Universidad Rafael Landvar Facultad de Ingeniera Ingeniera Qumica Laboratorio de Bioqumica Lic.

Lucia Escobar

PRELABORATORIO PRCTICA NO. 4: ENZIMAS

Zucely Castillo Monterroso Carn 1022507 Interciclo 2012

Guatemala, 25 de Junio de 2012

1. OBJETIVOS
Comprobar la presencia de polifenol oxidasa en manzanas, inhibiendo la oxidacin de la mitad de una manzana con cido ascrbico y la otra mitad dejndola a la interperie. Determinar cualitativamente la actividad enzimtica de las levaduras a partir la produccin de CO2 visto en forma de espuma bajo condiciones de: alta temperatura, baja temperatura, medio cido y medio salino. Determinar cualitativamente la presencia de amilasa salival utilizando una solucin de yodo como agente revelador. Determinar experimentalmente la presencia de catalaza de papa a partir de la produccin de oxgeno en un medio oxidante propiciado por perxido de hidrgeno.

2. ANTECEDENTES
2.1. ENZIMAS

En las clulas las reacciones no ocurren al azar, sino como parte de una va metablica, es decir, un conjunto de reacciones vinculadas. Las vas metablicas se inician con un reactivo especfico y culminan con un producto final. Una enzima es una molcula protenica que funciona como un catalizador orgnico y acelera una reaccin qumica; es importante recordar que un catalizador es aquel que participa en una reaccin qumica aumentando la velocidad de reaccin por la disminucin de la energa de activacin de la reaccin, pero no es consumida durante la reaccin qumica ya que se regenera. Las enzimas unen a molculas especficas y provoca que reaccionen una con otra. Los reactivos de una reaccin enzimtica son los sustratos de la enzima correspondiente. (McKee (2009)pp 185) Las enzimas presentan una serie de caractersticas notables como las siguientes: Son protenas que poseen un efecto catalizador al reducir la barrera energtica de ciertas reacciones qumicas. Influyen solo en la velocidad de reaccin sin alterar el estado de equilibrio. Actan en pequeas cantidades. Forman un complejo reversible con el sustrato. No se consumen en la reaccin, pudiendo actuar una y otra vez. Muestran especificidad por el sustrato. Se produccin est directamente controlada por los genes.

2.1.1. CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS El nombre de las enzimas suele derivarse del sustrato o de la reaccin qumica que cataliza, con la terminacin asa. Bajo esta clasificacin es posible distinguir seis grupos distintos: Oxidoreductasas: Catalizan reacciones de xido reduccin, precisan la colaboracin de coenzimas de oxidorreduccin como el NAD, NADP y FAD que aceptan o ceden los electrones. Entre ellas se encuentran las deshidrogenasas y peroxidasas. Transferasas: transfieren grupos activos, obtenidos de la ruptura de ciertas molculas, a otras sustancias receptoras. Suelen actuar en procesos de interconversin de monosacridos y aminocidos. Hidrolasas: Catalizan reacciones de hidrlisis con la consiguiente obtencin de monmeros a partir de polmeros. Actan en la digestin de alimentos previamente a otras fases de su degradacin. Entre ellas se encuentran glucosidasas, lipasas, esterasas. Liasas: Catalizan reacciones en las que se eliminan molculas de agua, dixido de carbono, y amoniaca para formar un doble enlace o aadirse a un doble enlace. Entre ellas se encuentran las descarboxilasas y liasas. Isomerasas: Actan sobre determinadas molculas obteniendo o cambiando de ellas sus ismeros funcionales o de posicin, es decir, catalizan reacciones de racemizacin y cambios de posicin de un grupo en determinada molcula obteniendo formas isomricas. Entre ellas se encuentran las epimerasas. Ligasas: Catalizan la degradacin o sntesis de los enlaces denominados fuertes mediante el acopamiento a molculas de alto valor enrgico como el ATP, ejemplo de stas son las sintetasas y carboxilasas.

Tabla 1: Aplicaciones industriales de las enzimas

Aplicacin Procesado de alimentos Tipo de enzimas utilizadas Usos Amilasas de hongos y Cataliza la degradacin del plantas almidn en azcares sencillos. Adems la fermentacin del azcar llevada a cabo por levaduras produce dixido de carbono. Celulasas, pectinasas Aclarado de zumos de frutos Lipasas Se introduce durante el proceso de produccin de queso Roquefort para favorecer a maduracin. Papana Ablandamiento de a carne utilizada para cocinar.

Zumos de frutas Industria lctea

Digestin de la carne

2.1.2. ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS

Las enzimas suelen ser muy especficas tanto del tipo de reaccin que catalizan como del sustrato involucrado en la reaccin. La forma, la carga y las caractersticas hidroflicas/hidrofbicas de las enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. Las enzimas tambin pueden mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y quimioselectividad Aquellas enzimas que producen metabolitos secundarios son denominadas promiscuas, ya que pueden actuar sobre una gran variedad de sustratos. Por ello, se ha sugerido que esta amplia especificidad de sustrato podra ser clave en la evolucin y diseo de nuevas rutas biosintticas. (McKee (2009) pp 200).

2.2.

CINTICA ENZIMTICA

Las enzimas pueden actuar en la velocidad de las reacciones bioqumicas de las siguientes formas:

Reduccin de la energa de activacin mediante la creacin de un ambiente en el cual el estado de transicin es estabilizado Reduciendo la energa del estado de transicin, sin afectar la forma del sustrato, mediante la creacin de un ambiente con una distribucin de carga ptima para que se genere dicho estado de transicin. Proporcionando una ruta alternativa. Reduciendo la variacin de entropa necesaria para alcanzar el estado de transicin (energa de activacin) de la reaccin mediante la accin de orientar correctamente los sustratos, favoreciendo as que se produzca dicha reaccin. Incrementando la velocidad de la enzima mediante un aumento de temperatura. El incremento de temperatura facilita la accin de la enzima y permite que se incremente su velocidad de reaccin. Sin embargo, si la temperatura se eleva demasiado, la conformacin estructural de la enzima puede verse afectada, reduciendo as su velocidad de reaccin, y slo recuperando su actividad ptima cuando la temperatura se reduce. No obstante, algunas enzimas son termolbiles y trabajan mejor a bajas temperaturas. (McKee (2009) pp 205)

La cintica enzimtica es el estudio de cmo las enzimas se unen a sus sustratos y los transforman en productos. Los datos de equilibrios utilizados en los estudios cinticos son obtenidos mediante ensayos enzimticos. Las reacciones enzimticas se dividen en dos etapas. En la primera, el sustrato se une reversiblemente a la enzima, formando el complejo enzima-sustrato. En la segunda, la enzima cataliza la reaccin y libera el producto. Las velocidades de las enzimas dependen de las condiciones de la solucin y de la concentracin de

sustrato. Aquellas condiciones que desnaturalizan una protena, como temperaturas elevadas, pHs extremos o altas concentraciones de sal, dificultan o impiden la actividad enzimtica, mientras que elevadas concentraciones de sustrato tienden a incrementar la actividad. Para encontrar la mxima velocidad de una reaccin enzimtica, la concentracin de sustrato se incrementa hasta que se obtiene una tasa constante de formacin de producto. La saturacin ocurre, cuando la concentracin de sustrato aumenta y disminuye la concentracin de enzima libre, que se convierte en la forma con sustrato unido (ES). A la mxima velocidad (Vmax) de la enzima, todos los sitios activos de dicha enzima tienen sustrato unido, y la cantidad de complejos ES es igual a la cantidad total de enzima. Sin embargo, Vmax es slo una de las constantes cinticas de la enzima. La cantidad de sustrato necesario para obtener una determinada velocidad de reaccin tambin es importante. Este parmetro viene dado por la constante de Michaelis-Menten (Km), que viene a ser la concentracin de sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad mxima. Cada enzima tiene un valor de Km caracterstico para un determinado sustrato, el cual puede decirnos cmo de afn es la unin entre el sustrato y la enzima. Otra constante til es kcat, que es el nmero de molculas de sustrato procesadas por cada sitio activo por segundo. La eficiencia de una enzima puede ser expresada en trminos de kcat/Km, en lo que se denomina constante de especificidad, que incorpora la constante de velocidad de todas las fases de la reaccin. Debido a que la constante de especificidad contempla tanto la afinidad como la capacidad cataltica, es un parmetro muy til para comparar diferentes enzimas o la misma enzima con diferentes sustratos. El valor mximo terico de la constante de especificidad es denominado lmite de difusin tiene un valor de 108109 (M-1 s-1). Llegados a este punto, cada colisin de la enzima con su sustrato da lugar a la catlisis, con lo que la velocidad de formacin de producto no se ve limitada por la velocidad de reaccin, sino por la velocidad de difusin. Figura 1: Curva Michaelis-Menten de saturacin para reacciones enzimticas.

Fuente: Wikipedia.org

Tabla 2: Valores de Km caractersticos para, Kcal, y Kcal/Km de enzimas seleccionadas

Fuente: McKee (2009)

2.2.1. REGUACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Los seres vivos tienen mecanismos sofisticados para regular las vas bioqumicas. La regulacin es esencial por varias razones: Mantenimiento de un estado ordenado: La regulacin de cada ruta da lugar a la produccin de las sustancias que se requieren para mantener a estructura y funcin de la clula de forma conveniente y sin desperdicio de recursos. Conservacin de la energa: as clulas controlan constantemente las reacciones que generan energa, de forma que se consumen los nutrientes suficientes para satisfaces sus requerimientos energticos.

Respuesta a las variaciones ambientales: Las clulas pueden realizar ajustes relativamente rpidos de las variaciones de temperatura, pH, fuerza inica y concentracin de nutrientes debido a que pueden aumentar o disminuir as velocidades de reacciones especficas.

La regulacin de las rutas bioqumicas es compleja. Se consigue principalmente ajustando las concentraciones y las actividades de determinadas enzimas. El control se realiza por: Control gentico: La sntesis de las enzimas como respuesta a las variaciones de las necesidades metablicas se denomina induccin enzimtica. La induccin es inhibida por un proceso llamada represin a partir del producto final de una va bioqumica. Modificacin covalente: Es la regulacin por la interconversin entre sus formas activa e inactiva. Regulacin alostrica: Reduce la velocidad de unin del sustrato a la enzima por medio de la unin de molculas efectoras o ligandos a los sitios alostricos. Compartimentalizacin: Es la separacin fsica entre las molculas y sustratos por medio de la compartimentalizacin celular. (McKee (2009) pp 218).

3. COFACTORES ENZIMTICOS
Los cofactores enzimticos son sustancias de diferente naturaleza qumica, que participan en las reacciones enzimticas debido a que las enzimas no poseen en su estructura todos los grupos funcionales necesarios para llevar a cabo la catlisis de todas las reacciones metablicas. Los cofactores pueden ser: Metales: Los metales importantes en os seres vivos son de dos clases: alcalinos, alcalinotrreos y metales de transicin. En las enzimas los metales alcalinos y alcalinotrreos estn unidos en forma laxa y suelen tener funciones estructurales, mientras que los de transicin tienen funciones clave en a catlisis. Coenzimas: Las coenzimas son un grupo de molculas orgnicas que dan versatilidad qumica a las enzimas, debido a que poseen grupos reactivos que no estn presentes en las cadenas laterales de los aminocidos o a que pueden actuar como transportadora de molculas de sustrato.

4. CONSERVACIN DE ALIMENTOS
Los alimentos al ser compuestos orgnicos son productos perecederos, y la velocidad a la cual se descomponen dependen de las condiciones a las que son expuestos. Los procesos de conservacin de alimentos ms utilizados en la industria alimenticia se clasifican en: Conservacin de los alimentos por fro Conservacin de los alimentos por calor Conservacin de alimentos por mtodos qumicos Conservacin de alimentos por otros mtodos.

4.1.

CONSERVACIN DE ALIMENTOS POR FRO

Los mtodos de conservacin de alimentos por calor son: Refrigeracin: La disminucin de la temperatura reduce la velocidad de las reacciones qumicas y disminuye la actividad de los microorganismos Congelacin: Aplican temperaturas inferiores a 0 grados y parte del agua del alimento se convierte en hielo. Es importante efectuar la congelacin en el menor tiempo y a la temperatura ms baja posible, para que la calidad del producto no se vea afectada. Ultra congelacin: Se desciende rpidamente la temperatura del alimento mediante aire fro, contacto con placas fras, inmersin en lquidos a muy baja temperatura . 4.2. CONSERVACIN DE ALIMENTOS POR CALOR

Escaldado: Se emplea como paso previo para congelar algunos vegetales y mejorar su conservacin. Una vez limpias, las verduras se sumergen unos minutos en agua hirviendo, lo que inactiva las enzimas (sustancias presentes de forma natural en los vegetales y responsables de su deterioro) Despus de enfriarlas se envasan en bolsas especiales para congelados, se envasan al vaco y se les anota la fecha de entrada en el congelador para controlar su tiempo de conservacin. No se producen prdidas nutritivas. Pasteurizacin: La aplicacin de calor durante un tiempo inactiva los grmenes capaces de provocar enfermedad, pero no sus esporas. Por ello, el alimento debe ser refrigerado para evitar el crecimiento de los grmenes que no se han podido eliminar.

Esterilizacin: Libera los alimentos de grmenes y esporas. Se aplica en el producto una temperatura que ronda los 115 grados. Se pierden vitaminas hidrosolubles (grupo B y vitamina C) en mayor o menor cantidad, segn la duracin del tratamiento de calor. Puede originar cambios en el sabor y el color original del alimento. 4.3. MTROS QUMICOS DE CONSERVACIN

Salazn: Es un proceso de conservacin basado en la adicin de sal en cantidad ms o menos abundante. sta capta el agua del alimento deshidratndolo y privando de este elemento vital a los microorganismos. Ahumando: En este proceso se suelen mezclar los efectos de la salazn y de la desecacin. Se realiza mediante el humo que se desprende en la combustin incompleta de ciertas maderas. Acidificacin: Adicin de condimentos y especias. Adicin de azcares. Aditivos. Escabechado: Intervienen conjuntamente la sal y el vinagre, consiguiendo simultneamente la conservacin y el aporte de un sabor caracterstico. La accin conservante del vinagre se debe al cido actico que contiene, consiguiendo retardar la aparicin de reacciones qumicas. La sal acta deshidratando el alimento y ayuda a su conservacin.

4.4.

OTROS MTODOS DE CONSERVACIN

Deshidratacin: Es toda actividad que implique la eliminacin del agua de un producto mediante un proceso de calentamiento del aire de forma artificial. Liofilizacin: Es una desecacin en la que se produce el paso de slido a gas sin pasar por lquido. Se basa en ciertas condiciones de vaco. Durante sta, el calor sublima el agua congelada y el vapor de agua se arrastra y se elimina. Se elimina el agua de un alimento congelado aplicando sistemas de vaco. El hielo, al vaco y a temperatura inferior a -30 grados, pasa del estado slido al gaseoso sin pasar por el estado lquido. Es la tcnica que menos afecta al valor nutricional del alimento. El inconveniente es su elevado costo. Desecacin: Consiste en la extraccin de la humedad contenida en los alimentos en condiciones ambientales naturales. Irradiacin: Fermentacin. Atmsferas modificadas. Envasado al vaco: Es un mtodo de conservacin que consiste en la extraccin del aire que rodea al alimento.

5. REACCIONES Determinacin de polifenol oxidasa en manzana

Mitad de manzana carente de vitamina C

Mitad con presencia de vitamina C (cido ascrbico): Al igual que en la reaccin anterior, la polifenol oxidasa transforma los difenoles de la manzana en oquinonas pero a una velocidad de reaccin menor; ya que el cido ascrbico cumple una funcin antioxidante.

Presencia de enzimas en el metabolismo de la levadura

C6H12O6 + levadura

CO2 + alcohol

Presencia de amilisa saliva amilosa + amilopectina glucosa

Almidn + amilasa

Presencia de catalasa de papa 2H2O2 + catalasa 2H2O +O2

6. BIBLIOGRAFA

Mckee (2009) Bioqumica, Las Bases Moleculares para la Vida (4. Ed.). Mxico, Mc Graw Hill

Fuentes en lnea

Conservacin de los alimentos http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica 3FQB.pdf, Consultada el 10/06/2012 , consutado 24/06/2012 Catalasa , http://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa , Consultada el 24/06/2012