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Profesora T.

M JIMENA LE ROY

Un nanmetro es la millonsima parte de un milmetro: 1nm = 10-9 metros.

Las muestras pueden ser obtenidas por:

Frotis Aspiracin y/o lavado puncin aspiracin con aguja fina impronta biopsia puncin con trocar autopsia.

PROCESAMIENTO DEL TEJIDO


Pasos a seguir 1. 2. 3. 4. 5. Fijacin Deshidratacin Inclusin Corte Coloracin

Puncin con aguja

FROTIS

biopsia

Obtencin de la muestra

Para fijar las muestras se emplean dos procedimiento: FIJACIN POR INMERSIN :
muestra debe realizarse inmediatamente de ser extraida del ser vivo (biopsia) o inmediatamente despus de la muerte (necropsia).

FIJACION POR PERFUSIN: tcnica ideal para animales de experimentacin

Consolidar una disposicin espacial existente creando enlaces entre molculas vecinas que soporten la manipulacin posterior.

La fijacin debe
Detener los procesos de autlisis. Especialmente la accin de proteasas y nucleasas Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado in vivo. Preparar al tejido para los procedimientos posteriores Agente Anti-microbiano

Laboratorio de Ciencias Morfolgicas Universidad de Valparaso

Mtodos Fsicos Mtodos Qumicos

Aplicacin de calor Microondas

Aplicacin de fro

MTODOS FSICOS DE FIJACIN

CONGELACIN

CO2 NITRGENO REFRIGERACIN A-70

DIRECTA

Buena conservacin de la morfologa Se conservan sustancias solubles en agua Se conservan molculas pequeas Permite post fijacin

CONGELACIN
Trozos pequeos o Paso por isopentano o Nitrgeno lquido o Transporte a cmara fra

No es una fijacin propiamete No hay insolubizacin de protenas Complementar con vapores de formol

CALOR Coagulacin de protenas Disolucin de lpidos Baja conservacin del tejido Conservacin de ncleos Conservacin de microrganismos

Es necesario congelar una biopsia


Para biopsia contempornea Identificacin lpidos Para identificar enzimas

Algunas tcnicas argnticas Para tcnicas de inmuno fluorescencia

Estabilizacin de proteinas, lipoprotenas, ac nucleicos y mucosustancias Producen dureza del tejido

Mtodos Qumicos

Convierte citoplasma en un gel insoluble Conserva organelos Penetracin + lenta de medios de inclusin

Mtodos Qumicos

Convierte citoplasma en un gel insoluble Conserva organelos Penetracin + lenta de medios de inclusin

Formaldehdo

Glutaraldehdo Tetrxido de Os

Mtodos Qumicos

Coagulacin de prot. Citoplasmticas Destruccin o distorsin de organelos mejor penetracin de inclusin en parafina

Mtodos Qumicos

Coagulacin de prot. Citoplasmticas Destruccin o distorsin de organelos mejor penetracin de inclusin en parafina Etanol Metanol, Acetona A. Tricloroactico A. Pcrico Cloruro mercurio

INMUNOHISTOQUIMICA

Patrn nuclear

INMUNOHISTOQUIMICA

Patrn extracelular fijacin de matriz

Que induzca cambios los menores cambios conformacionales en nuestro tejido No enmascare estructuras provoque la menor difusin, Provoque la menor extraccin o desplazamiento de Permita la penetracin tinciones posteriores Buena morfologa Baja toxicidad, Estabilidad en su almacenamiento Sea econmico.

Cualidades de un fijador:
1.- Fijar la clulas antes que aparezcan fenmenos post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.) 2.- Poseer alto poder de penetracin para fijacin correcta en las capas profundas de la pieza

Cualidades de un fijador:
1.- Fijar la clulas antes que aparezcan fenmenos post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.) 2.- Poseer alto poder de penetracin para fijacin correcta en las capas profundas de la pieza

3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo 4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observacin ulterior

Cualidades de un fijador:
1.-Fijar la clulas antes de que aparezcan los fenmenos post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.) 2.- Poseer alto poder de penetracin para fijacin correcta en las capas profundas de la pieza 3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo 4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observacin ulterior

5.- Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante o despus de ella. 6.- No provocar la produccin de estructuras artificiales.

Cualidades de un fijador:
1.-Fijar la clulas antes de que aparezcan los fenmenos post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.) 2.- Poseer alto poder de penetracin para fijacin correcta en las capas profundas de la pieza 3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo 4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observacin ulterior 5.-. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante o despus de ella. 6.- No provocar la produccin de estructuras artificiales.

7.- No retraer excesivamente los tejidos 8.- No volverlos friables o quebradizos.

Laboratorio de ciencias Morfolgicas Universidad de Valparaso

3.- Conservar detalles estructurales que presentaban in vivo 4.- Permitir uso de procedimientos necesarios para observacin ulterior

3.- Conservar detalles estructurales que presentaban in vivo 4.- Permitir uso de procedimientos necesarios para observacin ulterior

Laboratorio de Ciencias Morfolgicas Universidad de Valparaso

Laboratorio de Ciencias Morfolgicas Universidad de Valparaso

5.-. Impedir la solubizacin de los elementos durante o despus de ella.

5.-. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante o despus de ella.

Laboaratorio Ciencias Morfolgicas Universidad de Valparaso

1.-Fijar la clulas antes de que aparezcan los fenmenos post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.)

Temperatura / Tiempo de fijacin Tamao de la muestra Volumen de fijador

FIJADORES A BASE DE FORMOL

Histologa en general Formol neutro Formol buffer Formol alcalino Formol Ca etc Estudios histolgicos Sistema nervioso Impregnaciones argnticas Tejido seo Identificacin de fosfolpidos protenas

Fijador de tipo coagulante, poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras. La ms usada es la mezcla de Bouin. Provee buena morfologa. Su uso se recomienda para estudio de inmunoglobulinas, filamentos intermedios y hormonas.

CIDO PCRICO

Forma picratos: Sales, unindose anin con grupos bsicos de protenas Los picratos son solubles en agua Se recomienda paso posterior en OH 80 El alcohol coagula finalmente picratos de las protenas Hidroliza los cidos nucleicos Fijaciones prolongadas destruyen el tejido

FIJADORES A BASE DE FORMOL Y C PCRICO

BOUIN HOLLANDE ALLEN DUBOSQ BRASIL GENDRE ROSSMAN

BOUIN

HOLLANDE

ALLEN

ESTUDIOS TOPOGRFICOS ESTUDIOS CITOLGICOS DA BUENAS COLORACIONES TRICRMICAS

HIDRATOS DE CARBONO EN GENERAL

BOUIN - HOLLANDE - ALLEN - DUBOSQ BRASIL CONTRA INDICACIONES :

Tejidos hemorrgicos

Sistema nervioso Reaccin de Feulgen

Dubosq Brasil Bouin alcohlico Alcohol 80... 150 cc Formol 60 cc. AC. Actico glacial. 15 cc. AC. Pcrico 1 gr. Tiempo de fijacin de 4 a 24 horas lavado posterior en alcohol de 80 3 horas.

DUBOSQ BRASIL

HISTOLOGIA EN GENERAL

MAS PENETRANTE QUE EL BOUIN

ESPECIAL PARA PUNCIONES BIOPSIAS DE HGADO, RENALES Y TESTCULO EN GENERAL PARA ESTRUCTURAS FINAS

GENDRE -

ROSSMAN

HISTOLOGA DE POLISACRIDOS

IDEAL PARA GLICGENO

CIDO ACTICO y MEZCLAS FIJADORAS

No fija protenas Coagula la cromatina nuclear Usado en mezclas fijadoras

Un agenta oxidante transfiere tomos de oxgeno al sustrato. el agente oxidante puede ser descrito como un agente oxigenante o un agente de transferencia de tomos de oxgeno. Algunos ejemplos son :

o anin permanganato MnO4o cromato

CrO4de osmio, OsO4.

o tetrxido

todos estos compuestos son xidos, ms concretamente polixidos. En algunos casos, estos xidos pueden utilizarse como aceptores de electrones, como en la reaccin de conversin de permanganato MnO4- a mangato MnO42-

Eliminacin de residuos

o El cido pcrico es explosivo en forma no hidratada. o Cuando las soluciones que contengan cida sdica sean eliminadas por desage lavaremos este dejando correr mucha agua para evitar que esta reaccione con el metal de las caeras y lo haga explosivo. La formalina debe eliminarse en recipientes para ser destruda o Las soluciones de mercurio DEBEN tienen su propio contenedor: Si se tiran por el desage se forman resistentes amalgamas con el metal de las caeras.

FIJADORES A BASE DE ALCOHOL

ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY ALFAC - METACARN

Histologa en general citologa glicgeno Mucopolisacridos cidos

R.N.A.

FIJADORES A BASE DE ALCOHOL


ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - ALFAC

GLICGENO PIGMENTOS ETANOL PROTENAS SUSTANCIAS INORGNICAS

SISTEMA NERVIOSO
Altera morfologa de lpidos

Poco penetrante Fijador coagulante Buena penetracin de inmunoreactivos Puede inducir a cambios conformacionales Endurece los tejidos Morfologa regular

FIJADORES A BASE DE ALCOHOL


ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - ALFAC- METACARN

Histoqumica enzimtica Acetona Altera morfologa

cido ribonucleico Metanol Altera morfologa de lpidos

FIJADORES A BASE DE ALCOHOL


ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - METHACARN - ALFAC

FRAGMENTOS TISULARES BUEN FIJADOR NUCLEAR CARNOY CORPSCULOS DE NISSL GLICGENO R.N.A. Altera citoplasma Produce lisis de glbulos rojos

Alcohol metlico
se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados sangre, mdula sea, Ganglio bazo, lquidos de puncin,

FIJACIN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO


es necesario evitar que se disuelvan en agua: extraer el agua mediante fijadores cuya avidez por el agua sea mayor que ellos ALCOHOL E tlico al 70% ACETONA Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los endurecen para el procesamiento posterior.

CLORURO DE MERCURIO

HgCl2

H2O

HO

Hg

Cl + H+ + Cl-

Forma precipitado probablemente cloruro mercurioso Que debe ser removido Solucin de yodo Tiosulfato de Sodio Tiempos excesivos de fijacin provocan corrosion del tejido.

Poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras: ZENKER; FORMOL SUBLIMADO; B5, etc. Aditivo y coagulante Excelente morfologa B5 recomendado especialmente para la fijacin de ganglios linfticos.

FIJ. A BASE DE METALES PESADOS ZENKER - HELLY- FORMOL SUBLIMADO Conserva morfologa Conserva histologa Tincin nuclear rganos hematopoyticos No se recomienda para histoqumica Necesario paso por alcohol yodado

FIJ. A BASE DE METALES PESADOS

CONSERVA MORFOLOGA HISTOLOGA FINA CITOLOGA ZENKER Favorece tincin nuclear FAVORECE TINCION FIBRAS COLGENAS Recomendado para rganos hematopoyticos

Acenta tincin citoplasmtica con colorantes cidos

SUSA (cloruro de mercurio) ESPECIAL PARA GANGLIOS ENDOMETRIO ESTRUCTURAS FIBRILARES AGENTE DESCALCIFICADOR

FIJADORES A BASE DE CROMO ORTH - ZENKER - REGAUD

Tejidos cromafines Citologa : mitocondrias, mitosis Fosfolpidos

FIJ. a BASE DE TETRXIDO de Os


o cido smico

CITOLOGA SISTEMA NERVIOSO GRASAS NO SATURADAS MICROSCOPA ELECTRNICA Costo muy elevado Reduccin rpida a luz Vapores irritantes

ACIDO SMICO se usa siempre como tetrxido de osmio (OsO4) en solucin acuosa al 1 o 2% disolucin demora de 6 a 12 horas, se conservar en oscuridad. poco capacidad de penetracin por lo que el tejido ser de 2 a 3 mm. ` TIEMPO DE FIJACIN: de 6 a 24 horas lavar con abundantemente en agua.

Se reduce fcilmente con la luz y en contacto con impurezas, por ello el material de vidrio usada debe necesita lavado qumico. evitar sus vapores por lo que debe salvaguardar especialmente los ojos.

ACIDO SMICO

es el fijador ideal para microscopa electrnica. pues se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lpidos de las membranas plasmticas. adems el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tincin).

FIJACIN DE LOS LIPIDOS : es necesario evitar su oxidacin bloqueando los lugares donde existen enlaces

- CH=CH

mediante sustancias como tetrxido de Osmio

TETRXIDO DE OSMIO

Para la FIJACIN DE LOS LIPIDOS es necesario evitar su oxidacin (o enranciamiento) bloqueando los lugares donde existen enlaces - CH=CH -

ACIDO SMICO Imprescindible para fijar mielina. Permite coloraciones complementarias con hematoxilina, safranina, fucsina.

A BASE DE URANIO - CADMIO - COBALTO CAJAL - AOYANA - DE FANO

Aparato reticular de Golgi

Escasa penetracin

JIMENA LE ROY B TECNLOGO MDICO

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