Captulo 13. Enzimas (catalizadores biolgicos).

En el Captulo 4 se defini qu es una reaccin qumica y se hizo hincapi en los conceptos de termodinmica y cintica de las reacciones orgnicas, as como sus parmetros Entalpa, Entropa, Energa Interna y Energa de Activacin. Adems se hizo referencia al G (variacin de Energa libre) y su importancia como indicador de la espontaneidad termodinmica. Concretamente, el signo () de G nos dice si una reaccin es posible en la direccin indicada, y la magnitud de G nos seala la cantidad de energa que puede ser liberada o que debe ser administrada mientras la reaccin tiene lugar bajo esas condiciones. Sin embargo, tambin se hizo referencia que el G no proporciona informacin sobre si la reaccin tendr lugar realmente y a qu velocidad, en otras palabras el G nos indica si una reaccin puede tener lugar pero no dice nada en absoluto sobre si realmente tendr lugar. O sea, necesitamos conocer sobre el mecanismo que se pone en juego y la velocidad de tal reaccin. Esto nos lleva al tema de este Captulo, catlisis enzimtica, ya que prcticamente todas las reacciones o procesos celulares son mediados por protenas catalizadoras llamadas enzimas (en muy pocos casos son mediados por cidos ribonucleicos). As las enzimas casi siempre significan que la reaccin tendr lugar. En el Captulo anterior adems se estudi una de las cuatro macromolculas biolgicas fundamentales para todo ser vivo como son las protenas y sus estructuras bsicas, los aminocidos. Este Captulo intenta explicar porqu, en una bacteria como Escherichia coli que se reproduce cada 20 min., o en una clula animal o vegetal que deben responder a un estmulo de forma instantnea, una reaccin que requiera muchas horas para llevarse a cabo no les ser til desde el punto de vista metablico. De hecho, si bien en una clula hay innumerables reacciones posibles entre sus molculas, no todas sern capaces de formar productos. La clula cuenta con un arsenal de sustancias capaces de direccionar la sntesis de productos que le son necesarios o beneficiosos por encima de aquellos poco aprovechables o que ponen en riesgo sus funciones vitales y por ende la perpetuacin de la vida. A estas sustancias capaces de acelerar reacciones qumicas en una clula se las conoce con el nombre de enzimas. El nombre de enzima fue propuesto en 1867 por el fisilogo alemn Wilhelm Khne (1837-1900) y deriva de la frase griega en zyme, que significa en el fermento. Cada una de las centenas de reacciones que encontramos en la clula est catalizada por una enzima especfica. Estas enzimas especficas han evolucionado a travs del tiempo para optimizar los procesos bioqumicos. Actualmente se conocen ms de 2.000 tipos de enzimas diferentes. Enzimas: catalizadores biolgicos Que entendemos por un catalizador? Es una sustancia que aumenta la velocidad de una reaccin qumica, disminuyendo la energa de activacin, sin verse ella misma alterada tanto en el inicio como al final de la reaccin. Como catalizadores, las enzimas actan en muy pequea cantidad y se recuperan al final de cada reaccin para recomenzar un nuevo ciclo sin modificar su estado inicial y as funcionar indefinidamente. As por ejemplo, reconocemos que una reaccin espontnea termodinmicamente hablando ser la combustin del papel (que est constituido por celulosa, es decir cadenas de glucosa), dando CO2 y agua, y resulta casi una obviedad que ser posible en un solo sentido.

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En cambio, en la oxidacin de la misma glucosa por parte de clulas esto no es tan obvio. En el primer paso de dicho proceso, que es llamado gluclisis (lisis de la glucosa), reaccin comn en los reinos animal, vegetal y protista, la protena hexoquinasa cataliza la siguiente reaccin:
D-Glucosa + ATP D-Glucosa- 6P + ADP hexoquinasa

{ecuacin 1}

En este ejemplo la D-Glucosa es el sustrato sobre el que acta la enzima hexoquinasa, dando lugar a la formacin de D-Glucosa-6P, requisito indispensable ya sea para ingresar a la clula como para ser utilizada como fuente de energa por dicha clula en los distintos ciclos metablicos. Otro ejemplo, es la catalasa, enzima presente tanto en el reino vegetal como el protista y responsable de la descomposicin del perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno.
2H2O2 catalasa H2O + O2

{ecuacin 2}

Esta reaccin, aunque muy favorecida termodinmicamente, es muy lenta a menos que est catalizada. Si se agrega in frrico, catalizador inorgnico, a una gota de perxido de hidrgeno, ste se reduce en agua y oxgeno y la velocidad de reaccin se incrementa unas 30000 veces. Pero, si esta vez al porta objeto con una gota de perxido le agregamos una colonia bacteriana, (ej. Pseudomonas, productora de catalasa), se observa un burbujeo inmediato del O2 producido durante la reaccin y en este caso la velocidad puede aumentar hasta aproximadamente 100 millones (1.109) de veces respecto de la reaccin sin catalizar. Se evidencia as, que los catalizadores biolgicos, o sea las enzimas, se encuentran entre los catalizadores ms especficos y eficaces que se conocen.

Hay dos hechos importantes a destacar: 1) Un catalizador verdadero, aunque participa en el proceso de reaccin, no se modifica por sta. Por ejemplo, tras catalizar la formacin de una molcula de D-Glucosa-6P o la destruccin de una molcula de H2O2, la hexoquinasa y la catalasa vuelven a su estado original listas para un nuevo ciclo y as sucesivamente. 2) Los catalizadores modifican la velocidad de los procesos pero no afectan la posicin de equilibrio de una reaccin. Por ejemplo, si en la reaccin de la ecuacin 2 el equilibrio est desplazado hacia la formacin de H2O y O2, la presencia de la enzima catalasa no invertir el equilibrio de reaccin, sino que, como ya se vio anteriormente, slo incrementar la velocidad de reaccin y por ende la formacin de producto. Es necesario dejar bien en claro que cualquier proceso termodinmicamente favorable no pasa a ser ms favorable por la presencia de un catalizador, y menos an que un proceso desfavorable pase a ser favorable. Simplemente permite que se llegue con ms rapidez al estado de equilibrio. Caractersticas de los catalizadores biolgicos - Son termolbiles y su actividad depende entre otras variables fisicoqumicas del pH del medio. La mayora de las enzimas, al ser protenas comparten las propiedades y caractersticas de las mismas, descriptas en el Captulo anterior.

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- El reconocimiento de la enzima con el reactivo a procesar (sustrato) es altamente especfico. - Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran nmero de molculas de sustrato por unidad de tiempo. - Estn sujetos a una gran variedad de controles celulares, genticos y alostricos. - Son efectivos en pequeas cantidades.

Estados de transicin Las molculas de sustrato para que reaccionen entre si deben contar con una energa interna que se define como la mnima cantidad de energa presente en los reactivos para poder colisionar entre si y dar lugar a la formacin de los productos. Este estado intermedio que alcanzan los reactivos se denomina estado de transicin, y presentan mayor energa libre que en el estado inicial. Esto se muestra en la Figura 1, donde las molculas de ATP y H2O reaccionan para dar ADP y Pi. G mide la diferencia en la energa libre entre los reactivos y los productos, EA indica la energa necesaria para que los reactivos alcancen el estado de transicin.
estado de transicin EA en reaccin sin catalizar
Energa libre (G)

reactivo

EA en reaccin catalizada por enzima

ATP + H2O G producto

G = -7,3 Kcal/mol ADP + Pi

Formacin de producto
Figura 1. Efecto de los catalizadores en la energa de activacin (EA).

Si la EA requerida para la reaccin es alta, slo una pequea fraccin de molculas tendr la energa suficiente para superarla o en otras palabras, una pequea fraccin de molculas que colisionan tendr suficiente energa para lograr convertirse en productos. La EA es, para la mayora de las reacciones biolgicas a temperaturas celulares normales, lo suficientemente alta para que la proporcin de las molculas que posean mucha energa en un momento dado, sea extremadamente pequea. La velocidad de reaccin (vr) la velocidad de formacin de los productos ser proporcional a la fraccin de molculas que tienen una energa igual o mayor a la EA. La vr podra incrementarse de dos maneras: 1) aumentando el contenido de energa de las molculas, ya sea, aumentando la concentracin del "complejo activado" o la temperatura (poco probables en sistemas in vivo), 2) disminuyendo la EA. Como se ve en la Figura 1, una 133

enzima reduce la energa de activacin, con lo que hay ms molculas de reactantes (sustrato) que poseen la energa suficiente para alcanzar el estado de transicin sin suministro de calor.

Cmo acta una enzima? Una enzima tiene por funcin unir una molcula de sustrato o varios sustratos en una regin de la enzima llamada sitio activo (Figura 2).
sustratos

unin de los sustratos

sitio activo

estado de transicin enzima

enzima

producto formado

enzima

Figura 2. Modo de accin de los catalizadores biolgicos.

El sitio activo semeja un bolsillo o hendidura donde quedan expuestos algunos aminocidos de los que conforman la enzima (protena). La estructura terciaria de estas enzimas permite que el sustrato se ajuste de manera muy estrecha y esto da lugar a la alta especificidad de la catlisis enzimtica. Numerosas interacciones dbiles, se dan entre los diferentes tipos de aminocidos que conforman los dominios en el sitio activo como puentes de hidrgeno, fuerzas electrostticas e hidrfobas. Algunas enzimas, tienen adems grupos prostticos, que generalmente son molculas orgnicas pequeas o iones metlicos (Fe, Zn, Cu), los cuales actan como cofactores y son necesarios para que se produzca la catlisis. Dichos grupos tambin se ubican en el sitio activo de la enzima. En el ao 1894, un bioqumico alemn propuso el modelo de cerradura y llave para explicar la accin enzimtica, donde la enzima acomoda el sustrato de la misma manera que la cerradura lo hace con la llave especfica. Aunque este modelo explic la especificidad enzimtica, no aport mucho acerca de la catlisis. El premio Nobel Daniel Koshland plante, en 1985, el modelo de ajuste inducido, el cual propone que una enzima no slo acepta a su sustrato sino que le exige una cierta distorsin para alcanzar el estado de transicin para que a posteriori la reaccin se produzca (Figura 3). Actualmente se sabe que la distorsin la sufren tanto la molcula de sustrato como la enzima. Esta distorsin puede ser puntual o bien involucrar un cambio conformacional en la enzima, generalmente en sitios o regiones determinados a los que se los conoce como dominios de la enzima. El sitio activo de la enzima adems de reconocer y unir al sustrato, induce cambios conformacionales en el sustrato que favorece la catlisis. Una vez formados los productos, stos se liberan, permitiendo que la enzima regrese a su conformacin original, quedando el sitio activo disponible para la unin de otra molcula de sustrato.

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a) sustrato sitio activo enzima b) sustrato sitio activo enzima

productos

enzima

productos

enzima

enzima

enzima

conformacin conformacin de transicin original

Figura 3. Modelos de interaccin enzima-sustrato; a) modelo de cerradura y llave b) modelo de ajuste inducido.

Los principios generales de la accin de las enzimas se pueden resumir de la siguiente manera: 1. Une el o los sustratos. 2. Reduce la energa del estado de transicin. 3. Incrementa la velocidad de reaccin y la actividad cataltica. Cuando el proceso se completa, la enzima es capaz de liberar el o los productos y volver a su estado original para un nuevo ciclo de catlisis. Dicho de otra manera, para una enzima E que cataliza la conversin de un nico sustrato S en un nico producto P, la forma ms sencilla de escribir la reaccin global es como sigue:
S + E ES E + P

{ecuacin 3}

En donde ES corresponde al complejo enzima-sustrato, en el que consideraremos el sustrato unido a la enzima y en el estado de transicin o prximo a l. Para mayor simplicidad hemos supuesto que, aunque la primera reaccin (el paso de unin) es reversible, la segunda o paso cataltico es irreversible.

Factores que influyen en la actividad enzimtica La velocidad de transformacin del sustrato en producto determina la eficiencia de una enzima, y se puede alterar por diversos factores como la concentracin de sustrato, T, pH y presencia de inhibidores.
Concentracin de sustrato

La eficiencia de una reaccin se incrementa mientras ms cantidad de sitios activos estn ocupados. As, a mayor cantidad de sustrato mayor ser la probabilidad de que se produzca la unin enzima-sustrato. Cuando todos los sitios activos estn ocupados se habr alcanzado el punto de saturacin de las enzimas y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia. Esto se explica en forma ms extensa en cintica enzimtica.

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Temperatura

La T influye en la actividad enzimtica. En general, por cada 10 C que aumente la temperatura la velocidad de la reaccin aumenta de 2 a 4 veces. Esto ocurre hasta un valor mximo, temperatura ptima, donde la actividad es mxima, despus de esa T disminuye la actividad y se comienza a producir la desnaturalizacin trmica (Dt). Al aumenta la temperatura se incrementa el movimiento de las molculas y las posibilidades de que se encuentren E y S. Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura ptima de 37 C. Existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales entre 45 C y 80 C, cuyas enzimas estn adaptadas para ello. Las peroxidasas vegetales son muy estables, 120C unos minutos no las destruyen totalmente. En el otro extremo ciertas bacterias rticas tienen temperaturas ptimas cercanas a 0C.
pH

La actividad enzimtica guarda relacin con el carcter inico de los grupos amino y carboxilo de la protena, ya que sus cadenas polipeptdicas contienen grupos que pueden ionizarse de acuerdo al pH presente. Las propiedades catalticas de una enzima se ven afectadas por modificaciones en el pH existente en la clula. Cada enzima acta en un determinado rango de pH, dentro del cual habr u pH ptimo, donde la actividad enzimtica ser mxima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin. Los pH ptimos para algunas enzimas son: Pepsina pH 1,5; Tripsina pH 7,7; Catalasa pH 7,6; Arginasa pH 9,7; Fumarasa pH 7,8; Ribonucleasa pH 7,8.
Inhibidores

Son compuestos qumicos que se unen a la enzima, en distintos sitios y disminuyen o incluso impiden su actividad. Esto ser desarrollado ms adelante.

Cintica de las Reacciones Enzimticas En principio, las consideraciones generales de la cintica qumica pueden aplicarse a las reacciones catalizadas enzimticamente, como ya se vio la cintica (del gr. Kinetikos movimiento) concierne a las velocidades de reaccin y la manera en que esas velocidades estn influidas especialmente por la concentracin del sustrato, de los productos y de los inhibidores. Para simplificar nuestro estudio nos limitaremos a las velocidades iniciales de reaccin, medidas alrededor de un tiempo corto en el cual la concentracin del sustrato no ha disminuido a tal punto de provocar una reaccin en sentido contrario.

Cintica de Michaelis-Menten La mayora de las enzimas siguen una cintica de Michaelis-Menten (Figura 4). A una concentracin constante de enzima, si vemos el grfico de la velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente en funcin de la concentracin del sustrato, es evidente que a bajas concentraciones del mismo la velocidad de formacin de producto es proporcional a la concentracin del sustrato. A medida que se aumenta la concentracin de sustrato se aprecia una prdida de la proporcionalidad, en esta zona la reaccin es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la reaccin es independiente de sta. La incapacidad para aumentar la vr ms all de un valor finito mximo se denomina saturacin.

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Ya se ha dicho que el sustrato se une a la enzima en una regin determinada del mismo llamada sitio activo. El fenmeno de saturacin junto con otras evidencias llev a postular la existencia de un complejo enzima-sustrato (ES) como etapa previa a la formacin de productos. En 1913 Leonor Michaelis y Maud Menten dedujeron la relacin entre la velocidad mxima (Vmax) de una reaccin catalizada enzimticamente en trminos de la formacin del complejo E-S. En base a estas consideraciones a altas concentraciones de sustrato, todos los sitios activos de la enzima estn ocupados y por lo tanto la velocidad alcanza un mximo. El modelo propuesto sirve de base para explicar las propiedades de la mayora de las enzimas y, como se dijo antes, asume la existencia de un complejo ES como intermediario en la catlisis. Se debe considerar tambin un solo sustrato que se convierte en un nico producto. Una enzima E se combina con un sustrato S para formar el complejo ES, con una constante de velocidad para dicha reaccin, k1. Este complejo ES puede seguir dos caminos: a) puede proceder para formar el producto (P) con una constante de velocidad k3; b) puede tomar el camino alternativo disocindose, generando nuevamente E y S con una constante de velocidad k2 (ecuacin 4).
k1 E + S k2 ES k4 k3 E + P {ecuacin 4}

La velocidad de la reaccin (v) catalizada enzimticamente ser:

v = k3 [ES]

{ecuacin 5}

El valor [ES] no es fcilmente estimable de modo que se necesita una expresin equivalente con valores conocidos. En base al modelo y mediante varias simplificaciones Michaelis y Menten relacionaron la velocidad catalizada enzimticamente con la concentracin de sustrato como sigue:
v= Vmax [S] Km + [S] {ecuacin 6}

En donde: [S] es la concentracin de sustrato inicial, v es la velocidad inicial, Vmax y Km son parmetros cinticos de la reaccin, donde Vmax es la velocidad mxima y Km es la constante de Michaelis-Menten para ese sustrato. El valor de Km guarda relacin inversa con la afinidad de la enzima por el sustrato, como veremos ms adelante.
vr Vmax

concentracin saturante de sustrato

Vmax

Km

[sustrato]

Figura 4. Relacin entre velocidad de reaccin y concentracin de sustrato. Para una reaccin catalizada por una enzima que sigue la cintica de Michaelis-Menten.

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Efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente. Obtencin del Km y la Vmax A continuacin trataremos de entender el significado de los parmetros Vmax y Km. Se sabe que un aumento de la concentracin de substrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir. Adems, a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reaccin y se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. De manera ms precisa se puede observar experimentalmente que la relacin entre v y [S] es una hiprbole. Una propiedad importante de esta relacin hiperblica es que a medida que la concentracin de substrato [S] tiende al infinito, la velocidad de reaccin (vr) tiende hacia un valor mximo (Vmax) que depende de las molculas enzimticas y, por tanto puede incrementarse aadiendo ms enzimas. Esta es una caracterstica fundamental de las reacciones catalizadas enzimticamente. Para valorar las consecuencias de la relacin entre v y [S] y examinar el significado de Km y Vmax, vamos a considerar tres casos especiales de concentracin de sustrato: concentracin de sustrato muy baja, concentracin de sustrato muy elevada y el caso especial de Km = [S] (Figura 5). Caso 1, concentracin de sustrato muy baja, [S] < Km: a concentracin de sustrato muy baja, el valor de [S] es despreciable comparado con el valor de Km en el denominador de la ecuacin, por lo que la ecuacin de Michaelis-Menten quedara como sigue:
Vmax [S] v= Km

{ecuacin 7}

Por lo tanto, a concentracin de sustrato muy baja, la velocidad inicial de reaccin vr es ms o menos proporcional a la concentracin de sustrato. Esta es por tanto, la regin de primer orden de la grfica de Michaelis-Menten, donde la velocidad de reaccin catalizada enzimticamente aumenta casi linealmente con la concentracin del sustrato (Figura 5). Caso 2, concentracin de sustrato muy alta, [S] > Km: a concentracin de sustrato [S] muy alta el Km se hace insignificante comparado con [S], en el denominador de la ecuacin de Michaelis-Menten:
Vmax [S] v=

[S]

{ecuacin 8}

Esto significa que a concentraciones de sustrato muy altas, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente es independiente de la variacin de la concentracin de sustrato [S], volvindose casi constante. Esta constituye la regin del orden cero de la representacin de Michaelis-Menten, donde la velocidad de reaccin no se ve afectada por los cambios en la concentracin del sustrato permaneciendo casi constante con valores prximos a los de Vmax. Ahora definiremos Vmax. Es el valor lmite superior al cual tiende la velocidad inicial de reaccin cuando [S] tiende al infinito. Es la velocidad a concentracin saturante de sustrato. En estas condiciones todas las molculas de enzimas estn ocupadas con el proceso de catlisis. Donde la nica manera que la Vmax pueda aumentar es incrementando la concentracin de la enzima (Figura 5).

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Caso 3, [S] = Km: con lo que vimos en los casos anteriores nos resta definir el parmetro Km. Parece ser que el Km es un punto de referencia en la escala de [S] para definir cuando la reaccin es de primer orden o de orden cero en una reaccin bioqumica dada. Para ello analizaremos el caso especial en el que la [S] es exactamente igual al Km:
Vmax [S] v= 2 [S] Vmax

{ecuacin 9}

Esta ecuacin nos proporciona la definicin para Km. Es la concentracin de sustrato para la cual la reaccin tiene lugar a la mitad de la Vmax. Esta concentracin es un valor fijo para cada enzima que cataliza una reaccin determinada bajo condiciones especficas y se denomina constante de Michaelis o Km (Figura 5).
vr Vmax orden 0 orden mixto Vmax

orden 1

[S] < Km [S] = Km

[S] > Km

[sustrato]

Figura 5. Casos especiales de concentracin de sustrato y relacin entre Vmax y Km, donde se observan las reacciones de diferentes rdenes.

Mientras ms pequeo sea el valor de Km, mayor ser la afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, ste ser transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad (Figura 5).

Formas ms adecuadas para determinar los parmetros Km y Vmax La grfica de Michaelis-Menten no permite la determinacin cuantitativa de los parmetros cinticos. Aunque puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son ms tiles para la expresin de los datos experimentales. Una forma ms adecuada de determinar Km y Vmax son mediante las representaciones de Lineweaver-Burk, la cual consiste en invertir los datos de ambos lados de la ecuacin de Michaelis-Menten (v y [S]). La espresin resultante corresponde a la ecuacin de una recta:
y = a.x

1 v =

Km Vmax

( )
1 [S]

Vmax

{ecuacin 10}

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Midiendo las velocidades para distintas concentraciones de sustrato y representando grficamente (al lado) obtendremos una grfica del tipo lineal (Figura 6). En este grfico doble inverso se representa 1/v frente 1/[S] que corresponde a la inversa de la ecuacin de Michaelis-Menten. De la ecuacin anterior podemos obtener los valores de 1/Vmax en la interseccin con el eje y (y = 0) y -1/Km en la interseccin con el eje x (x = 0). La pendiente de la recta es Km/Vmax.
1/vr

Km /Vmax

1/Vmax

1/[S]
- 1/Km
Figura 6. Representacin doble recproca de Lineweaver-Burk. Permite calcular los valores de Km y Vmax.

Expresin de la actividad enzimtica La cantidad de enzimas presentes en un fluido biolgico es muy difcil de determinar en valores absolutos, mg o moles. Una forma de resolver este problema es midiendo la velocidad de reaccin catalizada por la misma enzima empleando un sustrato especfico. La velocidad de reaccin puede expresarse como la cantidad de reactivo que se transforma en producto por unidad de tiempo. De all que la unidad internacional (UI) de cualquier enzima se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un mol de sustrato por minuto, bajo condiciones definidas: pH, temperatura, concentracin de sustrato/s y cofactores, etc. En base a lo que se acaba de explicar es posible expresar la cantidad de una enzima en un fluido biolgico en UI .cm-3 o en UI .mg de protena total (PT)-1. Esta ltima expresin denominada actividad especfica es la cantidad de moles de sustrato transformados por minuto y por mg de protena, debindose indicar la temperatura, el pH, etc. Es decir: Actividad especfica: moles de sustrato transformados .min-1.mg PT-1. Es importante recordar que la actividad especfica de una enzima es una medida indirecta de la fraccin de la protena total en una preparacin que contienen a la enzima.

Clasificacin Internacional de las Enzimas Una forma general de denominar a la mayora de las enzimas es aadir el sufijo "asa" al nombre del sustrato. As, por ejemplo, la ureasa es la enzima que cataliza la hidrlisis de la urea formando amonaco y CO2. Otras reciben el nombre de acuerdo a la funcin que cumplen, por ejemplo, la ADN polimerasa cataliza la sntesis de ADN. Sin embargo con el descubrimiento de nuevas enzimas esta nomenclatura muchas veces resulta confusa. 140

Actualmente se ha adoptado ciertas recomendaciones de la International Enzyme Comission (IEC), que pretende sistematizar la nomenclatura y clasificacin de las diferentes enzimas conocidas. Este sistema divide a las enzimas en seis clases que, a su vez, pueden tener diferentes subclases. xido-reductasas: catalizan reacciones de oxido-reduccin (transferencia de electrones) y actan sobre grupos CH OH; C = O; C = CH ; CH NH2; CH NH . Hidrolasas: catalizan reacciones de hidrlisis de steres, enlaces glucosdicos, enlaces peptdicos, otros enlaces C N y anhdridos de cido. Transferasas: catalizan reacciones de transferencia de grupos funcionales, como grupos de un tomo de C, grupos aldehdos o cetonas, grupos acilos, grupos glucosilos, grupos fosfato y grupos que contienen azufre. Liasas: catalizan reacciones de adicin a los dobles enlaces C = C; C = O y C = N . Isomerasas: catalizan transferencia de grupos entre las molculas para producir formas isomricas. Ligasas: catalizan la formacin de uniones C C; C S; C O y C N por medio de reacciones de condensacin acopladas al clivaje del ADN.

Cofactores Algunas enzimas dependen para su actividad cataltica, adems de la estructura proteica, de otras molculas de naturaleza no proteica. Estas estructuras reciben el nombre de cofactores. Como se seal anteriormente, estos cofactores se localizan en el sitio activo de la enzima. Los cofactores son termoestables y de bajo peso molecular. Se une a la apoenzima (estructura proteica) para formar el complejo apoenzima-cofactor, denominado holoenzima. Los cofactores pueden ser iones metlicos o molculas orgnicas, las cuales reciben el nombre de coenzimas. Generalmente, los iones metalicos ms frecuentes son: Fe+2, Cu+2, Mn+2, Mg+2, Mo, K+, entre otros. Las coenzimas, a diferencia de las enzimas, se modifican y consumen durante la reaccin qumica. Estas aceptan o donan electrones o grupos funcionales, que transportan entre las enzimas. Las coenzimas pueden estar dbil o estrechamente unidas a la enzima, aquellas que estn fuertemente unidas reciben el nombre del grupo prosttico. Un ejemplo clsico lo constituye el grupo hemo del citocromo C, unido covalentemente a la protena. Otras coenzimas que se unen dbilmente son NADPH + H (nicotinamida adenina dinucletido fosfato reducido), NAD (nicotinamida adenina dinucleotido), FAD (flavina adenina dinucletido), que cuentan entre las principales coenzimas, y las vitaminas y derivados, piridoxal, biotina, tiamina, cido tetra hidroflico, cobalamina. Este tipo de reaccin se ver ms adelante, en los procesos de fotosntesis y ciclos metablicos en la clula vegetal.
Iones metlicos Cofactor Coenzima (molculas orgnicas complejas)

Apoenzima + iones metlicos Holoenzima Apoenzima + coenzima

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Inhibicin Enzimtica La actividad enzimtica puede ser disminuida o eliminada por la accin de ciertas sustancias a las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores enzimticos. La inhibicin enzimtica es muy importante principalmente porque desempea un papel vital como mecanismo de control en todas las clulas. Mediante el uso de inhibidores enzimticos se ha obtenido informacin muy valiosa sobre la conformacin del centro activo de algunas enzimas. El proceso de inhibicin enzimtica es til para comprender los mecanismos de accin txica y farmacolgica de algunos compuestos. Si bien, se conoce que los inhibidores son agentes qumicos capaces de inhibir la accin cataltica de las enzimas, estos agentes pueden ejercer su accin unindose a sitios o grupos funcionales esenciales de la enzima. Podemos distinguir dos tipos de inhibidores: 1) Inhibidor Irreversible: el cual forma un enlace covalente con las enzimas con deterioro definitivo de su capacidad cataltica. Por ello, normalmente son txicos para las clulas. Por ejemplo, los venenos rganofosforados como el fluorofosfato de di-isopropilo (DFP) que forma un complejo irreversible con la enzima acetil-colinesterasa. Los animales envenenados con este gas quedan paralizados debido a la imposibilidad de transmitir adecuadamente los impulsos nerviosos. Ciertos iones de metales pesados como el plomo, mercurio y arsnico inhiben enzimas que tienen en su centro activo grupos -SH libres. 2) Inhibidor Reversible: se una a la enzima de forma no-covalente, existiendo un equilibrio entre las formas libres y unidas al inhibidor, la cantidad de enzima activa en la clula, depende de la concentracin de inhibidor. Este tipo de inhibidores reduce la actividad enzimtica a travs de diferentes mecanismos: a) Inhibicin Competitiva. En este tipo de inhibicin tanto el sustrato como el inhibidor pueden unirse al sitio activo de la enzima. Si bien el inhibidor puede impedir la unin del sustrato con la enzima, nunca podr formar producto como el sustrato. Estos efectos se alcanzan por diferentes mecanismos: - El inhibidor (I) presenta similitud estructural con el sustrato (Figura 7) y ambos compiten por el sitio activo. Aumenta el Km (I no tienen tanta afinidad como el sustrato) pero no modifica la velocidad mxima de la enzima (Figura8). - Los inhibidores a pesar de no mostrar similitud estructural con el S compiten unindose al sitio activo de la enzima.
sitio activo
productos

el inhibidor se une a la enzima en el sitio activo

inhibidor

enzima

sustrato

Figura 7. Inhibicin competitiva. El sustrato y el inhibidor compiten por el sitio activo debido a su similitud estructural.

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vr Vmax

Vmax

inhibidor

Km

Km con inhibidor

[sustrato]

Figura 8. El inhibidor competitivo modifica la especificidad de la enzima por el sustrato (Km).

b) Inhibicin No Competitiva. Como se puede observar en la Figura 9, el inhibidor se une a la superficie de la enzima en un sitio diferente al sitio activo, donde se une el sustrato. El inhibidor no interfiere en la unin del sustrato pero si disminuye la velocidad mxima sin modificar el Km , (Figura 10). Esto porque la unin del inhibidor con su sitio especfico reduce o suprime la actividad cataltica en el sitio activo.
en ausencia del inhibidor se forman los productos

enzima inhibidor

sustrato
el inhibidor produce un cambio en el sitio activo

sitio del inhibidor

sitio activo

Figura 9. Inhibicin no competitiva. El inhibidor se une a la enzima en un sitio diferente al sitio al sitio activo donde se une el sustrato.

143

vr

Vmax
Vmax inhibidor

Km

[sustrato]

Figura 10. El inhibidor no competitivo modifica la Vmax de la reaccin.

Enzimas alostricas El modelo de Michaelis-Menten ayud mucho al desarrollo de la qumica de las enzimas gracias a su simplicidad y aplicabilidad. Sin embargo, este modelo no explica las propiedades cinticas de muchas enzimas. Un grupo de enzimas que no obedecen la cintica de Michaelis-Menten son las enzimas alostricas. Estas enzimas son protenas grandes, formadas por varias subunidades, o sea que presentan varios sitios activos. Pueden presentar dos tipos de mecanismo: cooperatividad por sustrato homoaloterismo y una regulacin de la actividad enzimtica por otras molculas efectoras (no sustrato) conocida como heteroaloterismo En las enzimas alostricas con cooperatividad por sustrato la unin de un sustrato a un sitio activo puede afectar los otros sitios activos de la enzima. Algunas enzimas muestran cooperatividad positiva, en la cual la unin de una molcula de sustrato a un sitio activo incrementa la afinidad de los restantes sitios activos por ms sustrato. En estos casos, la enzima que se une al sustrato se comportar a concentraciones bajas de sustrato, como si se uniera mal al mismo, es decir como si tuviera un KM elevado. Pero cuando aumenta la concentracin de sustrato y hay una mayor cantidad de sustrato unida, la enzima pasa a ser cada vez ms eficaz ya que une al sustrato con mayor avidez en los lugares que quedan por ocupar (Figura 11).
sitio activo sitio alostrico productos

sustratos subunidad enzimtica

la unin de un sustrato favorece la unin de otros en la misma enzima

Figura 11. Homoalosterismo. Cooperatividad al sustrato positiva, la unin de un sustrato a una subunidad de la enzima favorece la unin de ms sustrato en los restantes sitios activos de la misma enzima.

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Otras enzimas muestran cooperatividad al sustrato negativa, en la cual la unin de una molcula de sustrato a un sitio activo disminuye la afinidad de los otros sitios activos de la enzima. En estos procesos de homoalosterismo, la enzima est regulada por su sustrato y permite un control ms estricto a nivel de sustrato. Un ejemplo es la leghemoglobina presente en los ndulos activos de leguminosas que permite una concentracin constante de O2 para evitar el dao del complejo nitrogenasa. Por otro lado, la actividad de una enzima alostrica puede estar aumentada o disminuida por una sustancia reguladora, llamada efector alostrico, que no es ni el sustrato, ni el producto inmediato, y produce un efecto positivo o negativo en la unin al sustrato (Figura 12a y b) .Estos reguladores alostricos se unen de manera reversible y no covalente en un sitio distinto al sitio activo, llamado sitio alostrico (allos= otra, steros= forma) el cual, al igual que el sitio activo, est presente uno en cada subunidad de la enzima. La unin del efector a la enzima produce un cambio conformacional en el sitio activo. En este caso hablamos de heteroalosterismo. Este tipo de alosterismo es el ms importante como mecanismo de control de las necesidades celulares.
a)
sitio activo sitio alostrico

producto

activador alostrico

sustrato
la unin del activador favorece la unin del sustrato

b)

sitio activo

sitio alostrico

inhibidor alostrico

sustrato
la unin del inhibidor modifica la conformacin del sitio activo y no permite la unin del sustrato

Figura 12. a) activacin alostrica. La unin de un activador alostrico aumenta la afinidad de la enzima por su sustrato; b) inhibicin alostrica. La unin de un inhibidor resulta en baja o nula actividad de la enzima.

En una va metablica, donde un sustrato A da como producto final P, cuando la enzima (E) que cataliza la primera etapa de la serie es inhibida por el producto final de la misma, se llama inhibicin por retroalimentacin (feed-back), como se puede observar en la ecuacin 11. As, las propiedades catalticas de las enzimas alostricas pueden ajustarse para cumplir con las demandas inmediatas de la clula. De manera ms general, la retroinhibicin sucede cuando un producto metablico inhibe a una de las enzimas implicadas en la va por el cual

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dicho producto es sintetizado. Estos casos sern revisados ms adelante en regulacin del metabolismo.
A E1 B E2 C E3 D E4 P

{ecuacin 11}

X Podemos concluir que el alosterismo es una de las principales formas de regulacin en la clula debido a que puede producir cambios rpidos y fcilmente reversibles en la actividad de las enzimas. Por ltimo, las enzimas con un comportamiento alostrico no muestran la curva tipo hiprbole caracterstica de las enzimas Michelianas, por el contrario las enzimas alostricas muestran una dependencia sigmoidal de la velocidad de reaccin (vr) en funcin de la concentracin de sustrato [S] como se observa en la Figura 13. El sustrato se acumula fcilmente hasta la concentracin crtica, con concentracin menor de sustrato la enzima es inactiva. Cuando la concentracin de sustrato sea cercana a la crtica, la enzima aumentar su actividad. Por encima de dicha concentacin el sustrato ser procesado con gran rapidez.

vmx

vr

Enzima poco eficaz

Enzima muy eficaz

[sustrato]c

[sustrato]

Figura 13. Cintica de las enzimas alostricas. Por debajo de la concentracin crtica de sustrato la enzima es casi inactiva, y por encima de la misma es muy activa.

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