Calorimetria Diferencial de Barrido

Francisco Conejero Lara, Obdulio Lpez Mayorga y Mourad Sadqi. Departamento de Qumica Fsica.
Universidad de Granada.

39
Este documento corresponde a los materiales y mtodos de la memoria ESTUDIO
TERMODINMICO DE LOS ESTADOS PARCIALMENTE PLEGADOS DEL
DOMINIO SH3 DE -ESPECTRINA, presentada para aspirar al grado de Doctor en
Ciencias Qumicas por Mourad Sadqi, visada en Granada, a 8 de septiembre de 2000 y
codirigida por los profesores Obdulio Lpez Mayorga y Francisco Conejero Lara.

3.1. CALORIMETRIA DE DIFERENCIAL DE BARRIDO.

3.1.1. Introduccin a la calorimetra diferencial de barrido.

La calorimetra diferencial de barrido (CDB) es generalmente considerada hoy en
da como la tcnica ms adecuada para estudiar la energtica de las transiciones de
plegamiento-desplegamiento de las protenas. Esta tcnica permite la caracterizacin
termodinmica de los cambios conformacionales inducidos por cambios de temperatura en
protenas (Privalov y Khechinashvili, 1974; Privalov y Potekhin 1986), cidos nucleicos
(Privalov y Filimonov, 1978) y biomembranas (Mabrey y Sturtevant, 1978; Bach y
Chapman, 1980). Revisiones detalladas sobre los aspectos ms interesantes de la CDB
pueden encontrarse en las siguientes referencias: Privalov, 1979, 1982, 1989; Mateo, 1984;
Sturtevant, 1987; Sanchez-Ruiz y Mateo 1987; Chowdry y Cole, 1989; Freire et al., 1990,
Cooper et al., 1994 a y b; Sanchez-Ruiz, 1995.
En un experimento de calorimetra diferencial de barrido se registra de forma
continua la capacidad calorfica aparente de una disolucin de protena o de cualquier
macromolcula en funcin de la temperatura, obtenindose lo que comnmente se
denomina termograma. ste generalmente est caracterizado por un pico de absorcin de
calor correspondiente a un proceso o transicin trmicamente inducida, por lo que, de
acuerdo con el segundo principio de la termodinmica (supuesto el proceso de equilibrio),
corresponde a un proceso endotrmico.
La informacin fundamental que proporciona la CDB es la capacidad calorfica
relativa de un sistema en funcin de la temperatura. El procesamiento subsiguiente de esta
magnitud nos puede proporcionar una caracterizacin termodinmica completa del proceso
investigado. En general, hay tres tipos de informacin que se pueden obtener a partir de la
CDB:
1. La capacidad calorfica parcial absoluta del compuesto de inters.

40
2. Los parmetros termodinmicos globales (los cambios de entalpa [H], de entropa
[S], de energa de Gibbs [G] y de la capacidad calorfica [C
p
]) asociados a la
transicin inducida por temperatura.
3. La funcin de la particin y concomitantemente la poblacin de los estados
relevantes del sistema y sus parmetros termodinmicos.

3.1.2. El calormetro diferencial de barrido.

Desde hace ms de dos dcadas la microcalorimetra se ha utilizado cada vez ms
para la caracterizacin termodinmica de biopolmeros de varios tipos, particularmente
protenas y polinucletidos. El rpido crecimiento del uso de las tcnicas
microcalorimtricas en esta rea de investigacin puede deberse en parte a la
disponibilidad de instrumentos de cada vez mayor sensibilidad, capaces de detectar los
pequeos calores puestos en juego durante los procesos implicados, y tambin en parte a su
mayor fiabilidad y facilidad de uso. An as, se contina realizando un esfuerzo para
mejorar los microcalormetros tratando de lograr una sensibilidad an mayor que permita
el uso de cantidades menores de materiales biolgicos muy valiosos, lo cual abrira nuevas
reas de aplicacin.
Varias compaas comercializan calormetros diferenciales de barrido en la
actualidad. Todos estos microcalormetros tienen en comn varias caractersticas; la ms
importante, por la cual se denominan microcalormetros diferenciales de barrido, es que la
medida de la capacidad calorfica se hace en modo diferencial (se mide la diferencia de
capacidad calorfica entre dos clulas lo ms idnticas posible) y de una manera continua,
es decir, calentando o enfriando la muestra a una velocidad constante. La principal
desventaja de este modo de operacin es que la muestra nunca est estrictamente en
equilibrio trmico (en este aspecto el diseo de las clulas es fundamental).
Otras caractersticas comunes que presentan los microcalormetros diferenciales de
barrido utilizados actualmente son:
1) No poseen agitacin mecnica para evitar aportar cantidades de calor por efecto
Joule que podran ser mayores, incluso, que el efecto calorfico medido si el
lquido tiene una elevada viscosidad.
2) Funcionan de modo adiabtico, como veremos a continuacin.

41
3) El conjunto de clulas es fijo (no desmontable), lo que permite una mayor
reproducibilidad en los datos.

En general, un microcalormetro de CDB consiste bsicamente en dos clulas
gemelas, una acta de referencia (que se llena con la disolucin tampn en la que se dializa
la biomolcula), y la otra contiene la muestra (la disolucin de biomolcula en el tampn
de referencia), ambas situadas simtricamente dentro de un caparazn metlico diseado
para crear un entorno casi adiabtico. La temperatura de este caparazn se controla a travs
de termosensores y efectores apropiados para que est en todo momento muy prxima a la
temperatura de las clulas. Una termopila de elevada sensibilidad (mltiples uniones
bimetal o de semiconductor) mide la diferencia de temperatura entre las clulas
calorimtricas.
Al comenzar un barrido se disipa la misma potencia trmica en cada clula
mediante la apropiada intensidad de corriente que alimenta a dos resistencias elctricas de
valor idntico, en ntimo contacto trmico con la superficie de cada clula; el valor de esta
corriente est fijado por la velocidad de barrido seleccionada. La medida de la diferencia
de capacidad calorfica se realiza utilizando un mtodo de compensacin simtrica. Este
mtodo consiste en un sistema de retroalimentacin que usa como seal de error la seal
elctrica generada por la termopila de clulas cuando se produce algn efecto trmico en
una de ellas; el lazo de control se cierra disipando en la resistencia calefactora de la clula
mas fra la potencia trmica necesaria para reestablecer la igualdad de temperaturas. De
esta forma las dos clulas se mantienen prcticamente a la misma temperatura durante todo
el barrido. Para una velocidad de barrido constante el exceso de potencia disipada en la
clula de medida es directamente proporcional a la diferencia de capacidad calorfica entre
ambas clulas y constituye la magnitud fundamental medida en este instrumento.
Existen varios modelos comerciales de estos microcalorimetros; los ms utilizados
en los ltimos aos eran el DASM-1 y el DASM-4 de fabricacin rusa, pero, tras la
suspensin de la fabricacin de estos instrumentos y con la aparicin en el mercado del
modelo VP-DSC de Microcal Inc., parece ser este ltimo calormetro la mejor opcin
como instrumento de alta sensibilidad, adecuado para estudiar biopolmeros en disolucin.
Para el desarrollo de los experimentos calorimtricos incluidos en este trabajo se han
utilizado dos modelos de calormetro: el DASM-4, que se ha utilizado slo para la

42
realizacin de experimentos de alta concentracin, y el VP-DSC, adquirido recientemente
por nuestro grupo de investigacin, en el que se llevaron a cabo casi todos los
experimentos.
A continuacin describimos brevemente algunos aspectos ms relevantes de cada
uno de los aparatos utilizados en el trabajo expuesto en esta Memoria.
El modelo DASM-4 (Differential Adiabatic Scanning Microcalorimeter) (Privalov,
1980) ha sido hasta muy recientemente el calormetro de mayor sensibilidad y
reproducibilidad en la determinacin de la capacidad calorfica. La caracterstica esencial
de este aparato es la geometra de sus clulas, que son dos tubos capilares construidos en
platino, de aproximadamente 1.2 mm de dimetro interno, formando sendas bobinas
helicoidales enfrentadas por sus secciones transversales, y entre las que se sita una
termopila de multiples uniones bimetal Las clulas estn situadas dentro de un bloque
adiabtico, formado por dos corazas metlicas concntricas, como se muestra en la Figura
3.1.1. Est geometra de las clulas presenta la ventaja frente a otros calormetros de una
gran facilidad para llenarlas y lavarlas y proporciona un campo trmico muy homogneo
sin apenas gradientes de temperatura en las disoluciones en estudio. Esto permite utilizar
mayores velocidades de barrido, lo que a su vez repercute en un incremento de la
sensibilidad del instrumento. Adems, en este tipo de clulas capilares la conveccin
trmica durante el calentamiento, que es una de las principales fuentes de artefactos en
calorimetra diferencial de barrido, es muy pequea.
Otras caractersticas instrumentales de est aparato son las siguientes: El volumen
operacional de las clulas es de 0.5 mL, el intervalo de temperaturas de trabajo va de 0 a
120 C, las velocidades de barrido de 0.1 a 2 K/min, y el nivel de ruido se sita en 0.2 W.
(Privalov y Potekhin, 1986). La adquisicin de datos, temperatura y potencia de
compensacin, se realiza mediante un ordenador conectado directamente al calormetro a
travs de un conversor analgico-digital.
El otro instrumento adquirido recientemente por nuestro grupo es el calormetro
modelo VP-DSC (Valery Plotnikov Differential Scanning Calorimeter). Representa un
gran avance en sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad de la lnea base, basado en una
gran mejora en la adiabaticidad del sistema. La relacin seal-ruido mejora un orden de
magnitud y adems presenta gran facilidad de manejo con respecto a otros calormetros
disponibles en el mercado. Se pueden obtener termogramas adecuados y reproducibles con

43
slo 50 g de protena en la clula de muestra, algo impensable con las generaciones
anteriores de calormetros.

Figura 3.1.1: Bloque calorimtrico del DASM-4. (1) Tubos capilares para llenar
las clulas, (2) Termolmina o resistencia elctrica laminar para calentar la clula
capilar, (3) coraza interna, (4) termopila y (5)coraza externa.

Las clulas tienen forma de moneda, con tubos capilares de 1.5 mm de dimetro
interno, para llenarlas. Estn construdas con tntalo 61, un material de gran resistencia
frente a la corrosin para casi todos los cidos, similar al vidrio, aunque es sensible al
ataque por medios fuertemente alcalinos. El volumen efectivo de ambas clulas es de 0.5
mL, aproximadamente. Ests clulas se encuentran fijadas en el interior de una coraza
cilndrica, que asegura la adiabaticidad del sistema. El intervalo operativo de la
temperatura del VP-DSC es de 10 hasta 130 C, y puede registrar barridos tanto
calentando como enfriando (en este caso en modo no adiabtico), sin necesidad de ningn
dispositivo exterior. Las velocidades de barrido son seleccionadas por el operador en un
rango de 0 a 2 K/min. Para barridos por encima del punto de ebullicin de las disoluciones,
el VP-DSC tiene un sistema de presurizacin que permite alcanzar presiones de hasta 35
1
3
2
4
5

44
psi, evitando as la ebullicin de las muestras. Un esquema del instrumento se muestra en
la Figura 3.1.2.
El VP-DSC es el primer calormetro que permite al operador seleccionar el tiempo
de respuesta entre 5 y 30 segundos. Sensibilidad y tiempo de respuesta estn relacionados,
a mayor tiempo de respuesta mayor sensibilidad. Esto representa una ventaja ya que para
estudiar las transiciones anchas que se suelen observar en la mayora de las protenas, y
para las que se requiere una alta sensibilidad, es aconsejable usar tiempos de respuesta
mayores. Por el contrario para transiciones agudas se aconseja un tiempo de respuesta
corto para evitar distorsiones en la forma del termograma. Tambin permite trabajar en
modo isotermo, para poder seguir cinticas de procesos a diferentes temperaturas. Por otra
parte, el VP-DSC est gobernado a travs de dos sistemas electrnicos conectados al bus
de un ordenador Pentium-PC estandar, que contienen los conversores anlogico-digital
(A/D) y digital_analgico (D/A) y las puertas digitales necesarias. Estos circuitos son
preconfigurados y calibrados en la factora de MicroCal, por lo que no se necesita ningn
ajuste previo a su funcionamiento. La adquisicin de datos y el control del
microcalormetro estn automatizados por el programa VPViewer que hace posible los
barridos cclicos sin la intervencin del operador. Por ltimo, con est programa podemos
modificar los parmetros experimentales tales como la temperatura de inicio y final, la
velocidad de barrido, etc. Los datos experimentales se almacenan en un archivo en cdigo
ASCII con el nombre establecido por el usuario.

3.1.3. Experimento calorimtrico.

3.1.3.1. Preparacin del experimento.

En general, para la realizacin de un experimento de CDB, las disoluciones de
protena deben prepararse de una manera rigurosa, de modo que la protena debe estar
esencialmente pura y las medidas de concentracin de las disoluciones deben realizarse
con la mxima precisin. Por lo general la disolucin de protena se dializa durante 24
horas frente al tampn en el cual se quiere realizar la experiencia. Sin embargo, para los
experimentos en disoluciones deuteradas, la protena se dializa frente a agua pura, se
liofiliza para eliminar el agua, y se disuelve en la cantidad del tampn deuterado
apropiado. Despus se determina la concentracin de la disolucin de la protena mediante
la medida de la absorbancia a 280 nm (ver apartado 3.5.3).

45

Figura 3.1.2: Esquema del calormetro diferencial de barrido VP-DSC: 1,2: Clulas de
muestra y referencia con los tubos capilares de entrada para llenar y limpiar. 3,4: calentadores
principales situados sobre las clulas, controlados por el voltaje V
II
de la fuente de alimentacin, 5;
sta a su vez est conectada al computador, 6, a travs de una tarjeta conversora analgico/digital
(A/D), 30. Los elementos auxiliares de calentamiento, 18 y 19, que se alimentan a travs de la tarjeta
A/D se utilizan para la calibracin y para la retroalimentacin. El dispositivo de medida del efecto
trmico, 7, y el termosensorl, 8, para medir la diferencia de temperatura T
1
entre las dos clulas, son
parte del sistema de medida por compensacin. Rodeando a las dos clulas se encuentra una coraza,
9, con dispositivos de calentamiento/enfriamiento, 10, dirigidos por un controlador, 11, que responde
a una seal que procede de un amplificador sumador 15. El amplificador sumador tiene como una
de las entradas la seal, 20, procedente del sensor, 12, que mide la diferencia de temperatura T
2
entre las clulas y la coraza. La otra entrada, 16, es un voltaje V
I
de una fuente de alimentacin, 17,
controlada por el computador a travs de la tarjeta A/D, 30. La coraza tiene adems un dispositivo,
13, para la medida de temperaturas mediante un sensor, 14, dispuesto en la coraza trmica; la seal
de salida del dispositivo se digitaliza en el conversor A/D, 30. Las seales calibradas T
1
y T
2
as
como la temperatura se registran continuadamente durante el experimento y se almacenan das en la
memoria del computador, 40, con un periodo de muestreo seleccionado por el usuario.


46
Una vez preparada la disolucin y antes de comenzar el experimento, se procede al
lavado de las clulas con agua Milli-Q, mediante el accesorio destinado a tal fin que viene
con el instrumento. Est operacin debe ser bastante exhaustiva, sobre todo si ha producido
alguna agregacin de la muestra en experimentos anteriores, en cuyo caso puede ser
necesario realizar una limpieza ms profunda de las clulas, utilizando una mezcla 1:10
cido frmico-agua, seguida de un lavado exhaustivo con agua Milli-Q. Despus, se llenan
las dos clulas con la disolucin tampn con el fin de registrar la lnea base instrumental, y
finalmente, introducimos los parmetros de control del experimento en el programa de
adquisicin del calormetro.

3.1.3.2. Lnea base instrumental

En la prctica los dos clulas del calormetro no son exactamente idnticas y por
tanto es necesario registrar un termograma con las dos clulas llenas con la disolucin
tampn, que representa la seal introducida por esta asimetra y otros factores
instrumentales, a la que llamaremos lnea base instrumental y que ser la referencia que
permitir eliminar el artefacto o contribucin instrumental de un termograma. Se registran
barridos de temperatura consecutivos, para asegurarnos de la reproducibilidad de la lnea
base, de manera que la diferencia entre dos termogramas consecutivos se encuentre dentro
del rango de las especificaciones del instrumento.
Un protocolo importante en nuestro procedimiento experimental es la preparacin
para asegurar la reproducibilidad de la respuesta trmica del instrumento. Esto se consigue
dejando el mismo ciclo trmico durante varios barridos sucesivos con los mismos
parmetros como la temperatura de inicio y final de barrido, la velocidad de barrido, y el
mismo tiempo de equilibrado entre el final de un barrido y el comienzo del siguiente.

3.1.3.3. Barrido con la muestra de protena.

Una vez termina la adquisicin de la lnea base, esperamos a que el calormetro
llegue a la fase de enfriamiento, a una temperatura prxima a la ambiente, generalmente
entre 20 y 30 C, y se llena la clula de muestra con la disolucin de protena.
Por lo general el termograma de CDB de una protena es una curva que contiene
una transicin, en forma de pico endotrmico, que se debe a la absorcin de calor asociado
con la desnaturalizacin de la protena inducida por la temperatura (en el caso de algunas

47
Figura 3.1.3: Curva de capacidad calorfica (trazo continuo) en funcin de
temperatura para la desnaturalizacin trmica de una protena hipottica.
N
p
C representa la capacidad calorfica del estado nativo y
D
p
C la del estado desplegado.
En trazo discontinuo se representa la capacidad calorfica intrnseca. El rea
encerrada entre las dos curvas equivale a la entalpa de desnaturalizacin, H. T
m
es
la temperatura del mximo de la transicin y C
p
es el incremento de capacidad
calorfica entre el estado nativo y el desplegado.
protenas se obtiene varios picos). Los valores de la seal en la zona pre- y post-transicin
corresponden respectivamente a las capacidades calorficas de los estados nativo y
desnaturalizado de la protena. Hay que hacer notar que el termograma de barrido con la
muestra aparece normalmente por debajo de la lnea base debido a que la capacidad
calorfica absoluta de la protena es menor que la del agua que desplaza (Privalov y
Khechinashvili, 1974). A partir del termograma resultante de restar la lnea base
instrumental, podemos obtener algunos parmetros termodinmicos significativos de la
transicin calorimtrica, como se indica en la Figura 3.1.3.


48
Una vez terminado el primer barrido con la protena, se deja registrar otro barrido
sin extraer la muestra de la clula. Esto permite comprobar el grado de la reversibilidad del
proceso responsable de la transicin calorimtrica observada, lo que se suele expresar en
trminos de porcentaje del rea bajo la curva que se recupera en el segundo barrido. Esto
es de relevancia para un anlisis posterior de los datos, ya que no se puede aplicar un
anlisis basado en la termodinmica de equilibrio si el proceso observado es irreversible y
no transcurre en equilibrio termodinmico. Existen, sin embargo, criterios ms fiables en
CDB para comprobar si una transicin corresponde a un proceso de equilibrio o no
(Snchez-Ruiz et al., 1988; Conejero-Lara et al., 1991 a y b).
Un vez finalizado el experimento, se deben lavar las clulas inmediatamente con
abundante agua Milli-Q para evitar los depsitos sobre las paredes de los posibles restos de
la protena y por ultimo se dejan llenas con agua Milli-Q.

3.1.3.4. Calibrado y correccin dinmica.

Para transformar los datos de la seal de voltaje (mV) que proporciona el
calormetro en valores de capacidad calorfica (J/K) es necesario determinar el valor de la
constante de proporcionalidad entre la potencia de compensacin (W) y la seal
registrada (mV) conocida como constante de calibrado (k) del instrumento. Por ello se
aplica un pulso de potencia conocida a la resistencia de una de las clulas, midiendo la
variacin en la seal que se origina como consecuencia (ver Figura 3.1.4).
Conocida la constante de calibrado (mV/W) y la velocidad de barrido del
experimento (v en K/min) podemos convertir la seal en unidades de capacidad calorfica
(kJ/K). Posteriormente se normalizan los valores para el numero de moles de protena
presentes en el interior de la clula, utilizando el volumen efectivo de la clula (V
cel
), la
concentracin de protena (c) y su peso molecular (M). Toda esta operacin se reduce a
utilizar el siguiente factor de conversin, f:

min) / ( ) / ( ) ( ) / (
) / ( 10 min) / ( 60 ) / (
6
K ml mg c ml V W mV k
W W s mol g M
f
cel

(3-1-1)

por el cual se multiplica la seal original en mV para transformarla en capacidad calorfica
molar en kJ/(Kmol).

49
Las potencias que se disponen para la calibracin en el DASM-4 son 25, 50 y 100
W. En el caso del VP-DSC, el programa de adquisicin utiliza una constante de
calibracin determinada por Microcal Inc. para registrar la seal en unidades de mcal/K,
aunque se aconseja llevar a cabo una calibracin elctrica cada seis meses
aproximadamente.
Tambin se aconseja una calibracin de la temperatura peridicamente cada seis
meses. Para ello se dispone de dos muestras estndares con puntos de fusin de 28.2 y 75.9
C, que consisten en cantidades pequeas de parafinas contenidas en unos tubos capilares
de acero.
Como todo instrumento de medida, el calormetro tiene un cierto tiempo de
respuesta, de manera que las curvas obtenidas se encuentran ligeramente distorsionadas.
Por ello es necesario corregir los termogramas para la respuesta dinmica del instrumento.
Para un calormetro que presenta una dinmica de primer orden basta realizar la siguiente
operacin:
( ) ( )
( )
dT
T dC
T C T C
p
p p
*
*
+ (3-1-2)

donde
p
C (T) es la seal real producida por el sistema en estudio,
*
p
C (T) la obtenida
experimentalmente y que se encuentra distorsionada por respuesta del instrumento, v la
velocidad de barrido y es el tiempo de respuesta del instrumento que previamente se ha
determinado en el proceso de caracterizacin dinmica del mismo (Lpez-Mayorga, 1983;
Lechuga, 1986; Lpez-Mayorga y Freire, 1987). En el caso del calormetro DASM-4 el
valor de es de 12 segundos, prcticamente independiente de la velocidad de barrido. Para
el VP-DSC la correccin dinmica del termograma se hace de manera automtica de
acuerdo con el tiempo de respuesta preseleccionado.


50

Figura 3.1.4: Panel A: Perfiles experimentales de capacidad calorfica frente a la
temperatura. En la lnea base se muestra un calibrado de 25 W. El primer y segundo
barrido con la muestra son prcticamente indistinguibles, salvo que la altura de la
endoterma en el segundo es un poco menor. El panel B representa el resultado de restar
al primer barrido la lnea base instrumental y el panel C el resultado despus de la
conversin de unidades a valores de capacidad calorfica parcial absoluta.

51
3.1.3.5. Obtencin de la capacidad calorfica molar parcial de la protena.

Esta bien establecido que una protena desnaturalizada es acompaada con un
aumento de la capacidad calorfica, es decir, que la capacidad calorfica de la protena en el
estado desnaturalizado es significativamente mayor que en el estado nativo.
La diferencia de capacidad calorfica entre una disolucin de macromolculas
biolgicas y el disolvente correspondiente es normalmente negativa. (ver Figura 3.1.4 (A)).
Para esta diferencia tenemos:

s p p p p p p
m T C m T C T C ) ( ) ( ) (
s , , ,
(3-1-3)

en la que C
p,p
y C
p,s
son las capacidades calorficas parciales de la protena y del disolvente
respectivamente, m
p
la cantidad de la protena en la clula calorimtrica y m
s
la cantidad
de disolvente desplazado por la protena en la disolucin.
Teniendo en cuenta que:

) (
) (
T V
T V
m m
s
p
p s
(3-1-4)
donde V
p
(T) y V
s
(T) son los correspondientes volmenes especficos parciales de la
protena en disolucin y del disolvente, obtenemos lo siguiente:

p
p p
s
p
s p p p
m
T C
T V
T V
T C C
) (
) (
) (
) (
,
, ,

+ (3-1-5)
Se puede considerar en el caso de disoluciones acuosas que la capacidad calorfica
del disolvente y su volumen especfico, C
p,s
(T) y V
s
(T), son los del agua pura, 1 cal/Kg y
1 mL/g respectivamente (Privalov y Potekhin, 1986). Por tanto, podemos transformar la
expresin (3-1-5) de la siguiente manera:
) / ( f ) ( ) ( 10 . 186 . 4
,
3
,
mol K kJ T C M T V C
p p p p p
+

(3-1-6)
donde M es el peso molecular de la protena en Dalton y f es el factor de conversin de
unidades descrito en la ecuacin (3-1-1).
Podemos considerar en buena aproximacin el volumen especfico parcial de la
protena igual a 0.73 mL/g, valor promedio para todas las protenas globulares, confirmado
por los clculos realizados por Makhatadze et al. (1990) a partir de los volmenes
especficos de cada aminocido. El resultado de estos clculos para nuestro ejemplo
podemos verlo en la Figura 3.1.4 (C).

52
3.1.4. Anlisis de los termogramas.

Una vez realizadas todas estas correcciones descritas en el apartado anterior,
disponemos de la funcin capacidad calorfica molar parcial de la protena en disolucin en
funcin de la temperatura, ) (T C
p
, para las condiciones experimentales de estudio. A partir
de esta funcin es posible, en principio, obtener toda la informacin termodinmica del
proceso de desnaturalizacin trmica. Para ello, en el caso de que el proceso de
desnaturalizacin transcurra en equilibrio, es necesario suponer un modelo. A continuacin
vamos a resumir brevemente la formulacin matemtica del modelo ms sencillo que se
utiliza para el anlisis de los termogramas de CDB, para posteriormente extender la
formulacin a modelos ms complejos.

3.1.4.1. El modelo de equilibrio de dos estados.

Para muchas protenas globulares pequeas se ha observado que en el proceso de
desplegamiento existen nicamente dos estados significativamente poblados: el estado
nativo (N), con una estructura plegada, y el estado desnaturalizado o desplegado (D).
Desde el punto de vista termodinmico-estadstico, estos estados N y D son en realidad dos
macroestados formados cada uno de ellos por multitud de microestados que difieren muy
poco en entalpa. El desplegamiento de estas protenas puede describirse cuantitativamente
mediante el llamado modelo de equilibrio de dos estados, que se puede esquematizar de la
siguiente forma:
D N (3-1-7)
Los dos estados N y D se encuentran en equilibrio en todo momento. La constante de
equilibrio aparente, K
D
de desplegamiento, viene dada por:

[ ]
[ ] D
N
K
D
(3-1-8)
y la fraccin de protena que se encuentra en el estado D,
D
x , ser:

[ ]
[ ] [ ]
D
D
D
K
K
D N
D
x
+
1
(3-1-9)
La entalpa molar parcial del sistema viene dada por:

53

D
D
D
N D D N D D N N
H
K
K
H H x H H x H x H
+
+ + +
1
(3-1-10)
donde H
D
=H
D
H
N
, es decir, la diferencia de entalpa de desplegamiento. Por
consiguiente, la capacidad calorfica molar parcial viene definida por:

( ) ( )
1
]
1
+
+
1
]
1
T
H
K
K
T
K
K
H
C
T
H
C
D
D
D D
D
D
N p p
1 1
2 ,
(3-1-11)
donde C
p,N
es la capacidad calorfica molar parcial del estado nativo.
Es ahora necesario expresar las dependencias de K
D
y H
D
con la temperatura. Para
ello se utilizan las siguientes ecuaciones:

p
C

T
H

D
(3-1-12)

T
C
p

T
S

D
(3-1-13)

,
_

RT
G
K
D
exp (3-1-14)
siendo S
D
, G
D
y C
p
las diferencias de entropa, energa de Gibbs y de capacidad
calorfica molares parciales entre los estados D y N, respectivamente.
Tradicionalmente, C
p
se ha considerado aproximadamente constante dentro del
intervalo de temperatura en el que ocurre la desnaturalizacin de la mayora de las
protenas. Sin embargo, un anlisis detallado de las curvas de capacidad calorfica de
varias protenas globulares realizado por Privalov y colaboradores (Privalov et al., 1989)
revel que la capacidad calorfica del estado desplegado es una funcin no lineal de la
temperatura, y como consecuencia C
p
no es constante. El efecto de la variacin de C
p

con la temperatura puede ser importante en transiciones que ocurren en intervalos de
temperatura relativamente amplios. Posteriormente se ha propuesto que es posible estimar
la funcin capacidad calorfica molar parcial de una cadena polipeptdica desplegada a
partir de su contenido aminoacdico (Makhatadze y Privalov, 1990; Privalov y
Makhatadze, 1990). As, la funcin C
p
del estado desplegado de una protena puede
describirse apropiadamente mediante un polinomio de segundo grado. En cambio, la
funcin C
p
del estado nativo es muy aproximadamente lineal en el intervalo de temperatura
previo a la transicin de desnaturalizacin y esta lnea recta suele extrapolarse a
temperaturas superiores.

54
Consecuentemente, es posible describir las funciones capacidad calorfica molar
parcial de los estados nativo y desplegado mediante las siguientes ecuaciones:

2
,
T c T b a C
D
p
+ + (3-1-15)
T e d C
N p
,
+ (3-1-16)

2
) ( ) ( T c T e b d a C
p
+ + (3-1-17)
Este tipo de anlisis basado en una funcin C
p
cuadrtica ya ha sido realizado con
xito previamente para varias protenas y dominios en nuestro grupo de investigacin
(Viguera et al., 1994; Azuaga et al., 1995).
Conocida la dependencia de C
p
con la temperatura es posible integrar las
ecuaciones 3-1-12 y 3-1-13 para obtener las dependencias de H
D
y S
D
con la
temperatura a travs de las expresiones:
+
+
T
T
p
m D
T
T
p m D
m
m
dT
T
C
S S
dT C H H
(3-1-18)
donde H
m
y S
m
son los incrementos de entalpa y entropa de desplegamiento a la
temperatura de transicin (T
m
). Esta temperatura de transicin se define como la
temperatura a la que
D
x = 0.5 y, por tanto, K
D
= 1. El valor de T
m
corresponde
aproximadamente al mximo de la capacidad calorfica cuando las transiciones son
simtricas y estrechas. A T = T
m
, G
D
= 0, por lo cual el cambio de entropa a la
temperatura T
m
, S
m
, puede calcularse por a partir de esta ecuacin:

m
m
m
T
H
S

(3-1-19)
Las formas integradas para la dependencia de H
D
y S
D
con la temperatura, a
partir de las ecuaciones (3-1-18), quedan como:

( ) ( ) ( )
( ) ( )
S T H G
T T
c
T T e b
T
T
d a
T
H
S
T T
c
T T
e b
T T d a H H
D
m m
m m
m
D
m m m m D

+ +
,
_
+ +
2 2
3 3 2 2
2
) ( ln ) (
2
) (
) (
(3-1-20)


55
Finalmente, la capacidad calorfica molar parcial se expresa de la siguiente forma:

( )
( )
p D
D
D D
N p p
C x
K
K
RT
H
C C +
+
+
2 2
2
,
1
(3-1-21)
Para la desnaturalizacin de una protena, la dependencia de G
D
con la
temperatura se denomina curva de estabilidad (ver Figura 3.1.5).

Figura 3.1.5: Panel A: Dependencia con la temperatura de los incrementos de
entalpa, entropa y energa libre de Gibbs de desnaturalizacin de una protena
hipottica. Panel B: Ampliacin del eje de ordenadas de la grfica A, que muestra las
caractersticas esenciales de la curva de estabilidad de la protena, G
D
(T). Se indican
las temperaturas correspondientes a la desnaturalizacin caliente T
m
, y fra,
*
m
T , as
como las temperaturas de inversin de entalpa T
H
y T
S
a las que H
D
y S
D
se hacen
cero, respectivamente.

56
Varios trabajos han destacado sus propiedades ms importantes, que se resumen a
continuacin (Bercket y Schellman, 1987; Schellman, 1987): La pendiente de la curva de
estabilidad viene dada por la expresin
D D
S T G y muestra un nico mximo
precisamente a la temperatura T
S
en la que S
D
es igual a cero. Adems se define la
temperatura T
H
a la cual la entalpa de desnaturalizacin es cero (T
H
es ligeramente ms
baja que T
S
). Por otra parte la curvatura viene dada por T C T G
p D

2 2
y slo
adquiere valores negativos, dado que el C
p
de desnaturalizacin es siempre positivo (ver
Figura 3.1.3). Tambin podemos ver en la Figura 3.1.5-B, que el mximo de G
D
se
presenta a temperaturas relativamente bajas, cercanas a la fisiolgica, estando favorecido el
estado nativo en estas condiciones. El valor de G
D
a temperatura ambiente (generalmente
25 C) constituye una medida de la estabilidad de la protena. El punto de corte con cero
alta temperatura corresponde a la temperatura de desnaturalizacin, T
m
, definida
anteriormente, mientras que el punto de corte con cero a baja temperatura,
*
m
T , es el
resultado de la extrapolacin de la curva, por lo que podra esperarse que hubiera una
desnaturalizacin de la protena por fro. Este fenmeno fue predicho hace unos 30 aos
por Brandts (1964) y demostrado experimentalmente por Privalov et al (1986). Varios
estudios de CDB (Privalov et al., 1986; Griko et al., 1988, 1989; Tamura et al., 1991;
Griko y Privalov, 1992; Azuaga et al., 1992) sugieren que la desnaturalizacin fra es una
propiedad comn de las protenas globulares, confirmando as las caractersticas ya
mencionadas de la curva de estabilidad.
Hay que hacer nfasis en este momento en que la formulacin matemtica descrita
hasta ahora solo es aplicable al anlisis de las curvas de C
p
en el caso de que el modelo de
equilibrio de dos estados describa adecuadamente el proceso de desnaturalizacin en
estudio.
Hasta muy recientemente, la CDB se ha venido considerando una tcnica suficiente
para comprobar la aplicabilidad del modelo de dos estados al anlisis del proceso de
desnaturalizacin de una protena (Tanford, 1968; Privalov, 1979: Schellman, 1987;
Jackson y Fersht, 1991; Viguera et al., 1994). Esto ha sido debido a que la CDB es capaz
de medir de forma directa e indirectamente el incremento de entalpa del proceso de
desnaturalizacin. El valor de la entalpa de desnaturalizacin se refleja no slo en el rea
bajo la curva de la transicin de desnaturalizacin (Figura 3.1.6), llamada entalpa

57
calorimtrica, sino que adems se manifiesta en la anchura de la transicin, es decir,
controla la forma de la curva de Cp, segn se deduce de la ecuacin de vant Hoff, que
proporciona la variacin de la constante de equilibrio con la temperatura:

2
ln
RT
H
dT
K d
vH
D

(3-1-22)
H
vH
se llama entalpa de vant Hoff.

La determinacin de ambas entalpas (calorimtrica y de vant Hoff) a partir de las
curvas de C
p
es relativamente sencilla (Privalov et al., 1979), de forma que el criterio
calorimtrico para una transicin de dos estados consiste en la coincidencia entre ambas
entalpas. Para un cierto numero de protenas globulares pequeas, Privalov y
20 30 40 50 60 70 80 90
0
10
20
30
40
50
200 kJ/mol
300 kJ/mol
400 kJ/mol

T(C)
C
p

(
k
J
m
o
l
-
1
K
-
1
)
Figura 3.1.6: Curvas simuladas de capacidad calorfica de exceso en funcin de
la temperatura mediante las ecuaciones del modelo de equilibrio de dos estados para un
Cp = 5 kJ/molK, la temperatura de transicin Tm = 50 C y los valores de entalpa
H
D
en kJ/mol se muestran en la figura para cada curva.

58
colaboradores (Privalov et al., 1979) encontraron que la relacin entre la entalpa
calorimtrica y la de vant Hoff, r = 1.05t0.03, lo que indica una baja proporcin de
estados intermedios y, por tanto, una buena concordancia con el modelo de dos estados.
Sin embargo, estos clculos requieren una manipulacin previa de las curvas de C
p
bastante acusada, que puede conducir a errores importantes, especialmente en transiciones
relativamente anchas, como es el caso del dominio SH3 objeto de estudio de esta Memoria.
Esa es la razn de que la forma ms fiable del criterio calorimtrico consista en realizar
directamente el ajuste por mtodos de mnimos cuadrados no lineales de la curva
experimental de C
p
al modelo de dos estados, utilizando las ecuaciones 3-1-7 a 3-1-21,
como se describe en el apartado siguiente. La buena concordancia del ajuste suele tomarse
como prueba suficiente de la validez del modelo de dos estados (Viguera et al., 1994;
Freire, 1995; Privalov et al., 1995).
Recientemente han aparecido, sin embargo, dudas sobre la validez del criterio
calorimtrico como condicin suficiente para la aplicacin del modelo de dos estados.
Karplus y colaboradores (Zhou et al., 1999) han demostrado que es posible ajustar al
modelo de dos estados curvas de CDB que han sido simuladas utilizando un modelo de tres
estados significativamente poblados en equilibrio. Estos autores plantean que la CDB no
siempre es sensible a la presencia de estados intermedios de equilibrio de plegamiento, y
esto depende de sus magnitudes termodinmicas con relacin a los estados nativo y
desplegado.
Para validar el modelo de dos estados u otros modelos de desplegamiento ms
complejos, parece ser conveniente, por lo tanto, complementar los estudios de
desplegamiento de protenas por CDB con otras tcnicas experimentales, como por
ejemplo, electroforesis en gel (Creighton, 1986), espectroscopia de dicrosmo circular o
fluorescencia (Filimonov et al., 1993; Viguera et al., 1994b; van Nuland et al., 1998;
Azuaga et al., 1999) cromatografa de exclusin molecular (Uversky, 1993; Conejero-Lara
y Mateo, 1996), ultracentrifugacin analtica (Azuaga et al., 1995), intercambio hidrgeno-
deuterio (Yi y Baker, 1996; Sadqi et al., 1999) as como estudios cinticos de los procesos
de plegamiento y desplegamiento (Jackson y Fersht, 1991; Viguera et al., 1994b).


59
3.1.4.2. Otros modelos de equilibrio.

Se han encontrado gran cantidad de protenas, especialmente las ms complejas,
para las que el modelo de dos estados no es vlido al tratar de explicar los datos obtenidos
por CDB para su desnaturalizacin trmica de equilibrio. Esto puede deberse a: i) una
poblacin apreciable de estados intermedios de plegamiento en equilibrio con los estados
nativo y desplegado (Xie et al., 1991; Montgomery et al., 1993); ii) cambios en el grado de
asociacin de la protena concomitantes con su desplegamiento (Conejero-Lara et al.,
1994); iii) ambas situaciones ocurriendo simultneamente (Thompson et al., 1993; Sanz et
al., 1994; Azuaga et al., 1995; Conejero-Lara y Mateo, 1996; Filimonov y Rogov, 1996).
Un mtodo general para el anlisis de equilibrio de los datos de CDB fue propuesto
originalmente por Friere y Biltonen (1978) para equilibrios sin cambios en el grado de
asociacin.
En un esquema general de equilibrio se suponen una serie de estados poblados
monomricos de la protena en el proceso de desnaturalizacin:
n n
I I I I I
1 2 1 0
...
I
0
es el estado nativo, I
n
es el estado completamente desplegado y existen n-1 estados
intermedios.
La funcin de particin del sistema se puede definir, utilizando el estado nativo, I
0
,
como estado de referencia:
( ) ( )
+
n
i
i
RT G T Z
1
exp 1 (3-1-23)
donde G
i
es la energa de Gibbs del estado I
i
, refrida al estado I
0
. La fraccin de
molculas de protena, x
i
, que se encuentran en el estado I
i
ser:

[ ]
[ ]
( )
( ) T Z
RT G
I
I
x
i
n
i
i
i
i

exp
0
(3-1-24)
y la entalpa media del sistema <H> ser el promedio de las contribuciones de todos los
estados presentes:

( )
( )

,
_

> <
n
i
i
i
n
i
i i
T Z
RT G
H x H H
1 1
exp
(3-1-25)


60
La capacidad calorfica se obtiene derivando la ecuacin 3-1-25 respecto a T:

( )
> < +
> < > <
> <
+
p p p
C
RT
H H
T
H
I C C
2
2 2
0
) ( (3-1-26)
donde <H
2
> es el valor medio de H
2
= x
i
H
i
2
. El primer trmino en el lado derecho de la
ecuacin (3-1-26) es debido a los cambios inducidos por la temperatura en el equilibrio de
desnaturalizacin, mientras el segundo termino es la capacidad calorfica promedio de la
protena <C
p
> = x
i
C
p,i
.
A partir del desarrollo de este formalismo, utilizando la CDB es posible caracterizar
completamente el procesos de desnaturalizacin en equilibrio (ver Freire y Biltonen, 1978,
para ms detalles). Estos autores llegaron mediante un procedimiento recursivo a
determinar el nmero de estados intermedios significativamente poblados y a
caracterizarlos termodinmicamente. En la literatura, se pueden encontrar modificaciones
de este procedimiento para el anlisis de los termogramas de CDB (Filimonov et al., 1982;
Gill et al., 1985; Xie et al. 1991). Tambin existen modificaciones de este procedimiento
para el anlisis de equilibrios en los que ocurren cambios del grado de asociacin de la
protena (Thompson, et al., 1993; Filimonov et al., 1993; Azuaga et al., 1995) o unin de
ligandos (Ramsay y Freire, 1990).

3.1.4.3. Ajuste de las curvas de capacidad calorfica molar parcial.

Como se ha mencionado anteriormente, la forma ms correcta de llevar a cabo el
anlisis de las curvas de C
p
obtenidas para la desnaturalizacin trmica de una protena
consiste en ajustar los datos experimentales por mtodos de mnimos cuadrados no lineales
utilizando las ecuaciones derivadas del modelo elegido.
Los ajustes realizados en esta Memoria se han llevado a cabo utilizando el
programa Origin 5.0 (Microcal Inc.). Para el caso ms comn de ajuste utilizando el
modelo de dos estados, las curvas de C
p
se ajustan con la ecuacin 3-1-21. Es necesario,
sin embargo, definir previamente en funcin de la temperatura todas las magnitudes en las
que depende C
p
en la ecuacin 3-1-21. Esto se realiza utilizando las ecuaciones del modelo
dentro de un conjunto de sentencias o script en la subrutina de ajuste del programa
Origin. En el Apndice A se ha incluido el script utilizado para el ajuste de las curvas de
C
p
. De esta forma, la C
p
queda expresada en funcin de la temperatura y de una serie de

61
parmetros de ajuste apropiados. Para los ajustes realizados en esta Memoria se han
elegido los siguientes:
- T
m
: Temperatura a la que G
D
= 0.
- H
m
: Incremento de entalpa de desnaturalizacin a T = T
m
.
- C
p,m
: Incremento de capacidad calorfica a T = T
m
.
- a : Ordenada en el origen de la funcin C
p,D
(ecuacin 3-1-15).
- e : Pendiente de la funcin C
p,N
(ecuacin 3-1-16).
Los parmetros b y c de la ecuacin 3-1-15 se mantienen fijos en los ajustes
utilizando los valores obtenidos mediante la regresin cuadrtica de los datos de C
p,D

calculados a partir de la secuencia de la protena (Makhatazde y Privalov, 1990). Todas las
dems magnitudes en las ecuaciones del modelo son dependientes de los parmetros
anteriores. De esta forma, cada curva de C
p
se ajusta utilizando 5 parmetros
independientes.
El programa Origin 5.0 proporciona intervalos de error bastante rigurosos en la
determinacin de cada parmetros en un ajuste, basndose en el anlisis de la matriz de
varianza-covarianza del ajuste para un intervalo de confianza del 95% (ver el Manual de
Usuario del programa Origin 5.0).

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