AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

1.- PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

En la actualidad se pueden cultivar fuera de su hbitat normal, la mayora de los microorganismos hetertrofos, en los medios de cultivo deben de estar presentes en forma razonable el carbono, nitrgeno, azufre, fosforo, calcio. Magnesio y hierro. Adems de los oligoelementos como el manganeso, zinc , cobre, etc. Algunos de los microorganismos exigentes tiene la necesidad de factores de crecimiento como aminocidos, vitaminas, purinas y pirimidinas y otras substancias que no pueden sintetizar ellos mismos. Un medio de cultivo es un sustrato nutritivo solido o liquido, donde crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio con el objeto de realizar su aislamiento para luego proceder a su identificacin y estudios complementarios. Los medios de cultivo deben de tener una concentracin de iones hidrogeno en el rango neutro, adems es imprescindible la temperatura de o a 15 grados c para los microorganismos psicrofilos, 20 a 42 grados para los mesofilos y de mas de 45 para los termfilos, as mismo la presencia de oxigeno o ausencia de oxgeno segn sea el caso. Hoy en da se dispone comercialmente de medios de cultivo deshidratados que son estables y se adaptan para el uso de laboratorio, solo hay que observar algunas recomendaciones bsicas cuando se procede a su preparacin.

MATERIALES

Matraz erlenmeyer Baln de fondo plano Placas petri esterilizadas Tubos de ensayo esterilizados Probeta Balanza Esptula Trpode con malla de asbesto Mechero de bunsen Estufa de incubacin Refrigeradora

PROCEDIMIENTO

Calcular el peso en gramos del medio de cultivo correspondiente ejemplo: agar nutritivo 23 gramos para 1000ml, agar sangre 40 gr para 1000ml, agar muller hinton 24gr para 1000ml, agar champam 146.5 gr para 1000ml Pesar el medio de cultivo deshidratado en una balanza Vaciar la cantidad pesada en un baln de fondo plano o matraz erlenmeyer Medir el agua destilada con una probeta y aadir al medio Dejar reposar el medio de cultivo durante 5 a 10 min Ajustar el ph Esterilizar en autoclave a 121 grados durante 15 min Repartir los medios de cultivo en las placas petri o tubos de ensayo Realizar el control de esterilidad en la estufa a 37 grados por 24 horas

Conservar los medios en la refrigeradora a una temperatura de -4 a -10 grados

2.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Todo el aislamiento implica la dispersin o agotamiento de una muestra que contiene una flora mixta sobre la superficie de un medio solido. Con el asa de siembra o hisopo se va descargando gradualmente el inoculo mediante estras, de tal manera que en los ltimos planos del medio de cultivo queden depositadas pocas clulas aisladas, que en el ambiente nutricio se multiplican logartmicamente hasta formar colonias puras aisladas en las cuales podemos estudiar sus caractersticas su morfologa y afinidad tintoreal a la tincin de gran.

Realizaremos aislamiento de bacterias aerobias procedentes de la flora normal de nosotros mismos

MATERIALES AGAR gel coloidal formado por hidratos de carbono, de extendido uso comercial, y que proviene de las paredes celulares de varias especies de algas rojas, en concreto de miembros orientales del gnero Gelidium. Se utiliza como agente solidificante en la preparacin de dulces, cremas y lociones, as como en las conservas de pescado y carne; para texturizar y emulsionar los helados y postres congelados; para clarificar, durante el proceso de fabricacin del vino y la elaboracin de la cerveza; y tambin para dar apresto (almidonar) las telas. Adems, es un excelente medio de cultivo de bacterias, ya que no se disuelve por el efecto de las sales, ni se consume por la accin de la mayora de los microorganismos. El agar se extrae de las algas marinas hacindolas hervir. Posteriormente, el producto resultante se deja enfriar y secar, y al final se solidifica en pastillas o en escamas. En un principio se llam agar-agar, un trmino que se utiliza en Malasia para denominar a un alga local. Hoy en da no slo se produce en Oriente, sino tambin en regiones costeras del Pacfico, como California y Australia. Segn el procedimiento que queramos seguir utilizaremos diferentes tipos de agar como Agar Estufa de incubacin Etiquetas Baja lenguas Placas petri Hisopos

Agar sangre

Contiene sangre de mamferos (generalmente oveja, conejo, humanos) a una concentracin de 5 a 10%. El agar sangre, es un medio enriquecido, diferencial, usado para aislar microorganismos fastidiosos y detectar actividad hemoltica. La -hemolisis, se manifiesta como una lisis y digestin completa de los eritrocitos que rodean la colonia, por ejemplo algunas bacterias del generoStreptococcus. La -hemolisis , aparece solo como lisis parcial (los eritrocitos, no son lisados completamente o la digestin no fue completa), por tanto la hemoglobina aparece como una halo verdoso alrededor de la colonia. Contiene extracto de carne, triptona, cloruro de sodio y agar.

Agar chocolate

Es un tipo de agar sangre, donde las clulas sanguneas han sido lisadas por calentamiento a 56 C. El agar chocolate se usa para cultivo de bacterias respiratorias fastidiosas como por ejemplo Haemophilus influenzae. No contiene chocolate, solo es llamado as por la coloracin.

Agar Manitol salado

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria. Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Agar nutritivo

Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.

Agar Mueller-Hinton

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.

PROCEDIMIENTO Las muestras de piel se obtienen frotando la superficie corporal con un hisopo humedecido en suero fisiolgico estril. Las muestras de secrecin nasal y exudado farngeo se obtienen con hisopo y baja lenguas esterilizados Destapar la placa petri y proceder a sembrar la muestra en la

superficie del agar utilizando el asa de siembra esterilizada o el hisopo mediante estras en zigzag. la distribucin puede ser por estra simple (agotamiento en un solo plano, mediante estras en 3, 4, 5 planos en el mismo medio ) evitar romper el medio al efectuar la siembra. Tapar la placa y esterilizar el asa de siembra. Etiquetar las placas con el nombre de la muestra y la fecha de siembra. Incubar en la estufa a 37 grados centgrados durante 18 a 24 horas (esto puede variar dependiendo del cultivo que hagamos)

Para la siembra den tubos con medios slidos o lquidos se procede a destapar el tubo sujetando el tapn de algodn con el dedo meique de la mano derecha y la palma de la mano, flamee la boca del tubo, introducir una aguja de siembra con el inoculo, punzar una solo vez en el espesor del medio, retirar por el mismo trazo y estriar en la superficie inclinada del medio, homogeneizar el inoculo en el medio liquido o caldo, taponar el tubo, esterilizar la aguja de siembra y etiquetar. Incubar a 37 grados durante 18 a 24 horas.