TRABAJO PRACTICO N6 Accin de la invertasa de clulas inmovilizadas de Saccharomyces cerevisiae Objetivo: Inmovilizar clulas de S. cerevisiae y evaluar la actividad invertasa.

Introduccin El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransformaciones es un rea en continua expansin. Un aspecto clave del proceso es el uso del catalizador (clula o enzima) en un sistema continuo que permite extender el uso del mismo en el tiempo dando como resultado una disminucin de los costos del proceso y otras ventajas como una mayor pureza del producto, mayor productividad, etc. Para lograr este objetivo, es posible inmovilizar el biocatalizador. La inmovilizacin consiste en prevenir el movimiento celular libre por mtodos naturales o artificiales. La inmovilizacin de clulas (fig. 1) o enzimas tiene numerosas aplicaciones en biomedicina, farmacologa (produccin de antibiticos), produccin de bebidas y alimentos (produccin de cerveza, exopolisacrido), agricultura y ganadera (produccin de esperma para mejoramiento animal), biorremediacin (decoloracin de colorantes textiles, remocin de metales pesados), etc. La Federacin Europea de Biotecnologa (1983) define el concepto de inmovilizacin de la siguiente manera: Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas o clulas u organelas localizados en cierta regin definida del espacio, con retencin de su actividad cataltica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo repetido y continuo. A continuacin se aclaran algunos aspectos de esta definicin: Fig. 1. Clulas de levadura Localizados: esto quiere decir que el biocatalizador est compartimentalizado. Hay una fase slida que tiene la actividad cataltica y est en contacto con un medio reactivo lquido libre de catalizador. Retencin de la actividad cataltica (y/o viabilidad): los tratamientos para lograr la inmovilizacin reducen la actividad cataltica. Esta reduccin no puede superar el 75 % de prdida de actividad, para que el proceso sea rentable. Uso repetido y continuo: aqu reside la gran ventaja de la inmovilizacin, esto se relaciona con la fcil separacin del catalizador del medio sin prdida de actividad y por consecuencia directa, con su reutilizacin.

Existen distintos mtodos de inmovilizacin: Unin a soportes Adsorcin: sencilla, no daa las clulas, pero como la fuerza de unin es baja, se produce elusin de las clulas, lo cual produce prdidas importantes de clulas en los procesos continuos. Uniones inicas: los soportes son

intercambiadores inicos, es una metodologa sencilla, pero cambios en el pH o la concentracin de sales, puede separar las clulas del soporte. Uniones

covalentes:

estas

uniones son ms fuertes, hay que modificar protenas de las clulas o regiones de la enzima. Hay que verificar que no haya prdida de la actividad cataltica. Es ms costoso. Entrecruzamiento: entre

aminocidos de la protena y agentes polimerizantes como el glutaraldehdo. Encapsulacin/ Microencapsulacin en polmeros: se rodean clulas o enzimas fsicamente en geles,
Fig. 2: Imgenes de microscopa de barrido de C. guillermondi inmovilizdas en una cpsula de gel de alginato, con BaCl2 como agente polimerizante. Las colonias se distribuyen sobre la superficie (flecha en A) y en el interior de la cpsula (B)

microcpsulas o polmeros fibrosos como la celulosa. Los geles son polmeros entrecruzados insolubles en agua, como la poliacrilamida. En el caso de las microcpsulas, las clulas o enzimas se rodean de una membrana semipermeable del polmero. Las clulas pueden inmovilizarse sin soportes, y este proceso se llama floculacin. Son clulas unidas entre ellas. El ejemplo tpico es la floculacin de cepas de Zymomonas mobilis empleadas en la produccin de etanol a partir de glucosa.

La unin a soportes constituye el mtodo ms antiguo. Para esto debe tenerse en cuenta: Estructura del soporte Tipo de unin Relacin entre grupos hidroflicos e hidrofbicos Tamao de la partcula Relacin superficie/volumen

Se pueden usar soportes preformados, ampliamente usados para inmovilizar enzimas, y menos para clulas ya que hay que encontrar condiciones y materiales que permitan la adhesin celular. Para la inmovilizacin de clulas, se usa la prepara el soporte durante el proceso de inmovilizacin. Son soportes porosos que garantizan la completa retencin de las clulas. Tipos de soportes: Inorgnicos Naturales: arena, silicatos, arcillas Sintticos: cermicas, vidrios de porosidad controlada. Orgnicos albmina. Sintticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio Naturales: virutas de madera, colgeno, celulosa, alginatos, carragenatos,

inico, epxidos, poliuretanos.

La seleccin del material se realiza teniendo en cuenta:

Materiales de alta disponibilidad y bajo costo. Materiales que permitan un proceso de inmovilizacin simple y

efectivo respecto de la retencin de la actividad.

Materiales con alta capacidad y eficiencia Materiales que permitan un diseo de reactores sencillo.

Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales que permitan tcnicas de inmovilizacin por adsorcin. En tanto que los dos ltimos, apuntan la eleccin hacia soportes orgnicos complejos. De todos modos, la eleccin final va a

depender del biocatalizador, del proceso en el que va a participar, y del producto que se desea obtener.

En el caso de inmovilizacin de clulas, uno de los mayores problemas es la resistencia a ala transferencia de masas, impuesta por el hecho de que el sustrato tiene que difundir hasta el sitio de reaccin y los productos de inters del proceso y las sustancias txicas y/o inhibidoras de la reaccin deben ser removidos. La transferencia de oxgeno es tambin un problema a la hora de disear la inmovilizacin de un tipo celular. Por esto, en lneas generales, las tcnicas de inmovilizacin han sido aplicadas principalmente a procesos anaerbicos con organismos anaerbicos estrictos o con los componentes anaerbicos de microorganismos facultativos.

El azcar invertido es una mezcla de glucosa y fructosa en cantidades equivalentes que se obtiene a partir de sacarosa. La conversin de un dmero de sacarosa en monmeros se produce por la siguiente reaccin: glucosa-fructosa + H2O glucosa + fructosa sacarosa azcar invertido Este proceso requiere una molcula de agua que se incorpora qumicamente a los monmeros. Esto es importante ya que el agua libre es removida y el peso del azcar se incrementa. Este incremento es significativo en la produccin de grandes cantidades de golosinas, que son comercializadas por peso. Otra caracterstica importante es que el azcar invertido es higroscpico, por lo cual, por ej. es incluido en la fabricacin de chicles, para evitar que se resequen y tornen quebradizos; o en la elaboracin confituras baadas en chocolate para prevenir una excesiva cristalizacin. La reaccin de conversin est catalizada por cidos o por la enzima invertasa. Esquema de trabajo Agar-agar 1,2 % p/v clulas de Saccharomyces cerevisiae

esterilizacin

Mezcla a 50 C 25 % p/p

fase hidrofbica (aceite vegetal)

agitacin (formacin de esferas)

enfriamiento a 0 C lavado, filtracin, recoleccin de esferas

llenado de la columna

sacarosa 20 % p/v

contacto, 15 min. t. amb.

Dosaje de glucosa por HPLC (test de glicemia)

Materiales Agar-agar 1,2 % en agua; clulas de Saccharomyces cerevisiae en pan; aceite vegetal; sacarosa 20 % p/v; buffer acetato 0,1 N, pH 5; agua para lavados.