotosensible, Natronomonas pharaonis halorhodpsin (NpHR), se encuentra en una bacteria y controla un transportador que ingresa cloruro dentro de la clula cuando es activada por una luz amarilla. Esta entrada de iones cargados negativamente hiperpolariza la membrana. La accin de ambas protenas fotosensibles comienza y termina muy rpidamente cuando se enciende y apaga una luz de longitud de onda apropiada. Se puede introducir ChRH2 y NpHR en neuronas incorporando los genes que las codifican al genoma de virus inocuos. Luego se inyectan los virus en el cerebro, infectan a las neuronas y comienzan a expresarse las protenas, que estn insertadas en la membrana de la clula. Los genes se pueden modificar de manera que las protenas se expresen solo en tipos especficos de neuronas. As, se puede observar los efectos de activar o desactivar tipos especficos de neuronas en una regin concreta del encfalo. Como ChR2 y la NpHR son activadas por la luz, es necesario que la luz penetre en el cerebro. Si las neuronas que expresan estas protenas fotosensibles se localizan en la corteza cerebral, se puede taladrar un pequeo orificio en el crneo y adherir sobre l diodos emisores de luz (DEL). Para activar las protenas fotosensibles en las membranas de neuronas situadas profundamente en el encfalo, se pueden implantar fibras pticas mediante ciruga estereotxica, como si fueran electrodos o cnulas, y la luz se transmite mediante dichas fibras.
Pueden insertarse protenas fotosensibles en membranas neurales mediante virus con modificacin gentica. (a) la luz azul hace que los canals inicos ChR2 despolaricen la membrana y la luz amarilla que los transportadores NpHR la hiperpolaricen. (b) efectos de diferentes longitudes de onda de luz sobre el potencial de membrana al actuar sobre las protenas ChR2 o NpHR. (c) Los pulsos de luz azul (flechas azules) produjeron potenciales de accin; los de luz amarilla, los efectos inhibidores de la hiperpolarizacin.
Actualmente se estudia el posible uso clnico de las protenas fotosensibles. Bi y su equipo utilizaron un virus para insertar genes de ChR2 en las clulas ganglionares de la retina de una cepa de ratones ciegos cuya retina careca de fotorreceptores. Las clulas ganglionares de la retina son neuronas que reciben informacin de los fotorreceptores y transmiten esta informacin por el nervio ptico a los circuitos cerebrales implicados en la visin. Bi encontr que las clulas ganglionares se hacan sensibles a la luz: al estimular la retina con un destello de luz azul se registraban potenciales elctricos en la corteza visual; la retina contiene muchos circuitos neurales que analizan la informacin procedente de los fotorreceptores antes de que sta se enve a travs del nervio ptico a otras partes del cerebro, de modo que el simple hecho de hacer sensibles a la luz a las clulas ganglionares no garantiza que la ceguera causada por la falta de fotorreceptores restaure el diseo de la visin. Sin embargo, administrar selectivamente ChR2 y NpHR a tipos especficos de neuronas de la retina puede llevar finalmente al desarrollo de medios para tratar algunos tipos de ceguera. Otros posibles usos clnicos de las protenas fotosensibles estn relacionados con el tratamiento de enfermedades neurolgicas como el Parkinson.
3. MTODOS NEUROQUMICOS
A veces, en vez de la actividad metablica de una regin del encfalo, nos interesa la localizacin de neuronas que tengan un tipo especfico de receptores o que produzcan un tipo especfico de neurotransmisores o neuromoduladores; o podramos querer estimar la cantidad de sustancias qumicas que segregan las neuronas de una regin determinada del encfalo en determinadas circunstancias. Pues bien, los mtodos neuroqumicos pueden utilizarse para determinar la localizacin de una enorme variedad de sustancias qumicas en el encfalo. Con ellos se pueden identificar las neuronas que segregan un neurotransmisor o un neuromodulador determinado y aquellas que tienen receptores que responden a la presencia de estas sustancias.
La frmula (estructura qumica) de la protena est codificada en trminos de una secuencia especfica de bases de nucletidos que componen el ARN mensajero. En la mayora de los casos se conoce este cdigo, as que se puede sintetizar un segmento de ARN radioactivo que contiene una secuencia de nucletidos complementaria de la secuencia del ARNm. Las secciones de tejido cerebral se exponen al ARN radioactivo, que se adhiere a las molculas del ARNm apropiado. Despus se utiliza la autorradiografa para poder ver donde se localiza el ARNm y, por deduccin, la de las clulas que producen la protena cuya sntesis inicia el ARN. Como hemos visto, los pptidos y las protenas pueden localizarse directamente, mediante mtodos inmunocitoqumicos: se expone un tejido a un Ac que est unido a una molcula que se hace fluorescente bajo una luz de una determinada longitud de onda. Tambin puede detectarse otras sustancias mediante localizacin inmunocitoqumica de una enzima que se requiere para su sntesis. As mismo, los pptidos y las protenas pueden localizarse por medio del mtodo de hibridacin in situ, el cual revela la presencia de ARN mensajero que dirige su sntesis.
Podemos aplicar el mtodo de localizacin de receptores en el ejemplo que vimos antes: funcin del HVM en la conducta sexual de las ratas hembra. Las lesiones o extirpacin del HVM abolen esta conducta; pero puede activarse estimulando el HVM elctricamente o con Aa excitadores. Esto sugiere que las hormonas sexuales producidas por los ovarios actan sobre las neuronas del HVM. Podramos hacer dos experimentos: Inyectar una pequea cantidad de hormona sexual adecuada en el HVM de ratas hembra cuyos ovarios se han extirpado. Resultado: la hormona reactiva la conducta sexual del animal. Utilizar la autorradiografa para localizar los receptores de la hormona sexual. Para ello se expondran secciones del encfalo de la rata a la hormona radioactiva. Se enjuagaran y se efectuara la autorradiografa. Resultado: encontraramos radioactividad en el HVM. Si se comparan las secciones cerebrales de las ratas macho y hembra, se observa un mayor nmero de receptores hormonales en las hembras. Tambin se podra recurrir a la inmunocitoqumica para localizar los receptores de las hormonas, obteniendo los mismos resultados.
Es un mtodo tan sensible que puede detectar neurotransmisores (y sus productos de degradacin) que han sido liberados por los botones terminales y desde el espacio sinptico se han dispersado en el resto del lquido extracelular. La cantidad de dopamina en el lquido extracelular del ncleo accumbens (en el prosencfalo basal), aumenta al inyectar cocana a la rata; y tambin cuando se inyecta cualquier droga adictiva, e incluso cuando el animal realiza una actividad placentera como comer, beber, tener relaciones sexuales. Todo esto indica que la liberacin de dopamina en el ncleo accumbens juega un papel en el refuerzo. En casos excepcionales (determinacin de sustancias qumicas en el cerebro de personas con una hemorragia cerebral o traumatismo craneoenceflico) se ha utilizado la microdilisis en humanos, pero no con fines de investigacin. Se puede emplear una exploracin con TEP para llevar a cabo observaciones similares en el cerebro humano: se inyecta al sujeto un marcador radioactivo, tal como una droga que se une con un receptor determinado o una sustancia qumica que se incorpora a un neurotransmisor determinado, y posteriormente una exploracin TEP revela la localizacin del marcador en el cerebro. El equipo de TEP, se utiliza para localizar cualquier sustancia radioactiva que emita positrones. Es caro, pero es un medio no lesivo de estudiar sustancias neuroqumicas en cerebros humanos (leer el caso del inicio del tema).
4. MTODOS GENTICOS OK
Toda conducta est determinada por interacciones entre el cerebro y el entorno. Muchas caractersticas comportamentales (talento, variables de personalidad, trastornos mentales) parecen venir de familia, sugiriendo que el factor gentico puede ser importante en el desarrollo de diferencias fisiolgicas que, en ltima instancia son responsables de dichas caractersticas. A veces, la relacin gentica es clara (un gen defectuoso interfiere en el desarrollo cerebral, y una anomala neurolgica provoca alteraciones comportamentales), en otros casos, la relacin entre herencia y conducta es ms sutil, y para evidenciarla han de emplearse mtodos genticos especiales. Dado que los genes dirigen el desarrollo de un organismo, los mtodos genticos son tiles en los estudios de la fisiologa de la conducta.
Si los nios se parecen a sus padres adoptivos, se concluye que el rasgo est influido por factores ambientales. Si hay semejanzas con los dos, probablemente el rasgo estar influenciado tanto gentica como ambientalmente.
MUTACIONES DIRIGIDAS
Consisten en la alteracin de un gen gen Knockout (gen suprimido) en el laboratorio y su insercin en los cromosomas de un ratn. Estos genes mutados son defectuosos (no pueden producir una protena que sea funcional). Las mutaciones dirigidas permiten a los neurocientficos estudiar los efectos de la falta de una protena concreta (ej, una enzima, o una protena estructural o un receptor) sobre las caractersticas fisiolgicas y comportamentales de un animal. En ocasiones el objetivo de la mutacin es una enzima que controla una reaccin qumica especfica (ej, la falta de una enzima determinada interfiere en el aprendizaje, lo que sugiere que la enzima es, en parte, responsable de los cambios en la estructura de sinapsis necesarios para el aprendizaje. En otros casos el objetivo de la mutacin es una protena que por s sola desempea una importante funcin en la clula (ej, un tipo concreto de receptor para los opioides interviene en los efectos reforzantes y analgsicos de estos). Los investigadores pueden incluso producir knockouts condicionales que provocan que los genes del animal dejen de expresar un determinado gen cuando se le suministra una determinada droga, lo que permite que el gen objetivo o sobre el que se acta se exprese normalmente durante el desarrollo del animal y posteriormente sea suprimido. Los investigadores pueden asimismo valerse de mtodos de ingeniera gentica para insertar genes en el ADN del ratn, genes que pueden dar lugar a un aumento de la produccin de protenas que se encuentran normalmente en la especie husped o pueden producir protenas completamente nuevas.
OLIGONUCLETIDOS ANTISENTIDO
Otro mtodo gentico implica la produccin de molculas que bloquean la produccin de protenas codificadas por determinados genes mediante la inyeccin de oligonucletidos antisentido (o de hebra complementaria). El tipo ms frecuente de oligonucletidos antisentido son cadenas modificadas de ADN o de ARN que se unirn con molculas especficas de ARN mensajero e impiden que produzcan su protena. Una vez bloqueadas las molculas de ARNm, son destruidas por enzimas que hay en la clula. El trmino antisentido se refiere a que los oligonucletidos sintticos contienen una secuencia de bases complementarias a las que contiene un gen determinado o molcula de ARNm (este mtodo se parece al utilizado en la hibridacin in situ).
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