UNIVERSIDAD MICHOACANA

DE
SAN NICOLS DE HIDALGO


FACULTAD DE AGROBIOLOGA

PRESIDENTE JUREZ



Control qumico in vitro de hongos contaminantes de nardo
(Polianthes tuberosa L.)


T E S I S

Como requisito parcial para obtener el ttulo de:


INGENIERO AGRNOMO


Con especialidad en:
PARASITOLOGA


Presenta:

OFMARA YADIRA MARTNEZ MONTAO



PROYECTO PIFI 2008-16MSU0014T-03



Uruapan, Michoacn Octobre del 2009



Firmado digitalmente por
AUTOMATIZACION
Nombre de reconocimiento (DN):
cn=AUTOMATIZACION, o=UMSNH,
ou=DGB, email=soporte@biblioteca.
dgb.umich.mx, c=MX
Fecha: 2010.01.28 08:29:13 -06'00'



DEDICATORIA

A mi esposo Javier
Por su apoyo y comprensin para la realizacin de este trabajo. Por ser mi cmplice
silencioso, por compartir conmigo angustias y satisfacciones, alegras y tristezas, por
compartir conmigo la vida mismaTE AMO.
A mis hijos Hctor y Valeria
Por ser la razn de mi existir, las personas ms importantes en mi vida. Toda mi
lucha, mi trabajo y mi esfuerzo es por ustedes que son mis tesoros. El regalo ms
grande y hermoso que me pudo dar Dios, ustedes son el amor de mis amoresMi
ms grande razn de vida.
A mi madre Socorro
Por todo el amor que me ha dado, por tener una fortaleza de acero y saber como
enfrentar las adversidades Te quiero mucho
A mis hermanas Irian y Any
Por su cario y apoyo incondicional. Por que siempre estemos unidas como hasta
ahora.
A mis sobrinos Kaeri, Ireri y Derek por ser parte de la alegra de nuestra familia
A mi ta Delia
Por ser una de las personas ms importantes en mi vida familiar y acadmica, por su
cario y comprensin. Por motivarme en la elaboracin de este trabajo. Mil gracias.
A mi ta Irma
Por ayudarme a escalar un peldao mas en mi vida profesional.



AGRADECIMIENTOS

A Dios y a mi Santa por darme la vida y por que siempre estn ah cuando yo mas los
he necesitado.
A la Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo y a la Facultad de
Agrobiologa Presidente Ju{rez por ser el umbral de mi formacin profesional.
Con admiracin a la Doctora Martha Elena Pedraza Santos por haber confiado en mi
para la elaboracin de este proyecto y por ser una excelente persona.
Con respeto al Doctor J. Luciano Morales Garca por sus valiossimas aportaciones en
el desarrollo y la elaboracin del presente trabajo.
A la M.C. Yurixhi Atenea Raya Montao por su dedicacin, colaboracin y paciencia
para la realizacin de este proyecto.Te estar eternamente agradecida.
A la Ing. Teresita del Carmen vila Val por se una excelente amiga y una gran
persona, por sus brillantes aportaciones para el desarrollo de este trabajo. Muchas
gracias.
A mis sinodales Ing. Romn Negrete Garca e Ing. Romn Negrete Nolasco por sus
excelentes contribuciones al presente trabajo.
Con cario y una profunda admiracin al Doctor Alfredo Raya Montao por su
apoyo para que este trabajo se plasmara y fuera una realidad.
A mis amigos Ulises y Gustavo Prez Santos por su apoyo incondicional.
A todos los compaeros del laboratorio de cultivos de tejidos especialmente al Ing.
Adn Estrada Basaldua por su apoyo para la realizacin de este trabajo.
Al Profesor Fernando Verdn Lpez por ser la primera persona que confo en mi en el
{rea de la docencia: a todo lo que realicemos hay que ponerle empeo. Sus
palabras.



CONTENIDO
Pg.
NDICE DE CUADROS...... i
NDICE DE FIGURAS........
NDICE DE CUADROS DEL APNDICE
RESUMEN
ii
iii
vi
I. INTRODUCCIN. 1
II. REVISIN DE LITERATURA... 4
2.1 Caractersticas generales de Polianthes tuberosa L.. 4
2.1.1 Origen. 4
2.1.2 Taxonoma y morfologa.. 5
2.2 Requerimientos ambientales.. 6
2.3 Sistemas de cultivo del nardo........ 7
2.3.1 Sistema de cultivo para la produccin de tubrculo 7
2.3.2 Sistema de cultivo para produccin de flor de corte... 7
2.3.3 Sistema de cultivo in vitro 8
2.4 Contaminantes del cultivo in vitro.. 10
2.5 Antecedentes de los patgenos que atacan al nardo....... 14
2.6 Caractersticas de Fusarium sp. 15
2.6.1 Clasificacin taxonmica y morfologa de Fusarium sp. 17
2.7 Caractersticas de Rhizopus sp........ 18
2.7.1 Clasificacin taxonmica y morfologa de Rhizopus sp. 20


III. MATERIALES Y MTODOS

22
3.1 Localizacin del experimento.....
3.2 Material vegetal
22
22
3.3 Establecimiento asptico para el cultivo in vitro de nardo.... 22
3.4 Medio de cultivo para el desarrollo de hongos.... 23
3.5 Identificacin de los agentes causales. 24
3.6 Bioensayos con fungicidas bajo condiciones in vitro para el control de
los agentes contaminantes durante la micropropagacin del nardo..

25
IV. RESULTADOS Y DISCUCIN... 27
4.1 Identificacin de los agentes causales de la contaminacin de cultivo in
vitro del nardo.

27
4.2 Efecto de fungicidas para el control de Fusarium sp. bajo condiciones in
vitro

29
4.3 Efecto de fungicidas para el control de Rhizopus sp. bajo condiciones in
vitro

32
4.4 Efecto del tipo de accin de los fungicidas para el control de Fusarium
sp. bajo condiciones in vitro.

34
4.5 Efecto del tipo de accin de los fungicidas para el control de Rhizopus
sp. bajo condiciones in vitro.

35
V. CONCLUSIONES.......... 37
VI. LITERATURA CITADA. 38
VII. APNDICE 47

i
NDICE DE CUADROS
Cuadro Pg.
1 Solucin nutritiva Steiner 50 % para la nutricin de plantas de
nardo. 23
2 Fungicidas e ingredientes activos utilizados para el control de
Fusarium sp. y Rhizopus sp. aislados de cultivo in vitro de nardo 26
3 Descripcin de micelio de hongos contaminantes de cultivos in
vitro de nardo en cada tratamiento.. 27
4 Efecto del tipo de fungicida sobre el control de desarrollo in vitro
de Fusarium sp 30
5 Efecto del tipo de fungicida sobre el control de desarrollo in vitro
de Rhizopus sp 34
6 Accin del tipo defungicida sobre el control de desarrollo in vitro
de Fusarium sp 33
7 Accin del tipo de fungicida sobre el control de desarrollo in vitro
de Rhizopus sp 35









ii
NDICE DE FIGURAS
Figura Pg.
1 Transferencia de los agentes causales de la contaminacin del
cultivo in vitro de nardo en las caja Petri con medio PDA ya
solidificado 24
2 Bioensayo de control (A) Preparacin de los discos de papel filtro
con fungicidas (B) Cajas con medio PDA y discos de agar
provenientes de colonias puras y fungicidas. 25
3 Aspecto de los diferentes fungicidas utilizados en el control de
Fusarium sp. Y Rhizopus sp... 26
4 Desarrollo de la colonia y estructuras del hongo Fusarium sp. bajo
condiciones in vitro a los 8 das de establecido el experimento (A)
Cepa pura de Fusarium sp. (B) Microconidios dispuestos en falsas
cabezas. (C) Esporodoquio con macroconidios. (D y E)
Clamidiosporas 28
5 Desarrollo de la colonia y estructuras del hongo Rhizopus sp. bajo
condiciones in vitro... 29
6 Inhibicin del crecimiento de colonias de Fusarium sp. por
fungicidas sistmicos y de contacto.. 31
7 Inhibicin del crecimiento de colonias de Rhizopus sp. por
fungicidas sistmicos y de contacto 33




iii
NDICE DE CUADROS DEL APNDICE
Cuadro Pg.
1A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al segundo da de
establecido el experimento 47
2A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al tercer da de establecido
el experimento. 47
3A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al cuarto da de establecido
el experimento. 47
4A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al quinto da de establecido
el experimento. 48
5A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al sexto da de establecido
el experimento. 48
6A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al sptimo da de
establecido el experimento 48
7A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al octavo da de establecido
el experimento. 49

iv
8A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al noveno da de establecido
el experimento. 49
9A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al segundo da de
establecido el experimento 49
10A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento de Rhizopus sp. al tercer da de establecido el
experimento. 50
11A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento de Rhizopus sp. al cuarto da de establecido el
experimento. 50
12A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento de Rhizopus sp. al quinto da de establecido el
experimento. 50
13A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento de Rhizopus sp. al sexto da de establecido el
experimento. 51
14A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento de Rhizopus sp. al sptimo da de establecido el
experimento. 51
15A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento de Rhizopus sp. al octavo da de establecido el



v
experimento. 51
16A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicidas sobre el
crecimiento de Rhizopus sp. al noveno da de establecido el
experimento. 52






































vi
RESUMEN


Durante el establecimiento in vitro de yemas del cormo del nardo (Polianthes
tuberosa L.) hongos y bacterias, causan la muerte del explante; por esto es
necesaria la identificacin de los microorganismos contaminantes y proponer
procedimientos eficientes de desinfeccin superficial y endgena para su eliminacin.

Se tomaron yemas del cormo de bulbos de nardo para colocarlos con 20 gotas
de microdyn

por 5 minutos, en solucin de Tecto

60 % (0.6 gL
-1
), durante 30
minutos y por ltimo en hipoclorito de sodio 6 % ingrediente activo por 20 minutos.
Las yemas que sembraron en medio de Murashige y Skoog (1962). A los dos das
del establecimiento se detect la presencia de hongos contaminando las yemas que
posteriormente causaron su muerte. Se tomaron muestras de micelio y se colocaron
en medio PDA se incubaron y se obtuvieron colonias fungosas, se purificaron e
identificaron.

Como agentes causales de la contaminacin in vitro de nardo se identificaron
a Fusarium sp. y Rhizopus sp. Es posiblemente que estos hongos estn localizados
dentro de las yemas del cormo del bulbo del nardo, lo que dificulta la accin de los
desinfestantes superficiales empleados. En la prueba de bioensayos para Fusarium
sp. se demostr que Tecto 60

, inhibi por completo el desarrollo in vitro de del

hongo desde el segundo da de establecido el experimento; mientras que para el
hongo Rhizopus sp. los fungicidas que resultaron mejor fueron Swicht

y Tecto 60

a
partir del tercer y cuarto da respectivamente.

1
I. INTRODUCCIN

El nardo (Polianthes tuberosa L.), es muy importante en el mercado mexicano
por su uso tradicional como flor de corte, principalmente en el mes de noviembre (da
de muertos); pero adems como planta ornamental y para jardn debido a su
agradable aroma, lo que ha permitido la posibilidad de exportar principalmente a
Estados Unidos y Europa; otro uso importante es la extraccin de aceites esenciales
y en la perfumera, por lo que se espera un aumento en la demanda de esta especie
(Gonzlez, 2000).

El gnero Polianthes no tiene gran variabilidad natural de especies, y slo
existen plantas con flores de colores claros, principalmente blancos o casi blancos
con flores pequeas (Escalante, 2003). Por lo que el cultivo in vitro constituye una
herramienta fundamental para lograr incrementar y extender la poblacin natural de
las especies, ya que esta tcnica puede reemplazar otros mtodos de propagacin
vegetativa, al competir en costos, eficiencia y capital de inversin (Preece, 2003). Sin
embargo, la micropropagacin presenta una serie de problemas, entre los cuales se
encuentra la contaminacin de los explantes por microorganismos.

En el establecimiento in vitro de explantes de nardo, la contaminacin por
hongos es uno de los principales factores que afectan considerablemente su
crecimiento e impide cumplir con uno de los requisitos bsicos para el xito de la
micropropagacin de cualquier especie, el de mantener los cultivos libres de
contaminantes. Para contrarrestar esto es de suma importancia aislar e identificar los

2
hongos que surgen durante el establecimiento, para mantener los cultivos libres de
microorganismos (Roca y Mroginski, 1991).
Con base en lo anterior, en la presente investigacin se consideraron los
siguientes objetivos:

Objetivo general

1. Desarrollar un sistema eficiente para la identificacin y control de hongos que se
desarrollan en el establecimiento del cultivo in vitro del nardo.

Objetivos particulares

1. Aislar, purificar e identificar los hongos que se desarrollan durante el
establecimiento in vitro del nardo.

2. Evaluar diferentes fungicidas in vitro mediante bioensayos para el control qumico
de los patgenos.

3. Determinar el efecto del modo de accin de los fungicidas sobre el control de los
patgenos





3
1.2 Hiptesis

1. Los agentes causales de la contaminacin de nardo en el cultivo in vitro son
principalmente hongos.

2. Mediante bioensayos es posible determinar la efectividad de los fungicidas para el
control in vitro de los patgenos.


















4
II. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Caractersticas generales de (Polianthes tuberosa L.)
2.1.1 Origen
En la cultura y tradicin mexicana las flores siempre han estado presentes en
las expresiones religiosas y en actividades sociales; desde los tiempos de la
conquista y en los mercados indgenas segn describe Corts, llegaban los indios
con sus atados o manojos de flores de diversas especies y colores a venderlas
(Quintanar, 1970). En Mxico las condiciones climticas permiten cultivar flores para
ornato y uso cosmtico ya que representa una actividad econmica muy importante
para las familias mexicanas, 11,424 hectreas son cultivadas para la produccin de
flores y follajes de corte (Garca,et. al; 2007).

Esta especie se considera procedente del Centro VII de origen de las plantas
cultivadas, denominado Centro Suramericano y Centroamericano, que comprende
parte del sur de Mxico, Guatemala, Honduras y Costa Rica. En territorio mexicano
existen las especies Polianthes desinflora, Polianthes howardii, Polianthes longiflora,
Polianthes palustres y Polianthes platyphyla consideradas como especies endmicas
enlistadas en la Norma Oficial Mexicana (NOM-ECOL-059-2001), por ser especies
en peligro de extincin. Segn Gonzatti (1981), (Polianthes tuberosa L.), no se ubica
en dicha categora y se considera que procede de Polianthes gracilis (mexicana) o de
otra especie del mismo origen.



5
2.1.2 Taxonoma y morfologa
De acuerdo con Cronquist (1982) el nardo se clasifica de la siguiente manera:
Reino: Plantae
Divisin: Magnoliophyta
Clase: Liliopsida
Orden: Asparagales
Familia: Agavaceae
Gnero: Polianthes
Especie: tuberosa L.

En su tratado Historia de las plantas de Nueva Espaa, el mdico naturista
Dr. Francisco Hernndez describi, en 1537, dos especies bajo el nombre indio de
Acacoyotl como plantas con rizoma tuberoso, hojas desde lineales hasta lanceoladas
alargadas, inflorescencias con racimos sencillos con flores en cada axila, cigomorfas,
tubo perigoneal ensanchado hacia el pice, estambres mas cortos que el perigonio
con filamentos filiformes (Gonzlez, 2000).

El nardo (P. tuberosa), es una planta herbcea perenne, de hojas verdes,
largas, delgadas, algo carnosas y con bastante brillo, que se encuentran reunidas en
la base de los tallos florales. Las flores blancas con ligeros tonos rosados, suelen
ocupar ms de un tercio del tallo y estn distribuidas en numerosas parejas que
forman espiga. Esta especie no ha sido suficientemente investigada para elevar su
calidad (Herrera, 1990).


6
Las hojas del nardo son basales, aproximadamente 50 cm de largo, lineales,
verdes, curvadas hacia fuera, alternas, originadas de un tallo acaule en forma
arrosetada que disminuyen en su tamao a medida que su posicin asciende en el
tallo floral (Norman, 1957).

El fruto est constituido por una cpsula de aspecto membranoso, de 2.5 a 3
cm de longitud, trilobulada que contiene un corto nmero de semillas coriceas de
color negro y unos 0.5 mm de dimetro (Pathak et al., 1980).

El nardo es fcil de cultivar y sus flores se utilizan para la confeccin de los
mas variados y delicados arreglos; unidos a su fragancia y a las posibilidades de
utilizacin del tubrculo en la obtencin de la materia prima para aplicacin
farmacolgica, se ofrece a travs de esta planta perspectivas sobresalientes en el
desarrollo de la floricultura (Trueblood, 1973).

2.2 Requerimientos ambientales
El nardo es una especie rstica que se produce principalmente en los climas
tropicales y subtropicales, sus requerimientos estn determinados lgicamente por
las caractersticas de sus reas de origen, cuyos factores ms significativos fluctan
de los 21 a 27 C, con una alta humedad relativa, abundante precipitacin y franca
exposicin al sol (Gonzlez y Prez, 1992).

El nardo requiere para su ptimo desarrollo y produccin, suelo de textura
media (franco) o ligeramente pesados (franco-arcillosos), buen drenaje, con pH de

7
neutro a ligeramente alcalino de (6 a 8) con un alto nivel de fertilidad y abundante
materia orgnica (Quintanar, 1970).

En Mxico se cultivan principalmente para arreglos florales. Los principales
estados productores de nardo son Guerrero, Estado de Mxico, Morelos, Puebla y
Veracruz.

2.3 Sistemas de cultivo del nardo
2.3.1 Sistema de cultivo para la produccin de tubrculo
El nardo se propaga a travs de tubrculos que producen brotes a partir de las
yemas situadas en la base de estas estructuras caulinares (Shillo, 1992). El tubrculo
de plantacin debe cumplir con las siguientes condiciones para ser seleccionados
para su siembra: uniformidad, adems que hayan sido cosechados, manipulados y
conservados adecuadamente, en perfecto estado fitosanitario y que no estn en
brotacin o germinacin (Licona, 1995).

2.3.2 Sistema de cultivo para produccin de flor de corte
El nardo es una planta que se puede considerar perenne o semiperenne, pero
con la finalidad de obtener flor de corte de buena calidad. En el estado de Morelos,
se explota por un periodo de 12 a 18 meses y se corta hasta el cuarto o quinto brote
(Uribe, 2002).




8
2.3.3 Sistema de cultivo in vitro
La sobrevivencia y crecimiento de tejidos establecidos in vitro es afectada por
factores como el explante, el medio de cultivo, las condiciones de incubacin, entre
otras. Un explante es un fragmento extrado de la planta donadora, que pueden ser
pices de hojas, tallos, raz y semillas con el propsito de cultivarlo bajo condiciones
aspticas en medio de cultivo; cuando ms pequeo sea el explante menor es la
probabilidad de contaminacin, aunque existen menores posibilidades de desarrollo.
Para que un explante pueda sobrevivir y desarrollarse en condiciones in vitro sin
problemas debe tener disponible al menos nutrientes esenciales y una fuente de
energa (Murashige, 1974; Street, 1977). Adems todo este proceso implica
condiciones de esterilidad, tanto de los frascos como del medio y del lugar donde se
llevar a cabo. Estos frascos se deben tener a ciertas condiciones de luz y
temperatura para el buen desarrollo de las plntulas, y una vez desarrolladas, stas
se pasan a macetas con el sustrato adecuado (Tllez, 2005).

El cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales es una herramienta de la
biotecnologa de la que Mxico y otros pases del tercer mundo podran obtener
grandes beneficios a corto y largo plazo, entre ellas podemos mencionar: duplicacin
de la variabilidad gentica, rescate de especies y alta productibilidad (Hernndez,
1993).

Se han evaluado varias tcnicas de propagacin asexual con algunos
resultados satisfactorios (Antoni, 1977), sin embargo, el cultivo in vitro se presenta
como una alternativa en la propagacin asexual y recuperacin de germoplasma de

9
plantas de nardo, para el mejoramiento de caractersticas agronmicas deseadas,
as como tambin en un futuro no lejano, forme parte integral de los mtodos
convencionales de propagacin asexual (Pardos, 1984).

La morfognesis en el cultivo in vitro puede seguir dos rutas distintas: la
embriognesis somtica y la organognesis. La determinacin de las clulas
depende de la propia naturaleza del tejido, de su estado vegetativo y del tratamiento
que ha recibido. Tisserat (1985), menciona que adems de la organognesis y
embriognesis somtica existe una tercera forma de propagacin in vitro que es el
cultivo de embriones, el cual consiste en separar el embrin de la semilla, y colocarlo
en un ambiente sustituto del endospermo, como el medio de cultivo. En las dos
primeras rutas, siempre es posible distinguir dos modelos de desarrollo morfognico
(Gil y Murillo, 2002)

El cultivo in vitro de nardo se ha logrado por algunos investigadores con
diferentes objetivos. Segn Sangavai y Chellapandi (2003), las plantas tuberosas
tienen limitaciones para crecer en cautiverio en pases clidos como la India, as que
se han cultivado in vitro estas plantas. En este trabajo se probaron reguladores de
crecimiento. Utilizando el rizoma como explante y medios MS slido con diferentes
concentraciones de indol- 3- cido actico (IAA) y 6 benzylaminopurine (BAP). La
presencia de BAP mostr alta regeneracin de explantes y diferenciacin de
frecuencia de brotes (2.2 +- 1.2 brotes/explante), produciendo alrededor de 3 dobles.
Despus de regenerar la tuberosa a travs de cultivo de tejido, las hojas de la misma
planta fueron usadas para el anlisis qumico de plantas cualitativamente, sugiriendo

10
que el metabolismo fue mejorado en alguna medida, los resultados mostraron que
una proporcin apropiada de BAP y IAA es til para la regeneracin y cultivo de esta
planta en cautiverio en pequea escala.

En clulas de Polianthes tuberosa fueron estudiados los efectos de los
componentes del medio en la produccin de polisacridos (EPS) extracelular,
encontrndose que la optimizacin de componentes del medio, cultivndose los
explantes en frascos result en el incremento de la produccin de EPS de 1.4 a 4.1
g/L relativamente con una alta concentracin de 2,4- cido diclorofenoxiactico,
estimul la produccin polisacridos. Basado en estos resultados la taza final de esta
produccin fue de 4.6 g/L. El polisacrido consisti bsicamente en polisacridos
cidos con cido glucornico, manosa, arabinosa, galactosa, glucosa y xilosa (Otsuji
et al., 1994).

2.4. Contaminantes del cultivo in vitro
La contaminacin microbiana es un problema constante que compromete el
desarrollo de todas las tcnicas in vitro. Las prdidas causadas por microorganismos
contaminantes principalmente hongos y bacterias constituye un serio problema a
escala mundial en los numerosos laboratorios. Estos estn comnmente en las
plantas ex vitro pero pueden provocar efectos devastadores en las plantas en
condiciones in vitro. Tal problemtica constituye uno de los principales obstculos
para el uso comercial de la tcnica (Skirvin et al.,1999).


11
En el establecimiento in vitro de los tejidos pueden introducirse
microorganismos patgenos (Cassells, 1991), por ejemplo en el establecimiento in
vitro del guayabo, la presencia de microorganismos contaminantes, hongos y
bacterias, es uno de los principales problemas que limitan la posibilidad de obtener
explantes aspticos (Viloria, 1993).

Como contaminantes in vitro de plantas se han aislado especies de bacterias
pertenecientes a los gneros Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Mycobacterium,
Pseudomonas, Enterobacter, Acinetobacter, Xanthomonas, Lactobacillus, Erwinia,
Agrobacterium, Corynebacterium, Methylobacterium, entre otros (Leifert et al., 1989,
George, 1993).

En el estudio realizado por Ramrez y Santos (2000), encontraron que los
principales hongos contaminantes en el establecimiento in vitro pertenecen a los
gneros Alternaria, Aspergillius, Clamidosporium, Curvularia, Drechslera, Fusarium,
Helminthosporium y Rhizopus, estos resultados son anlogos a los encontrados por
(Giladi et al., (1979), en Citrus sinensis quien seala que los hongos Aspergillus sp. y
Cladosporium sp. son los responsables de la contaminacin para su establecimiento.

En mango se han aislado a los hongos Fusarium sp., Botryodiplodia sp.,
Alternaria sp. y Aspergillius sp., como los causantes de la contaminacin durante el
establecimiento in vitro de pices de mango como hongos contaminantes (Borges et
al., 1997).


12
Los explantes pueden llevar contaminantes en su superficie o en su interior.
Los microorganismos que lleva el explante sobre su superficie se pueden eliminar
mediante la desinfeccin superficial, pero los que se encuentran dentro del tejido son
difciles de eliminar.

Todos los desinfectantes superficiales permiten remover en igual forma los
hongos y las bacterias exgenas en el explante. En cambio para la eliminacin de los
contaminantes endgenos se puede necesitar la inclusin de fungistticos o
antibiticos en el medio y de otras tcnicas que permitan disminuir su presencia
(Roca y Mroginski, 1991).

El xito de los antibiticos depende de su aplicacin en el medio de cultivo
que varia segn los criterios, mtodos de apreciacin, microorganismos, etc. y
depende en gran medida del desarrollo de un buen protocolo Cassells (1991). As
por ejemplo se plante que los antibiticos no sustituyen las tcnicas de asepsia y
deben ser empleados slo cuando stas son inadecuadas y preferentemente como
tratamiento profilctico ms que para tratamiento de la infeccin (Falkiner, 1990).

Para que un compuesto antimicrobiano pueda ser usado en el medio de
cultivo debe cumplir las siguientes condiciones: ser soluble, estable, no afectar el pH,
no afectar el medio de cultivo, mnimos efectos secundario (no fitotxico), amplio
espectro, ser bactericida, debe poder ser usado sistemticamente y en combinacin
con otras sustancias antimicrobianas, tener un modo de accin que no permita a la

13
bacteria desarrollar resistencia y preferiblemente no ser utilizados en medicina clnica
(Falkiner, 1990).

Han manifestado el criterio de que el empleo de antibiticos solamente se
justifica en casos de excepcin y en cultivos de corta duracin, ya que la alta
especificidad de los mismos implica que no previenen la proliferacin de todos los
microorganismos. Adems, tales productos modifican la composicin de los medios
de cultivos y pueden ser metabolizados por los explantes (Roca y Mroginski, 1993).

En la poca seca lograron retardar la presencia de los contaminantes durante
el establecimiento in vitro de pices de mango de cv. Haden, al agregar fungicidas y
antibiticos en el medio de cultivo (Borges et al., 1997).

Las irregularidades que se presentan en la superficie del explante pueden
servir de depsito de los contaminantes como el polvo, bacterias, esporas de hongos
y otros, los cuales afectaran el xito de la desinfeccin superficial si los productos no
logran llegar y desinfectar esas reas microscpicas (Roca y Mroginski, 1991).

Para el control de la contaminacin de hongos y bacterias en la
micropropagacin a escala comercial de cualquier especie se requiere un anlisis de
la incidencia de los contaminantes y disear estrategias que no encarezcan el
proceso e impliquen un incremento en gastos de tiempo y recursos (Leifert et al.,
1991).


14
Por otra parte, estudiaron la composicin de las comunidades bacterianas que
crecan sobre plantas in vitro de Delphinium y Hemerocallis y llegaron a la conclusin
de que podan variar considerablemente entre diferentes especies de plantas. Esto
usualmente se atribuye a que especies de bacterias especficas de plantas han sido
introducidas en el cultivo in vitro con el material vegetal (George y Sherrintong, 1984,
Cornu y Michel, 1987).

2.5 Antecedentes de los patgenos que atacan al nardo
Para determinar la poblacin de microorganismos asociados con las races y
rizsfera de las plantas de nardos, se colectaron plantas en produccin en fincas
ubicadas en la localidad de Aroa, Estado Yaracuy, Venezuela. Para el aislamiento de
los microorganismos se utiliz la tcnica de los platos de dilucin (Salazar et al.,
2006).

Las colonias desarrolladas se cuantificaron y transfirieron a placas con Papa
Dextrosa Agar (PDA). Asociado con las races se identificaron los hongos:
Aspergillus sp. muy numerosos, Penicillium sp., Pythium sp., Curvularia sp.,
Sclerotium rolfsii y Fusarium solani. En relacin con la micoflora de la rizsfera se
identificaron los gneros sealados anteriormente adems de Cladosporium sp. y
Mucor sp. La diversidad encontrada pone en evidencia la facilidad de dispersar
patgenos a zonas distantes mediante el traslado de material vegetal (Salazar et al.,
2006).


15
En cuanto a los gneros de hongos ms importantes asociados a las races de
las plantas de nardo se encuentran Aspergillus, Penicillium, Rhizopus y Trichoderma.
El Aspergillus y el Penicillium movilizan el fsforo y el nitrgeno del suelo. El
Trichoderma sostiene la humedad en las races en condiciones de sequa (Delgado,
2004).

2.6 Caractersticas de Fusarium sp.
Las especies de Fusarium estn ampliamente distribuidas en los suelos y
sustratos orgnicos, por ejemplo, han sido aislados desde el permafrost en el rtico
hasta las arenas del Sahara. Abunda en suelos cultivados de zonas templadas y
tropicales y es el hongo mas frecuentemente aislado por los fitopatlogos (Booth,
1971).

Este gnero comprende muchas especies y formas que se diferencian por la
forma, color y nmero de septas de los micro y macroconidios, presencia o ausencia
de clamidosporas, coloracin del crecimiento en el medio de cultivo. Todas estas
especies son saprfitas en algunas de sus fases, algunas especies causan pudricin
de rganos, marchitamientos, pudriciones basales, dampig off y cnceres en tallos
(Mendoza y Pinto, 1983).

Las enfermedades causadas por las distintas especies del gnero Fusarium
son llamadas Fusariosis. Los cereales son sensiblemente afectados por estos
patgenos, los daos se pueden reflejar en distintas formas, tanto en calidad como
en rendimiento. Las micotoxinas son productos qumicos derivados del metabolismo

16
de estos hongos; dichas sustancias permanecen en los granos y causan problemas
de toxicidad (Fuentes, 2000).

La enfermedad de fusariosis es ms destructiva en climas ridos y en suelos
clidos y arenosos de las regiones templadas. La enfermedad antes mencionada
puede ocasionar prdidas considerables, especialmente en variedades susceptibles
y bajo condiciones climticas favorables. El marchitamiento causado por Fusarium
sp. se caracteriza por el achaparramiento de las plantas, las cuales en poco tiempo
se marchitan y finalmente mueren. Sin embargo, por lo general la enfermedad no
ocasiona prdidas considerables, a menos que las temperaturas del suelo y del aire
sean muy altas durante gran parte de la estacin (Agrios, 2002).

Fusarium sp., provoca la pudricin de las races, tallos inferiores, corolas,
bulbos, tubrculos, etc., de plantas que pertenecen a familias muy poco
emparentadas, que incluyen hortalizas, plantas ornamentales, pastos para cspedes,
cultivos mayores y plantas silvestres. Estas enfermedades se encuentran
ampliamente distribuidas por todo el mundo y ocasionan prdidas considerables
porque disminuyen el crecimiento y la produccin de plantas infectadas (Agrios,
2002).

En plantas de heliconias (Heliconia wagneriana Petersen) se estudiaron
sntomas de disminucin de crecimiento, bordes con necrosis en hojas adultas Las
races de los rizomas presentaron necrosis en sus puntas. En pruebas de
patogenicidad se comprob que Fusarium sp. fue el agente causal (Negrete, 2007).

17
En hojas de Ginger (Alpinia purparata K. Schurm) se presentaron bordes
amarillos que se enrollaron sobre si mismos para despus marchitarse, en las races
del rizoma se presentaron pudriciones color grisceo y consistencia acuosa as como
un crecimiento anormal manifestado en una disminucin de su porte; estos sntomas
fueron ocasionados por el gnero Fusarium sp. de acuerdo a las pruebas de
patogenicidad realizadas (Jimnez, 2007).

2.6.1 Clasificacin taxonmica y morfologa de Fusarium sp.
De acuerdo con Alexopulus (1997) el hongo se clasifica de la manera
siguiente:
Reino: Fungi
Clase: Deuteromycetes
Orden: Moniliales
Familia: Moniliaceae
Gnero: Fusarium

Algunas especies dentro del gnero llegan a presentar un esporodoquio,
muchas otras no lo presentan y las clulas esporgeneas (filides) son producidas
directamente sobre las hifas de un conidiforo corto. Conidios de dos tipos,
microconidios septados o con un solo septo y macroconidios en forma de media luna
o fusiformes con septos transversales, hialinos, algunas especies forman cadenas de
microconidios (Moreno, 1988).


18
Al establecer plantas sanas en un suelo contaminado, los tubos germinativos
de las esporas o el micelio penetran directamente en las puntas de las races o
ingresan a travs de heridas. El micelio del patgeno se propaga intercelularmente a
travs de la raz cuando llega a los vasos xilmicos. Se mantiene solo en los haces
vasculares y viaja a travs de ellos, principalmente en sentido ascendente, hacia el
tallo y corona de la planta. Cuando llega a los vasos, el micelio se ramifica y produce
macroconidios que se desprenden y son llevados a la parte superior de la planta.
Estos germinan donde finaliza su movimiento ascendente. Posteriormente, penetran
a la pared superior del vaso y el patgeno produce ms microconidios en el vaso
siguiente (Agrios, 2002).

2.7 Caractersticas de Rhizopus sp.
El orden de los Mucorales se divide en seis familias, la ms importante es
Mucoraceae, debido a que el gnero Rhizopus produce cido fumrico, alcohol,
cido lctico. Rhizopus es un parsito dbil que ocasiona pudriciones de races,
hortalizas, frutos almacenados y algunas flores (Mendoza y Pinto, 1983).

Se conocen 30 especies del gnero Rhizopus, algunas saprfitas y otras
parsitas de fruto y otros rganos vegetales en trnsitos o en almacn y causan
pudricin. Por ejemplo R. stalonifer = R. nigricans que causan la pudricin blanda del
camote (Hipomoeba batata), el goteo de la fresa (Fragaria vesca), pudricin de
hortalizas, alcachofa (Cynara scolymus L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.), zanahoria
(Daucus carota L.), col (Brassica oleracea L.), pepino (Cucumis sativus), chile
(Capsicum annum L.), nabo (Brassica campestres), tomate (Lycoperisicum

19
esculentum) y sandia (Citrullus lanatus). Tambin atacan granos almacenados como
R. tritici, para que stos hongos ataquen se requieren de heridas (Moreno, 1988).

Las especies de Rhizopus crecen muy bien en medio de cultivo de laboratorio,
donde forman colonias lanosas que llenan la placa petri y producen esporangios
luego de tres das a 28 C. Las especies de Rhizopus son los mayores
contaminantes del ambiente; sus esporas se encuentran suspendidas en el aire o
sobre diversos objetos. Cualquier material que contenga almidn y suficiente
humedad es un sustrato apropiado para su desarrollo (Ames, 1997)

La pudricin blanda de frutos y hortalizas ocasionadas por Rhizopus se
encuentra ampliamente distribuida en todo el mundo y aparece en rganos carnosos
de hortalizas, en plantas florales y en frutos que han sido cosechados, y es
importante slo durante el almacenamiento, transporte y venta en el mercado de
estos productos. Entre las plantas de cultivo que son atacadas con mayor frecuencia
por esta enfermedad se encuentran las fresas, camotes, todas las cucurbitceas, los
duraznos (Prunus prsica), cerezas (Prunus avium), cacahuates (Arachis hypogea
L.) y otros frutos y hortalizas. El hongo afecta el maz (Zea mays) y a otros cereales
bajo condiciones altas de humedad. Los bulbos, cormos y rizomas de plantas
florales, como es el caso de los gladolos (Gladiolus communis) y los tulipanes
(Tulipa gesneriana), tambin son susceptibles a esta enfermedad (Agrios, 2001).

Rhizopus oryzae Went & Prinsen-Geerligs, R. stolonifer Ehr. y R. microsporus
V. Tiegh. Son tres especies de Zygomycetes que se han encontrado asociadas con

20
la pudricin del tubrculo de ulluco. R. oryzae tiene conidiforos de ms de 1 mm de
largo y 1020 m de grosor que emergen por pares y van unidos por un extremo a
rizoides sin ramificaciones secundarias y por el otro a esporangios que miden hasta
150 m de dimetro y contienen numerosas esporas elipsoidales de 8-10 m de
largo. La Columela es elipsoidal y es ms larga que ancha. Rhizopus stolonifer tiene
esporangiforos de hasta 2mm de largo; los esporangios alcanzan hasta 200 m de
dimetro con esporas ovaladas que miden entre 10 y 25 m de largo. La Columnela
es globosa. Los rizoides son de ramificacin compleja (Ames, 1997).

Rhizopus sp. es un gnero que se encuentra en el suelo en toda clase de
materia orgnica vegetal en descomposicin. Para su desarrollo requiere ambientes
con humedades relativas de 95-100 %. En medio de cultivos crece rpidamente
enmascarando el desarrollo de otros hongos de crecimiento mas lento. Sus esporas
estn contenidas en esporangios cuyos esporangiforos presentan rizoides en la
base; los esporangiforos no son ramificados. El micelio es de color gris (Moreno,
1988).

2.7.1 Clasificacin taxonmica y morfologa de Rhizopus sp.
De acuerdo con Barnett, (1972) el hongo se clasifica de la manera siguiente:
Clase: Phycomycetes
Subclase: Zygomycetidae
Orden: Mucorales
Familia: Mucaracea
Gnero: Rhizopus

21
El micelio areo est formado por estolones los cuales en el medio de cultivo
produce rizoides y en lado opuesto esporangiforos delgados erectos o algo
encorvados y por lo general en fascculos. Los esporangiforos al terminar su
crecimiento dan origen a esporangios globosos, paredes delgadas, columnela
prominente, de color blanco cuando joven y negro al madurar, debido al color de las
esporangiosporas maduras. Las esporangiosporas son globosas a ovales o
angulares lisas o con estras longitudinales, raramente equinuladas. Las zigosporas
formadas heterotlicamente tienen forma oval a elptica, poseen paredes gruesas y
superficie notablemente equinulada. (Campos, 2007).

El gnero Rhizopus sp. tiene esporangiforos generalmente individuales,
adheridos al sustrato por medio de rizoides y unidos a otros por medio de estolones;
esporangios globosos presentando columna (Moreno, 1988).












22
III. MATERIALES Y MTODOS

3.1 Localizacin del experimento
El experimento se llev a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos
Vegetales de la Facultad de Agrobiologa Presidente Jurez perteneciente a la
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo, ubicada en la ciudad de
Uruapan, Michoacn.

3.2 Material vegetal
Las plantas madre de nardo provenientes de San Andrs, Estado de Mxico,
se transplantaron en cultivo hidropnico con sustrato como tezontle; dos veces por
semana se les reg con una solucin nutritiva (Steiner) al 50 %. (Cuadro 1) y tres
con agua corriente. De igual forma se les aplic Tecto

60 (Tiabendazol) en una
proporcin de 0.6g L
-1
una vez por semana.



De estas plantas se obtuvieron bulbos sanos requeridos para la multiplicacin
in vitro con dimetro de 1.5 a 2 cm y longitud de 2 a 4 cm.

3.3 Establecimiento asptico del cultivo in vitro de nardo
Los cormos seleccionados se enjuagaron con agua corriente y detergente
hasta quitar por completo la tierra, se eliminaron las races. Posteriormente se
colocaron en solucin de Tecto

60 % (0.6 g L
1
) por 30 minutos. La desinfestacin se
efecto con hipoclorito de sodio comercial al 70 % (6 % de ingrediente activo) por 20
minutos. En campana de flujo laminar se enjuagaron cuatro veces con agua

23
esterilizada para eliminar los restos de hipoclorito y se cultivaron en medio de
Murashige y Skoog (1962).

Cuadro 1. Solucin nutritiva Steiner 50 % para la nutricin de plantas de nardo.
Fertilizante Cantidad en mg L
-1

cido fosfrico 70 %* 0.065
Sulfato de potasio 217
Sulfato de magnesio 120
Nitrato de potasio 47.5
Nitrato de calcio 475
Sulfato ferroso 0.025
Sulfato de magnesio 0.025
Sulfato de zinc 0.01
Sulfato de cobre 0.01
Borax 5
*Esta fuente esta indicada en mililitros.

3.4 Medio de cultivo para el desarrollo de hongos
Los hongos contaminantes de los medios de cultivo se cultivaron en cajas
Petri con medio PDA (papa, dextrosa y agar). El medio se esteriliz en autoclave por
20 minutos a 15 libras de presin; una vez esterilizado y bajo condiciones aspticas
en campana de flujo laminar se vaciaron 10 mL de medio por caja Petri.

Solidificado el medio de cultivo se transfiri al centro de las cajas Petri una
muestra del agente contaminante desarrollado en los frascos con el explante de
nardo, se sell con Kleen pack

y se etiquet correctamente (Figura 1).

24







Figura 1. Transferencia de los agentes causales de la contaminacin del cultivo in
vitro de nardo en las cajas Petri con medio PDA ya solidificado.

3.5 Identificacin de los agentes causales
A los ocho das de establecidos los cultivos fngicos en el medio PDA, se
observ desarrollo el de micelio principalmente de color verde, negro, blanco y
prpura en la mayora de los aislamientos. De estos cultivos se purific cada tipo de
micelio en cajas con medio PDA fresco para lograr cultivos puros.

De las colonias puras se hicieron preparaciones fijas, mediante la tcnica de
raspadura con aguja de diseccin en agua, que consisti en colocar una pequea
gota de agua destilada en un portaobjetos, se sumergi la punta de la aguja de
diseccin en la superficie de la colonia y se tom micelio y estructuras, se coloc un
cubreobjetos y se procedi a observar en el microscopio. La determinacin de las
caractersticas morfolgicas de crecimiento de micelio y esporulacin se efecto por
medio de comparacin con las claves de Barnet y Hunter (1998).



25
3.6 Bioensayo con fungicidas bajo condiciones in vitro para el control de los
agentes contaminantes durante la micropropagacin de nardo
En cajas con medio de PDA se coloc al centro un disco de agar de 5 mm con
micelio proveniente de colonias puras y cuatro discos de papel filtro a una distancia
equidistante del centro, impregnados por tres minutos con los fungicidas
seleccionados a la dosis media recomendada por el fabricante (Figura 2).








Figura 2. Bioensayo de control. (A) Preparacin de los discos de papel filtro con
fungicidas. (B) Caja con medio PDA y discos de agar provenientes de colonias puras
y fungicidas.

Los fungicidas utilizados para esta prueba fueron Tecto 60

, Cercobin M

,
Sulfato Tribsico de cobre

y Swicht

, recomendados para el control de pudriciones

radicales en diferentes especies ornamentales (Cuadro 2). Se establecieron cinco
tratamientos conformados por los cuatro fungicidas mencionados y un testigo (disco
de papel filtro con agua estril) (Figura 3); en cada tratamiento se establecieron cinco
repeticiones. Se registr el crecimiento de la colonia en centmetros a partir del
primer da del establecimiento del experimento y hasta que el hongo del tratamiento
del testigo coloniz al 100 % la caja Petri. Los datos de esta variable se sometieron a
A B

26
anlisis de varianza, y se efecto la prueba de Tukey de medias entre tratamientos,
con el paquete estadstico SAS versin 9.0 (SAS, 2004).

Cuadro 2. Fungicidas e ingredientes activos utilizados para el control de Fusarium
sp. y Rhizopus sp. aislados de cultivo in vitro de nardo.

Fungicida Ingrediente activo Dosis g L
-1

Tecto 60

Tiabendazol:2-(4-tiazinil)-1H-
benzimidazol
0.6
Cercobin M

Tiofanato metilico dimetil 4,4-0-

fenilencenbis(3 Tioalofanato)
0.6
Swicht

Ciprodimil, Fudioxonil 0.6

Sulfato tribsico de cobre

Sulfato tribsico de cobre 2

Figura 3. Aspecto de los diferentes fungicidas utilizados en el control de Fusarium
sp. y Rhizopus sp.



Tecto 60 Cercobin
M
Sulfato tribsico
de cobre
Swicht Testigo

27
IV. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1 Identificacin de los agentes causales de la contaminacin de cultivos in
vitro de nardo
A partir del segundo da de establecido el cultivo in vitro de nardo se observ
el desarrollo de cinco tipos de micelio; los ms comunes de color blanco a rosado,
esponjoso (45 %) de color negro a gris, granuloso con abundantes esporas (40 %) y
el menos usual de color amarillo a verde pardo (15 %) (Cuadro 3).

Cuadro 3. Descripcin de micelio de hongos contaminantes de cultivos in vitro de
nardo en cada tratamiento.

Presencia
en el Descripcin del micelio
cultivo %

45 Color blanco a rosado esponjoso
40 Color negro a gris granuloso con abundantes esporas
15 Color amarillo a verde prado

Por medio de la comparacin con las claves de Barnet y Hunter (1998), se
identificaron como agentes causales de la contaminacin in vitro de nardo a
Fusarium sp. y Rhizopus sp. durante la etapa de establecimiento. De los hongos
aislados e identificados, Penicillum tambin fue uno de los contaminantes del cultivo
in vitro de nardo, pero no se tomo en cuenta porque este microorganismo es muy
comn que se encuentre en el medio ambiente.

El hongo Fusarium sp. se caracteriz por producir micelio abundante,
algodonoso, que invadi totalmente la caja Petri en ocho das. Adems de ser de

28
color blanco a rosa en los extremos y prpura en el centro. Los conidiforos fueron
simples, cortos, ramificados irregularmente con presencia de un conjunto de filides
simples o agrupados, en un esporodoquio o en falsas cabezas. Los conidios hialinos,
fueron de dos tipos: macroconidios ligeramente curvados o doblados en los
extremos, con forma tpica de canoa, predominantemente de cuatro a seis septos, y
microconidios de una sola clula, individuales; algunos conidios intermedios de 1 a 2
clulas, de forma ovoide a oblonga ligeramente curvados (Figura 4).















Figura 4. Desarrollo de la colonia y estructuras del hongo Fusarium sp. bajo
condiciones in vitro a los 8 das de establecido el experimento. (A), Cepa pura de
Fusarium sp. (B), MIcroconidios dispuestos en falsas cabezas. (C), Esporodoquio
con macroconidios. (D y E), Clamidiosporas.


El hongo Rhizopus sp. mostr micelio cenoctico areo con ramas o estolones.
En los puntos de contacto con el medio de cultivo se formaron pequeas
A B
C D E

29
ramificaciones llamadas rizoides. Los esporangiforos se originaron en los estolones
en el lado opuesto al punto de origen de los rizoides, los esporangioforos
generalmente son simples, fasciculados y delgados. Los esporangios fueron
terminales, globosos multiesporulados con columnela prominente hemisfrica de
color blanco cuando joven y negro al madurar. A los 8 das de establecido el
experimento el micelio de mostr un color negro y un crecimiento de 4 cm en las
cajas Petri purificadas(Figura 5).








Figura 5. Desarrollo de la colonia y estructuras del hongo Rhizopus sp. bajo
condiciones in vitro.

4.2. Efecto de fungicidas para el control de Fusarium sp. bajo condiciones in
vitro
Todos los fungicidas inhibieron el desarrollo del hongo a partir del segundo da
despus de la siembra (Cuadro 4), aunque Tecto 60

fue el ms eficiente de ellos

(0.10 cm) y mantuvo este efecto inhibitorio durante los 8 das que dur la evaluacin.


30
Los fungicidas Swicht

y Cercobin M

fueron menos eficientes para el control

del desarrollo del hongo que el de Tecto 60

; sin embargo inhibieron parcialmente

hasta 45 % el desarrollo in vitro del hongo a partir del segundo da de la evaluacin
en comparacin con el testigo (0.65 cm).

Cuadro 4. Efecto del tipo de fungicida sobre el control del desarrollo in vitro de
Fusarium sp.

Fungicida
Crecimiento de la colonia (cm/da)
2 3 4 5 6 7 8 9
Tecto 60

0.10 c 0.11 c 0.14 c 0.17 c 0.21 c 0.23 c 0.33 c 0.33 c

Cercobin M

0.38 b 0.47 b 0.75 b 0.98 b 1.26 b 1.44 b 1.60 b 1.75 b

Sulfato tribsico
de cobre

0.46 ab 0.55 b 1.01 b 1.63 a 2.11 a 2.74 a 3.23 a 3.48 a
Swicht

0.30 bc 0.43 b 0.67 b 1.01 b 1.29 b 1.64 b 1.88 b 2.11 b

Testigo 0.65 a 1.02 a 1.62 a 1.85 a 2.12 a 3.00 a 3.80 a 3.80 a

Letras iguales en la misma columna son estadsticamente iguales (p0.05)


31

Figura 6. Inhibicin del crecimiento de colonias de Fusarium sp. por fungicidas
sistmicos y de contacto.

El Sulfato Tribsico de cobre

disminuy el crecimiento del micelio de

Fusarium sp. los primeros cuatro das, pero a partir del sexto da, el desarrollo del
hongo en el medio de cultivo con este fungicida y el testigo fueron estadsticamente
iguales (2.11 y 2.12 cm) respectivamente.

Tecto 60

es un fungicida muy usado para el control de hongos del gnero

Fusarium sp. en plantas de Heliconia (Heliconia wagneriana) Petersencon sntomas
de pudricin radicular. Segn Negrete (2007), encontr que Tecto 60

, Benomyl 50

y Derosal 500D

inhiben completamente el desarrollo in vitro de este

microorganismo, a partir del quinto da de su aplicacin. Resultados similares fueron

32
reportados por Jimnez (2007), quien al evaluar diversos fungicidas para el control
de Fusarium sp. en plantas de Ginger (Alpinia Purpurata k.) Schum. con pudricin
radicular observ que Tecto 60

y Derosal 500D

disminuan hasta 90 % el
desarrollo del hongo con respecto al testigo; resultados que coinciden con los
observados en el presente trabajo (Figura 5).

4.3 Efecto de fungicidas para el control de Rhizopus sp. bajo condiciones in
vitro
Para el caso de Rizophus sp. se observ que el fungicida Swicht

inhibi
completamente el desarrollo del patgeno desde el primer y hasta el octavo da del
establecimiento del experimento en contraste con el testigo (Cuadro 5 ). El fungicida
Tecto 60

se caracteriz por permitir un lento desarrollo de Rhizopus sp. desde el

primer y hasta el ultimo da de establecido el bioensayo (0.82 y 2.05 cm
respectivamente). Al cuarto da los fungicidas Cercobin M

y Sulfato Tribsico de
cobre

fueron iguales de acuerdo al anlisis estadstico (1.77 y 1.79 cm

respectivamente); mientras que a partir del sptimo da el resto de los tratamientos
fueron estadsticamente similares al testigo (3.55, 3.72 y 3.85 cm respectivamente)
(Figura 7) y (Cuadro 5). Estos resultados comprueban lo sealado por Watts y King
(1973), quienes aseguran que el tipo y concentracin del fungicida es indispensable
para reducir la contaminacin in vitro.






33

Figura 7. Inhibicin del crecimiento de colonias de Rhizopus sp. por fungicidas
sistmicos y de contacto.


Cuadro 5. Efecto del tipo de fungicida sobre el control del desarrollo in vitro de
Rhizopus sp.

Fungicida
Crecimiento de la colonia (cm/da)
2 3 4 5 6 7 8 9
Tecto 60

0.82 b 1.06 b 1.25 c 1.45 c 1.69 c 1.84 b 1.95 b 2.05 b

Cercobin M

1.17 b 1.25 b 1.77 b 2.22 bc 2.58 bc 3.55 a 3.65 a 3.72 a

Sulfato tribsico
de cobre

1.27 ab 1.39 ab 1.79 b 2.58 ab 2.94 ab 3.72 a 3.75 a 3.75 a
Swicht

0.18 c 0.26 c 0.35 d 0.42 d 0.54 d 0.68 c 0.78 c 0.89 c

Testigo 1.32 a 2.00 a 2.52 a 3.12 a 3.62 a 3.85 a 4.00 a 4.00 a

Letras iguales en la misma columna son estadsticamente iguales (p0.05)

34
4.4 Efecto del tipo de accin de los fungicidas para el control de Fusarium sp.
bajo condiciones in vitro
El control de Fusarium sp. en condiciones in vitro fue superior con los
fungicidas sistmicos, los cuales superaron al producto de contacto y al testigo a
partir del tercer da de establecido el experimento, situacin que se mantuvo hasta al
final de la evaluacin (Cuadro 6).

El fungicida de contacto se comporto estadsticamente igual que el testigo
desde el segundo da de la evaluacin hasta finalizar el experimento (0.46, 3.48 y
0.26, 3.86 cm respectivamente) ecepto el cuarto da (1.01 cm) (Cuadro 6)

Cuadro 6. Accin del tipo de fungicida sobre el control del desarrollo in vitro de
Fusarium sp.

Accin del
fungicida
Crecimiento de la colonia (cm/da)
2 3 4 5 6 7 8 9
Sistmico 0.26 b 0.33 b 0.52 c 0.72 b 0.92 b 1.10 b 1.27 b 1.39 b
Contacto 0.46 a 0.52 a 1.01 b 1.63 a 2.11 a 2.74 a 3.23 a 3.48 a
Testigo 0.26 a 0.67 a 1.34 a 1.78 a 2.14 a 2.28 a 3.18 a 3.86 a

Letras iguales en la misma columna son estadsticamente iguales (p0.05)


Estos resultados, coinciden con los obtenidos en los trabajos de investigacin
de Jimnez (2007) y Negrete (2007), quienes trabajaron con plantas tropicales y
encontraron que los fungicidas de accin sistmica fueron mejores que los de accin

35
de contacto para el control de Fusarium sp. en plantas de Ginger y Heliconia
respectivamente

4.5 Efecto del tipo de accin de los fungicidas para el control de Rhizopus sp.
bajo condiciones in vitro
A partir del segundo da de la evaluacin se observ que los fungicidas de
accin de contacto fueron estadsticamente iguales en comparacin con el
tratamiento testigo (1.27 y 1.32 respectivamente); sin embargo los fungicidas de
accin sistmica fueron mejores que el de accin de contacto y el testigo esta
tendencia se mantuvo durante los ocho das que dur la evaluacin (Cuadro 7).

Cuadro 7. Accin del tipo de fungicida sobre el control del desarrollo in vitro de
Rhizopus sp.

Accin del
fungicida
Crecimiento de la colonia (cm/da)
2 3 4 5 6 7 8 9
Sistmico 0.72 b 0.86 c 1.21 c 1.36 c 1.60 c 2.02 b 2.12 b 2.22 b
Contacto 1.27 a 1.39 b 1.79 b 2.58 b 2.94 b 3.72 a 3.75 a 3.75 a
Testigo 1.32 a 1.83 a 2.68 a 3.13 a 3.70 a 3.88 a 4.00 a 4.00 a

Letras iguales en la misma columna son estadsticamente iguales (p0.05)


Desde el segundo da de evaluacin se observ que los fungicidas de accin
sistmica inhibieron mejor el desarrollo del micelio del hongo que los de contacto
(10.72 y 1.32 cm respectivamente); mostraron diferencias estadsticas significativas
durante todo el experimento (Cuadro 7).


36
Resultados similares se obtuvieron de los fungicidas de accin sistmica bajo
condiciones in vitro para el control de Pestalotia en orqudea en donde el efecto
inhibitorio del crecimiento del hongo se logr con el fungicida Tecto 60

(Snchez,
2008).

Al considerar la accin del fungicida para el control de Rhizopus sp. in vitro, se
observ que los de accin de sistmica inhiben el crecimiento de micelio del hongo
desde el segundo da, esta tendencia se mantuvo durante todo el periodo de
evaluacin con respecto al testigo.


















37
V. CONCLUSIONES

Con base a los objetivos e hiptesis planteadas; as como en los resultados
obtenidos en la presente investigacin, se concluy lo siguiente:

1. Los hongos Fusarium sp. y Rhizopus sp. son los agentes contaminantes
que se desarrollan en el establecimiento de cultivos in vitro del nardo.

2. El fungicida Tecto 60

inhibi completamente el desarrollo in vitro del hongo

Fusarium sp. durante los 8 das que dur la evaluacin.

3. El fungicida Swicht

control el desarrollo in vitro de Rhizopus sp. desde el
primer y hasta el octavo da del establecimiento del experimento.

4. Los fungicidas de accin sistmica inhibieron el crecimiento del micelio del
hongo Fusarium sp. mejor que los de accin de contacto.

5. El fungicida de contacto no inhibi el crecimiento del hongo Rhizopus sp.












38
VI. LITERATURA CITADA

Agrios N G (2001) Plant pathology. Ed. Harcout/ Academia Press. USA. 625 p.

Agrios N G (2002) Fitopatologa 2. Edicin 7 Reimpresin. Ed. Limusa. Mxico. 821 p.

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47
VII. APNDICE



Cuadro 1A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al segundo da de establecido el experimento.

Fuente de
Variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento 4 0.666272 0.166568 12.88 <.0001
Error 18 0.23275 0.012931
total 22 0.899022
r
2
= 0.741107 CV= 31.895 %


Cuadro 2A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al tercer da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 1.613598 0.403395 31.13 <.0001
Error 18 0.23325 0.012958
total 22 1.846848
r
2=
0.873704 CV=23.91048 %


Cuadro 3A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al cuarto da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 4.485141 1.121285 36.63 <.0001
Error 18 0.551 0.030611
total 22 5.036141
r
2
=0.890591 CV=22.63903 %




48
Cuadro 4A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al quinto da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 7.484793 1.871198 25.92 <.0001
Error 18 1.2995 0.072194
total 22 8.784293
r
2
=0.852066 CV=25.17261 %



Cuadro 5A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 11.22434 2.806084 21.02 <.0001
Error 18 2.403 1.335
total 22 13.62734
r
2
=0.823663 CV=27.30677 %


Cuadro 6A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al sptimo da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 21.59878 5.399696 21.26 <.0001
Error 18 4.57225 0.254014
total 22 26.17103
r
2
=0.825293 CV=29.45858 %






49
Cuadro 7A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al octavo da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 32.14564 8.03641 30.56 <.0001
Error 18 4.73425 0.263014
total 22 36.87989
r
2
=0.871631 CV=25.29871 %


Cuadro 8A Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Fusarium sp. al octavo da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 34.42342 8.605856 27.22 <.0001
Error 18 5.69 0.316111
total 22 40.11342
r
2
=0.858152 CV=25.9668 %


Cuadro 9A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al segundo da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 6.045174 1.511293 19.6 <.0001
Error 18 1.38825 0.077125
total 22 7.433424
r
2
=0.813242 CV=28.18808 %






50
Cuadro 10A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al tercer da de establecido el experimento.
Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 6.4485 1.612125 17.14 <.0001
Error 18 1.69275 0.094042
total 22 8.14125
r
2
=0.792077 CV=27.25886 %


Cuadro 11A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al cuarto da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 10.74188 2.68547 55.1 <.0001
Error 18 0.87725 0.048736
total 22 11.61913
r
2
=0.9245 CV=15.19084 %


Cuadro 12A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al quinto da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 19.24904 4.812261 32.39 <.0001
Error 18 2.674 0.148556
total 22 21.92304
r
2
=0.878028 CV=20.74867 %









51
Cuadro 13A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al sexto da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 24.52942 6.132356 31.67 <.0001
Error 18 3.48525 0.193625
total 22 28.01467
r
2
=0.875592 CV=20.37374 %


Cuadro 14A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al sptimo da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 36.72779 9.181948 147.21 <.0001
Error 18 1.12275 0.062375
total 22 37.85054
r
2
=0.970337 CV=9.486783 %


Cuadro 15A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al octavo da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 36.22925 9.057313 132.6 <.0001
Error 18 1.2295 0.068306
total 22 37.45875
r
2
=0.967177 CV=9.590947 %







52
Cuadro 16A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el
crecimiento in vitro de Rhizopus sp. al noveno da de establecido el experimento.

Fuente de
variacin
GL SC CM F-Valor Pr>F
Tratamiento
4 34.12234 8.530584 78.79 <.0001
Error 18 1.94875 0.108264
total 22 36.07109
r
2
=0.945975 CV=11.80624 %