Avaliao da disciplina Bioqumica aplicada a Biotecnologia do curso de Ps-Graduao em Biotecnologia promovido pela FUNADEPI. Vanessa de Sousa do Vale (vanessaduvalle@hotmail.

com)

1. Faa um resumo do artigo abaixo: Steen H. and Mann M. The abcs (and xyzs) of peptide sequencing. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2004 Sep; 5(9):699-711.

Resposta: Tempos atrs as protenas eram seqenciadas atravs do mtodo de Edman, que necessitava de uma grande quantidade de protena purificada e se baseava na identificao de aminocidos quimicamente clivados a partir da regio amino-terminal, esse mtodo mostrou-se falho para protenas insuficientemente longas; e ineficiente na presena de acetilao na regio amino-terminal, a criao da espectrometria em massa (MS), mtodo que consiste na ionizao de biomolculas e obteno de sua massa atravs da trajetria seguida em um sistema a vcuo, substituiu a tcnica de Edman por ser mais sensvel e permitir fragmentar o peptdeo em menos tempo, alm de no requerer protenas purificadas e ser capaz de identificar protenas alteradas, tornando-se a tecnologia central no campo da protemica. Embora os espectrmetros possam medir a massa de protenas intactas, os peptdeos so mais eficientes, pois protenas podem ser difceis de manusear, no ser solveis em todas as condies, e produzir efeitos combinatrios que determinam numerosas isoformas, alm disso, os espectrmetros de massa de peptdeos so mais sensveis que os de protenas. Aps a purificao as protenas so convertidas a peptdeos usando uma seqncia de especifica de proteases, com poucas excees a tripsina a protease de escolha para converso, ela produz uma clivagem especfica na regio carboxiterminal, gerando peptdeos na faixa e massa preferida para o seqenciamento, alm da tripsina so utilizadas com menos freqncia as proteases Lys-C, Asp-N e Glu-C. Aps a digesto as propriedades fsico-qumicas da protena tornam-se irrelevantes, do conjunto de peptdeos gerados pelo menos alguns deles so seqenciados pelo espectrmetro de massa, mesmo que a protena seja instvel ou insolvel nas condies utilizadas. Os peptdeos so introduzidos no espectrmetro atravs de HPLC de acordo com suas propriedades hidrofbicas, ao final da coluna o lquido vaporizado e o peptdeo ionizado por meio de um potencial eltrico; eles entram no MS por meio de um pequeno orifcio ou por capilaridade sendo guiados por campos eltricos, so ento determinados seus valores de m/z e as intensidades dos picos do espectro, aps obtida a estrutura primria do on peptdeo, os ons mais comuns so gerados pela fragmentao da ligao amida entre aminocidos, os ons resultantes so chamados ons b se a carga retida pela parte amino-terminal do peptdeo e ons -y se a carga retida pela parte carboxi-terminal Cada fragmento de peptdeo emite um pico diferente do fragmento vizinho, sendo possvel determinar a diferena de massa entre picos vizinhos em srie, entretanto as informaes que aparecem no so completas, pois os picos podem ou no pertencer srie, e isso pode confundir a anlise, outro problema pode surgir quando no seqenciamento atravs de peptdeos que os mesmos podem pertencer a outras protenas.

O avano tecnolgico tem permitido a identificao de centenas de protenas, e determinar sua confiabilidade desafiador, j que mesmo as taxas de erro sendo baixas para cada peptdeo, estas podem aumentar quando milhares de peptdeos esto sendo identificados. Muitas vezes, o interesse ultrapassa a identificao do peptdeo e vai at a sua quantificao. Infelizmente a intensidade do sinal emitida pelo peptdeo ionizado no diretamente proporcional a quantidade de protena presente, porm esse fator reproduzvel, pois mesmo a altura dos picos pode ser um bom indicador da quantidade relativa das protenas relacionadas a partir de um experimento para o outro. Na quantificao absoluta a mdia das respostas do MS dos peptdeos mais abundantes para cada protena pode render uma medida aproximada da quantidade absoluta de cada protena. Na quantificao relativa utilizam-se istopos estveis, j que iro se comportar de forma idntica durante o experimento, havendo apenas uma pequena diferena de massa entre eles. Por fim, pode-se concluir que a tecnologia combinada ao MS para o seqenciamento de peptdeos esta avanando rapidamente, podendo em um futuro prximo, com o auxlio da bioinformtica quantificar e decifrar vrias protenas em tempo hbil e permitir seu emprego em outras reas ou em combinao com outros sistemas. 2- Usando a ferramenta pepsec sequencie os peptdeos abaixo (abra arquivo .psq em anexo): Peptdeo 1. m/z = 1513.91

Resposta: AWLDKLKSIGKVVG Peptdeo 2. m/z = 1416.69 (peptdeo trptico, observar regras especficas) OBS: Use as informaes do tutorial da prtica de sequenciamento de peptdeos. Fontes de Auxlio On-line: http://www.ionsource.com/tutorial/DeNovo/introduction.htm http://www.matrixscience.com/help/fragmentation_help.html Resposta: LVTFFTEEFKR. 3- Use a ferramenta blastp encontrada no link abaixo para identificar os peptdeos sequenciados e em seguida monte a sequencia primria de aminocidos das protenas a que eles pertencem no formato fasta. (Http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi?page=proteins). Peptdeo 1. m/z = 1513.91

Resposta: MAFLKKSLFLVLFLGIVSLSICEEEKREGEEEEKQEEENEELSEEELRERRAWLDKLKSIGKVV GKVAIGVAKNLLNPQ O Peptdeo 2. m/z = 1416.69

Resposta:

MPWYLFSTTSSPRCALPLPPFYPPNHTQDPKHALALKLSEENTYAHRHTSLSLCALLRNPITTL LPPPPIPHAHTHTTTAAEMTFDGAIGIDLGTTYSCVGVWQNERVDIIANDQGNRTTPSYVAFT DSERLIGDAAKNQVAMNPHNTVFDAKRLIGRKFNDSVVQSDMKHWPFKVTTKGDDKPMIA VQYRGEEKTFTPEEISSMVLLKMKETAEAYLGKQVKKAVVTVPAYFNDSQRQATKDAGTIA GLEVLRIINEPTAAAIAYGLDKGDDGKERNVLIFDLGGGTFDVTLLTIDGGIFEVKATNGDTHL GGEDFDNRLVTFFTEEFKRKNKGKNLASSHRALRRLRTACERAKRTLSSATQATIEIDALFEN VDFQATITRARFEELCGDLFRSTIQPVERVLQDAKMDKRSVHDVVLVGGSTRIPKVQSLVSDF FGGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAFILTGGKSKQTEGLLLLDVTPLTLGIETAGGVMTALIKR NTTIPTKKSQIFSTYADNQPGVHIQVFEGERAMTKDCHLLGTFDLSGIPPAPRGVPQIEVTFDL DANGILNVSAEEKGTGKRNQITITNDKGRLSKDEIERMVNDAMKYEADDRAQRDRVEAKNG LENYAYSMKNTLGDSNVSGKLDDSDKATLNKEIDVTLEWLSSNQEATKEEYEHKQKELESV CNPIMTKMYQSMGGAGGGMPGGMPDMSGMSGGAGPAGGASSGPKVEEVD

4- Use a ferramenta on-line ms/ms on search para identificar a sequencia de aas do espectro de massa 1416.69. http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?formver=2&search=mis

Reposta: LVTFFTEEFKR

5- Procure no sitio do uniprot a protena de cdigo cab06018.1. Descreva as informaes sobre ela: sequencia de aa, se for enzima, sua classificao, a ontogenia (processo biolgico e funo molecular). Resposta: A protena de cdigo CAB06018.1 (denominada GP63) tm sequncia de Aminocidos: MSVDSSSTHRHRSVAARLVRLAAAGAAVIAAVGTAAAWAHAGAVQHRCIHDAMQARVRQS VARHHTAPGAVSAVGLPYVTLDTAAAADRRPGSAPTVVRAANWGALRIAVSTEDLTDPAYH CARVGQHIKRRLGGVDICTAEDILTDEKRDILVKHLIPQALQLHTERLKVRQVQDKWKVTGM GDDVCSDFKVPPAHITDGLSNTDFVMYVASVPSEEGVLAWATTCQVFSDGHPAVGVINIPAA NIASRYDQLVTRVVTHEMAHALGFSVGFFEGARILESISNVRHKDFDVPVINSSTAVAKAREQ YGCDTLEYLEIEDQGGAGSAGSHIKMRNAQDELMAPAAAAGYYSALTMAIFQDLGFYQADF SKAEVMPWGRNAGCAFLSEKCMERNITKWPAMFCNENEVTMRCPTSRLSLGKCGVTRHPDL PPYWQYFTDPSLAGISAFMDCCPVVEPYGDGSCAQRASEAGAPFKGFNVFSDAARCIDGAFR PKTSHGIIKSYAGLCANVRCDTATRTYSVQVHGGSGYANCTPGLRVELSTVSSAFEEGGYITC PPYVEVCQGNVQAAKDGGNAAAGRRGPRAAATALLVAALLAVAL Enzima classificada como uma protease de superfcie (metalopeptidase). Est envolvida nos processos biolgicos de adeso celular e protelise; e tem funo molecular de hidrolase e protease.