Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 37, n. 3, set./dez.

, 2001

Actividad antioxidante y cidos fenlicos del alga marina Bryothamnion triquetrum (S.G.Gmelim) Howe
Alexis Vidal Novoa1, Mario Motidome2, Jorge Mancini-Filho 3, Adyary Fallarero Linares1, Mirtes Midori Tanae2, Luce Maria Brandao Torres2, Antonio Jose Lapa2*
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Grupo de Farmacologia y Toxicologa, Facultad de Biologa, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba, 2Setor de Produtos Naturais, Instituto Nacional de Farmacologia, Universidade Federal de So Paulo, 3 Departamento de Alimentos e Nutrio Experimental, Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de So Paulo

*Correspondncia: A.J. Lapa Instituto Nacional de Farmacologia, UNIFESP, Setor de Produtos Naturais Rua 3 de Maio, 100, Vila Clementino 04044-020 - So Paulo e-mail: ajlapa.farm@infar.epm.br

El estrs oxidativo esta asociado con diferentes patologas de altas incidencias en el hombre, entonces la busqueda de antioxidantes naturales reviste una extraordinaria importancia. El objetivo del presente trabajo fue demostrar la actividad antioxidante del alga marina Bryothamnion triquetrum y los posibles compuestos que pudieran explicar esta actividad. El extracto acuoso de esta alga contiene 8.08 mg de polifenoles totales/g de extracto liofilizado y una concentracin inhibitoria media (CI50) de la lipoperoxidacin espontanea de 23.3 g. Se realizo un fraccionamiento con extracciones liquido-liquido, TLC y columna de Amberlite XAD-2, monitoreado por TLC y actividad antioxidante segn la tcnica de Ohkawa et al. (1979), resultando activas varias fracciones. Se lograron identificar y cuantificar por cromatografa gaseosa a los cidos trans-cinnmico, p-coumrico y ferlico en cantidades de 221.9, 4187.3 y 442.3 g/g de liofilizado. Se puede concluir que la actividad antioxidante del alga roja Bryothamnion triquetrum se debe, al menos en parte, por la presencia de estos cidos fenlicos.

Unitermos: Antioxidantes Algas marinas cidos fenlicos Bryothamnion triquetrum

INTRODUCCION
El estrs oxidativo esta estrechamente vinculado a diversas patologas entre las que se pueden citar la aterosclerosis, cncer, procesos inflamatorios y enfermedades neurodegenerativas e incluso procesos naturales como el envejecimiento (Hallewell,1987,1992; Masutani, 2000). Este fenmeno se produce por el desbalance entre las reacciones pro-oxidantes y los mecanismos antioxidantes, generalmente causado por una generacin incrementada de radicales libres, por lo que una de las vias para detener este proceso es a travs del suministro de sustancias antioxidantes. Actualmente los antioxidantes

sintticos, entre otros factores, son cuestionados por su posible capacidad promotora de tumores (Namiki, 1990), por lo que ha cobrado auge la busqueda y utilizacin de compuestos de origen natural. Indiscutiblemente, las plantas contribuyen de una manera significativa a este propsito, evidenciado en estudios epidemiologicos, clinicos y experimentales (Ramarathnam et al.,1995; Craig, 1997). Las algas han sido utilizadas tradicionalmente en la dieta de diferentes pueblos, sobretodo japonesa. Segn Jimenez-Escrig y Goi (1999) desde el punto de vista nutricional las algas son alimentos bajos en calorias, con altas concentraciones de minerales, vitaminas y proteinas, muy ricas en fibras y relativamente altas concentraciones de cidos grasos poli-insaturados.

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En los ltimos aos, las algas marinas han atraido la atencin como fuentes naturales de antioxidantes con amplias perspectivas de aplicacin en el tratamiento de diferentes patologas, conservacin de alimentos y en la industria de cosmsticos (Potterat, 1997). Se ha demostrado que extractos crudos de algunas especies de algas tienen un notable efecto antioxidante en aceites vegetales (Le Tutour, 1990). Otros autores (Murakami et al., 1994; Yan et al., 1998,1999) han comprobado que extractos de algas marinas tienen actividad atrapadora de radicales libres, lo que pudiera explicar el efecto hepatoprotector de estos extractos en intoxicaciones con tetracloruro de carbono, empleado como modelo de estrs oxidativo (Wong et al., 2000). Tambin en microalgas de diversos sistemas ecolgicos se ha observado esta propiedad (Miranda et al., 1998; Bandaranayake, 1998; Dunlap et al., 1999). Los polifenoles constituyen uno de los mas numerosos y representativos grupos de metabolitos secundarios de las plantas y su relevancia radica en su participacin en la fisiologa y el metabolismo celular como la morfologa, el crecimiento, reproduccin, defensa contra plagas y predadores y procesos germinativos, entre otros. Estos compuestos estn presentes en la mayoria de los productos vegetales consumidos por el hombre y si adicionamos que en estudios recientes se ha demostrado una significativa actividad antioxidante, entonces se evidenciara su potencial beneficioso sobre la salud humana (Bravo, 1998; Kahkonen et al., 1999). Se ha postulado que los mecanismos moleculares que explican esta propiedad son la capacidad como atrapadores de radicales libres, como donadores de hidrgeno, por su potencial como agentes reductores, y agentes quelantes (Rice-Evans et al., 1995). Las algas marinas rojas presentan como compuestos polifenlicos ms importantes a los bromofenoles, estructuras qumicas aromticas hidroxiladas y bromadas en varias posiciones y en ocasiones sulfatadas (Pendersen et al., 1974; Whitfield et al., 1999). Otros compuestos polifenlicos son los florotaninos, polmeros de alto peso molecular que presentan como unidad monomrica al floroglucinol y los compuestos polifenlicos sulfatados (Kornprobst et al., 1998; Retz de Carvalho, Roque, 2000). Resulta interesante sealar que la mayoria de los investigadores consideran a los compuestos fenlicos simples y cidos polifenlicos de las algas marinas como metabolitos precursores y/o intermediarios en la biosntesis de los polifenoles bromados (Pryce, 1972; Manley, Chapman, 1978, 1980; Whitfield et al., 1999; Flodin, Whitfield, 1999a, 1999b). El objetivo de este trabajo fue determinar cidos fenlicos en un extracto acuoso del alga marina

Bryothamnion triquetrum, que pudieran justificar, al menos parcialmente, su actividad antioxidante.

MATERIALES Y METODOS
Material vegetal Especimenes del alga Bryothamnion triquetrum (S.G. Gmelim) Howe (Rhodomelaceae, ceramiales, Rhodophyte) se colectaron en Septiembre del 2000 en el Bajo de Santa Ana de la costa norte de La Habana, Cuba. Su identificacin botnica fue llevada a cabo por especialistas del Laboratorio de Algas del Instituto de Oceanologa de Cuba (CITMA). Preparacin del extracto Las algas recin colectados se lavaron con agua de mar y se homogeneizaron en agua destilada (1:4 p/v) usando una batidora durante 2 minutos como mnimo. El homogenado obtenido se centrifug a 800 g en una centrfuga Beckman a 4 C durante 20 minutos. El sobrenadante fue liofilizado y posteriormente conservado a 20 C. El rendimiento estimado del producto en comparacin con el alga fresca fue de 0.5%. Esquema general del fraccionamiento El extracto acuoso de Bryothamnion triquetrum fue fraccionado de acuerdo al esquema presentado en la Figura 1. Todas las fracciones fueron concentradas y liofilizadas para la determinacin del % de rendimiento (con respecto al liofilizado del extracto acuoso del alga), deteccin de polifenoles por TLC y actividad antioxidante por la tcnica de Ohkawa et al.(1979). La determinacin de sustancias fenlicas se realizo mediante analisis de TLC en silica gel G (Merck) y el solvente de corrida fue butanol:cido actico:agua (5:1:2.6). Los polifenoles fueron visualizados con los reactivos de Folin-Ciocalteu alcalino y cloruro frrico al 1% (Stahl, 1969). Con la fraccin butanlica se desarrollo una TLC preparativa (TLCP), las zonas visualizadas con el reactivo de Folin-Ciocalteau alcalino se colectaron y redisolvieron en 2 mL de metanol, entonces se centrifugaron a 800 g durante 15 minutos. El sobrenadante se llevo a sequedad y se determino el rendimiento. Estas fracciones se reportan como TLCP but-1 a TLCP but-6. De acuerdo a los resultados de la TLC, las fracciones de la columnna Amberlite XAD-2 se agruparon en: las fracciones 3-4 (F3-4), las fracciones 5-8 (F5-8), las

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FIGURA 1 - Esquema general del fraccionamiento del extracto acuoso del alga marina Bryothamnion triquetrum. fracciones 9-14 (F9-14) y las fracciones 15-22 (F15-22). Las fracciones 1 y 2 se unieron y se adiciono metanol frio, de este modo se obtuvo un precipitado denominado P1-2 y el correspondiente sobrenadante S1-2. Identificacin de sustancias bromadas La presencia de compuestos bromados, generalmente presentes en las algas marinas, se realizo por dos procedimientos: Analisis cualitativo segn Shriner et al.(1980) Aproximadamente 20 mg del extracto liofilizado del alga se carbonizaron en presencia de sodio metlico. El residuo fue disuelto en agua, filtrado y acidificado, entonces se adicionaron 0.5 mL de tetracloruro de carbono y 0.2 mL de hipoclorito de sodio y se agito vigorosamente. La presencia de bromo fue confirmada por un color amarillo en la fase apolar. TLC revelada con fluoresceina/H2O2 Se empleo como soporte silica gel G, el solvente de corrida fue butanol:cido actico:H2O (4:1:2.6) y se revelo con fluorescena/H2O2 segn Sthal (1969): Se rocio la placa con solucin de fluorescena al 0.1% y posteriormente con solucin de perxido de hidrgeno al 30%:cido

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actico (1:1), se calento durante 20 minutos a 90 oC. Manchas rojas se consideraron resultados positivos. Determinacin de sustancias reactivas con el cido tiobarbitrico (TBARS) despus de la lipoperoxidacion espontanea en homogenados de cerebro de ratas Preparacin del homogenado de cerebro de rata Los cerebros de la ratas decapitadas fueron pesados, inmediatamente lavados con NaCl 0.9% frio y homogeneizados en un homogeneizador IKA-Werk (Janke and Kunkel) en una relacin de 1 g de tejido: 9 mL de tampn Fosfato (50 mM, pH 7.4). Los homogenados fueron centrifugados a 800 g en una centrifuga Mistral 3000i (MSE) a 4 oC durante 15 minutos y los sobrenadantes obtenidos se guardaron a -70 oC hasta una semana. Ensayo para determinar las sustancias reactivas con el cido tiobarbitrico (TBARS) La determinacin de TBARS se realizo por la tcnica de Ohkawa et al.(1979): 25 mL de homogenado de cerebro fueron incubados con igual volumen de las diferentes fracciones estudiadas a 37 oC durante 40 minutos en un bao con oscilacin. Posteriormente se adicionaron 350 mL de cido actico al 20% (pH 3.5) y 600 mL deTBA al 0.5%. Los tubos se incubaron durante 1 hora a 85 oC y transcurrido esse tiempo se adiciono 50 mL de SDS al 10% y se centrifugaron en una centrifuga Mistral 3000i (MSE) a 500 g durante 15 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia fue leida en un espectrofotometro Hitachi 3000U a 532 nm. La actividad antioxidante fue expresada en por ciento de inhibicin de la lipoperoxidacin espontanea. La curva dosis-actividad antioxidante del extracto liofilizado de alga se realizo en un intervalo de 6.75 a 125 mg y las actividades antioxidantes para las diferentes fracciones se determinaron con cantidades de aproxidamente 150 mg de cada fraccin liofilizada. Polifenoles totales La determinacin de polifenoles totales fue realizada por el mtodo de Folin-Ciocalteu modificado segn Quettier-Deleu et al. (2000): en un tubo de ensayo fueron colocados 7 mL de agua destilada, 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu y 0.5 mL del extracto. A los 3 minutos, fueron adicionados 2 mL de solucin de carbonato de sodio al 20% y calentados a 100 oC durante 1 hora, fueron enfriados y leida la absorbancia a 685 nm. Los resultados fueron expresados como mg de cido glico/mg de liofilizado de alga.

Cromatografia gaseosa Las diferentes muestras estudiadas fueron previamente silinizadas: los fracciones liofilizadas se disolvieron en metanol, metanol:agua o agua (de acuerdo a su solubilidad) en una concentracin de 1 mg/mL, entonces se colocaron alicuotas de 75 mL en viales especiales y se llevaron a sequedad. Posteriormente se adicionaron 500 mL de BSA [ N,O-bis (trimetil-silil)acetamida] y se incubaron por 30 minutos a 60 oC, entonces se aplicaron en un cromatografo de gas Shimadzu QP 5000 con una columna capilar semipolar DB5 (Supelco) de polimetilfenilsiloxona de 30 metros de largo y 0.25 mm de diametro interno con las siguientes condiciones operacionales: Detector de ionizacin de llama (FID), con volumen de muestra inyectada de 1 L, la temperatura del inyector fue 310 oC y del detector de 320 oC y el flujo del gas portador (helio) de 1mL/min. El programa de temperatura utilizado fue: Temperatura inicial de 150 oC, isotermica durante 3 minutos, con un incremento de 5 oC/minuto hasta 300 oC e isotrmica por 3 minutos. El control de los parmetros y el procesamiento de los resultados se realizo a travs del programa Windows NT Workstation 4.0. La identificacin y cuantificacin de los cidos fenlicos se realizo por comparacin del tiempo de retencin e integracin del pico con respecto a los patrones externos (Sigma).

RESULTADOS Y DISCUSIN
Recientemente se ha incrementado el inters por las plantas como fuentes de antioxidantes naturales, al prevenir el dao celular por inactivacin de los radicales libres. Bengmark (1998) seala que uno de los componentes fundamentales de la dieta humana futura son las frutas y los vegetales, como fuentes primarias de vitaminas, minerales y ademas de sustancias antioxidantes. Con este objetivo en los ltimos aos se han investigado las algas marinas, con resultados satisfactorios en diferentes modelos experimentales (Le Tutour, 1990; Murakami et al., 1994; Cahyana et al.,1992; Yan et al., 1998, 1999; Wong et al., 2000). En el presente trabajo se obtuvo una concentracin inhibitoria 50% de la lipoperoxidacin espntanea (CI50) de 23.9 g del extracto acuoso liofilizado (Figura 2), resultado similar a lo obtenido por Miranda et al. (1998) investigando la actividad antioxidante del microalga Spirulina maxima, lo que evidencia la posible utilidad de esta alga para estos fines. El contenido total de compuestos polifenlicos del extracto liofilizado fue de 8.05 mg de sustancias fenlicas/g de liofilizado. Wong y Cheung (2001) reportan valores

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FIGURA 2 - Curva dosis-inhibicin de la lipoperoxidacin del extracto del alga Bryothamnion triquetrum. Cada punto representa la media de tres determinaciones. Se determino una concentracin inhibitoria media de la lipoperoxidacin de 23.3 g/mL.

similares (8.44 mg/g ) para las algas rojas Hypnea charoides e Hypnea japonica mientras Jimenez-Escrig et al. (2001) trabajando tambin con extractos del alga roja Porphyra umbicalis y de otras especies de algas marinas encontraron valores entre 5 a 7 mg/g.

En esta investigacin se obtuvo una relacin actividad antioxidante/cantidad total de polifenoles similar a lo reportado por Kahkonen et al . (1999) para manzanas ( Malus pamela Punakaneli), consideradas como fuente natural de antioxidantes. Es acertado senalar que el grupo de polifenoles totales pudiera estar compuesto por polifenoles simples bromados y no bromados, sulfatados y florotaninos, compuestos generalmente presentes en las algas rojas (Kornprobst et al., 1998; Whitfield et al., 1999; Retz de Carvalho, Roque, 2000). Aunque en este extracto no se aislaron e identificaron compuestos bromados, sin embargo los ensayos cualitativos confirman la presencia de este tipo de sustancia. La visualizacin de manchas en TLC con el reactivo de cloruro frrico, en general pudiera orientar sobre la presencia de bromofenoles (Pedersen et al.,1974; Lundgren et al., 1979), lo que se debe confirmar por otras tcnicas ms especficas; en el alga estudiada se observan manchas en las TLC reveladas con este reactivo, al menos en 2 fracciones (S1-2 y F3-4) y en el extracto liofilizado del alga. Los resultados de la actividad antioxidante, presencia de sustancias fenlicas y el % de rendimiento de las distintas fracciones se presentan en la Tabla I. Los valores mayores de actividad se observan en las fracciones mas polares, lo que pudiera resultar lgico si consideramos que

TABLA I - Resultados del % de rendimiento, presencia de sustancias polifenlicas por TLC e inhibicin de la lipoperoxidacin espontanea de las diferentes fracciones estudiadas, de acuerdo al esquema de fraccionamiento (Figura 1) Fraccin Cantidad (mg) 3.0 127.6 1207.0 1.5 8.4 2.1 1.1 3.6 14.4 314.6 441.0 64.6 3.5 15.0 2.7 Rendimiento (%) 0.17 7.19 68.00 0.08 0.47 0.12 0.06 0.20 0.81 17.72 24.84 3.64 0.20 0.85 0.15 Presencia de sustancias fenlicas Folin-C Cl3Fe + + + + + + + + + + + + + + + + Inibicin de lipoperoxidacin espontanea (%) 90 nd 30 100 nd 85 nd nd nd 84 95 5 92 94 96 12

Ext. del alga Acet. de etilo Butanlica Acuosa TLCP but-1 TLCP but-2 TLCP but-3 TLCP but-4 TLCP but-5 TLCP but-6 P1-2 S1-2 F3-4 F5-8 F9-14 F15-22

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generalmente los compuestos polifenlicos, en buena medida responsables de esta actividad biolgica, presentan cierta polaridad. Varias fracciones resultaron activas lo que se pudiera explicar por dos factores: poca especificidad de los procedimientos empleados (extracciones liquido-liquido, columnas de adsorcin) y por otro lado un nmero alto de compuestos fenlicos que se deben resolver, con estructuras qumicas muy parecidas, lo que provoca que en varias fracciones aparezcan los mismos metabolitos. Las fracciones de mayor interes resultaron las fracciones intermedias de la columna de Amberlite (F5-8 y F9-14) con un rendimiento mas bajo pero con un grado mayor de pureza. En la fraccin P1-2 se obtuvieron valores altos de rendimiento y de actividad antioxidante. Este precipitado tiene un espectro UV con un valor mximo a =198.6 nm y no aparecen manchas con reveladores generales de materia orgnica como el H2SO4 y H2SO4:HNO3. En general las algas se caracterizan por altas concentraciones de sales inorgnicas (Jimenez-Escrig, Goi,1999; FelicioFernandes, Laranjeira, 2000), las que segn Hou et al. (1997) pudieran precipitar, arrastrando consigo compuestos fenlicos (como el cido p-coumrico), entonces de este modo resultarian activos estos precipitados. Los resultados de las TLC del liofilizado original y las distintas fracciones (Tabla II) evidencian la presencia de sustancias fenlicas en todas, excepto en la fraccin de acetato de etilo que resulto negativa, lo que avala los correspondientes valores de actividad antioxidante. La fraccin butanlica, aunque con un % de actividad bajo, presento varias manchas positivas para polifenoles, por lo que se decidi realizar un fraccionamiento por TLC preparativa, obteniendose en 2 fracciones rendimientos relativamente altos. El cromatograma de los patrones de cidos fenlicos se presenta en la Figura 3A mientras que en la Figura 3B

TABLA II - Valores de Rf de la TLC para las diferentes fracciones estudiadas. Se empleo como soporte silica gel G, el solvente de corrida fue butanol:cido actico:agua (4:1:2.6), reveladas con el reactivo de Folin-Ciocalteu. Rf: distancia origen-mancha/origen frente del solvente. Fraccin Ext. del alga TLCP but-1 TLCP but-2 TLCP but-3 TLCP but-4 TLCP but-5 TLCP but-6 P1-2 S1-2 F3-4 F5-8 F9-14 0.00 0.61 0.60 0.54 0.89 0.41 0.21 0.00 0.03 0.03 0.04 0.07 Rf 0.19

0.13 0.16 0.10 0.21 0.21

0.25 0.18 0.34 0.26

0.35

se muestra, de manera ilustrativa, el cromatograma de la fraccin F5-8 de la columna de Amberlite XAD-2 conjuntamente con el cromatograma de los patrones correspondientes. En esta fraccin se identificaron al cido trans-cinnmico (tr 7.18), cido p-coumrico (tr 14.93) y cido ferlico (tr 17.89). Al analizar los cromatogramas de las otras fracciones (no presentados) se lograron identificar el cido trans-cinnmico en las fracciones F9-14 y TLCP but-6 y al cido p-coumrico en las fracciones P12, F9-14 y TLCP butT-6. Los resultados de la cuantificacin de estos polifenoles se presentan en la Tabla III. Como se puede

TABLA III - Cantidades (g) de cidos fenlicos determinados de las diferentes fracciones estudiadas, referidas a 1 g del extracto de alga liofilizado. Fracciones TLCP but-6 P1-2 F5-8 F9-14 Total * tiempos de retencin em minutos c. trans-cinnmico (7.18)* 84.79 71.83 65.35 221.97 c. p-coumarico (14.93)* 205.63 3808.45 87.32 85.92 4187.32 c. ferlico (17.89)* 442.3 442.3

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FIGURA 3 - A: Cromatograma de los patrones de cidos fenlicos y el BSA: a:salicilico, b: trans-cinnmico, c:phidroxibenzoico, d:BSA, e:vanilico, f:gentsico, g:coumrico h:protocatequinico, i:qunico, j:p-coumrico, k:glico, l:ferlico y m:cafeco; B: Cromatograma de la fraccin F5-8 de la columna de Amberlite XAD-2. Los picos identificados b, j y l se corresponden con los tiempos de retencin de los cidos trans-cinnmico, p-coumarico y ferlico respectivamente y el pico d con el BSA. apreciar el compuesto que aparece en mas fracciones y en proporcin mayor es el cido p-coumrico. Aparentemente los tipos y cantidades de los cidos polifenlicos en las algas dependen de la especie en cuestin. Algunos investigadores (Whitfield et al., 1999; Flodin, Whitfield, 1999a, 1999b) consideran que el cido 4-hidroxibenzoico es un metabolito intermediario en la biosintesis de los compuestos bromofenlicos, criterio planteado anteriormente por Manley y Chapman (1978, 1980), quienes ademas no consideran al cido p-coumrico, aunque presente en muy bajas cantidades, con este objetivo. Sin embargo Pryce (1972) considera que en las algas el cido p -coumrico es un metabolito precursor de otros compuestos polifenlicos mas complejos, mientras Miranda et al . (2001) trabajando con el microalga Chlorella vulgaris identificaron 6 cidos fenlicos, siendo el mas abundante el cido trans-cinnmico. Los cidos fenlicos identificados en este trabajo (p-coumrico, trans-cinnmico y ferlico), se encuentran muy relacionados estructuralmente por lo que, entonces resultaria

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interesante investigar en futuros trabajos la posible relacin biosinttica entre estos compuestos y los polifenoles bromados. En los cromatogramas de las diferentes fracciones aparecen algunos picos presumiblemente de compuestos fenlicos no identificados, esto resulta lgico si consideramos que las algas rojas presentan una gran cantidad de compuestos fenlicos simples bromados, sulfatados y/o florotaninos, de los que no se poseen patrones, entonces no es posible su identificacin por esta metodologa. Diferentes investigadores han reportado la actividad antioxidante de los cidos fenlicos identificados en este trabajo. Fukumoto y Mazza (2000) encontraron que los cidos p -coumrico, ferlico y cinnmico tenian una actividad antioxidante similar al cido ascrbico, mientras que Schroeter et al. (2000) encontraron que los cidos p -coumrico y ferlico eran mas potentes que esta sustancia. Por otro lado, Miranda et al . (1998, 2001) consideran que los cidos fenlicos son los responsables de la actividad antioxidante de algunas especies de microalgas. Entonces se puede plantear que la actividad antioxidante del extracto acuoso del alga marina Bryothamnion triquetrum puede ser explicada, al menos parcialmente, por la presencia de los cidos fenlicos.

is receiving increasing attention. Current research focused attention on the antioxidant activity exhibited by the aqueous extract of the red seaweed Bryothamnion triquetrum related to specific compounds that can be responsible for such biological activity. The present results showed that seaweeds extract contains 8.08 mg of total polyphenols per gram of lyophilized extract and it can prevent the TBARS formation during spontaneous lipoperoxidation of rat brain homogenates with a half inhibitory concentration (IC50) of 23.3 g. Fractionating of the extract was performed by using liquid-liquid extractions, TLC and XAD-2 Amberlite columns. After these purification steps, various fractions were found to be antioxidants when tested in the model spontaneous peroxidation of rat brain homogenates. Through Gas Chromatography techniques, it was possible to identify and quantify the trans-cinnamic, p-coumaric and ferulic acids at concentrations of 221.9, 4187.3 and 442.3 g/g of lyophilized extract as the active compounds. From the above results, it seems logical to suggest that phenolic acids can be at least partially responsible for the antioxidant activity exhibited by the aqueous extract of Bryothamnion triquetrum in the model of spontaneous peroxidation of rat brain homogenates. UNITERMS: Antioxidants. Seaweeds. Phenolic acids. Bryothamnion triquetrum.

CONCLUSIONES
El extracto acuoso del alga marina roja Bryothamnion triquetrum (S.G.Gmelim) Howe presenta actividad antioxidante evidenciada en una satisfactoria relacin sigmoidal dosis del extracto-inhibicin de la lipoperoxidacin espontanea, propiedad que puede ser explicada por el alto contenido de compuestos polifenlicos. Dentro de este grupo se identificaron y cuantificaron 3 cidos fenlicos, reconocidos como eficientes antioxidantes.

AGRADECIMIENTOS
Quisieramos expresar nuestro agradecimiento a CAPES por el otorgamiento de la beca 1421-16/2000, lo que permiti la realizacin de esta investigacin, asi como a las Mc. Dora Garca, Maria Elena Bernal y Ana Vladia Moreira y a la farmacutica-bioqumica Rosangela Pavan Torres de la Facultad de Ciencias Farmacuticas de la Universidad de So Paulo y al tcnico Joaquim Gilberto dos Santos del INFAR (UNIFESP) por la ayuda prestada en los diferentes experimentos. A la FAPESP por el apoio financiero al proyecto n: 1999/3970-1:Avaliao da atividade antioxidante em alimentos.

ABSTRACT
Antioxidant activity related to phenolic acids in the aqueous extract of the marine seaweed Bryothamnion triquetrum (S.G.Gmelim) Howe Oxidative stress is now recognized to be involved in the pathogenesis of a growing number of human disorders. Natural organisms constitute an important reservoir of antioxidant compounds with original structures to serve as leads. Consequently, the search for new antioxidants from natural sources as an alternative to target oxidative stress

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