CICLO DEL NITROGENO

FIJACION BIOLOGICA DEL NITROGENO

El nitrgeno es un elemento increblemente verstil que existe en forma inorgnica y orgnica, y a la vez en muchos y diferentes estados de oxidacin.
Profesora: Dra. Nora In

Tabla 1- Estados de oxidacin de los compuestos clave de nitrgeno

Compuesto

Estado de oxidacin N orgnico (R-NH2) -3 Amonaco (NH3) -3 Nitrgeno gaseoso (N2) 0 Oxido nitroso (N20) +1 (promedio por N) Oxido de nitrgeno (NO) +2 Nitrito (NO2-) +3 Bixido de nitrgeno (NO2) +4 Nitrato (NO3-) +5

- Todas las formas de vida dependen del nitrgeno. Es el componente esencial de protenas, cidos nucleicos y otras macromolculas fundamentales del metabolismo. - El principal reservorio es la atmsfera. El 78% de la atmsfera es N2 gaseoso. El triple enlace es difcil de romper y se requieren condiciones especiales. La mayora de los ecosistemas contienen cantidades escasas de N. El nitrgeno es soluble en agua y circula a travs del aire, el agua y los tejidos vivos (en estado reducido). - Son pocos los organismos capaces de asimilarlo, entre ellos los procariotas como las cianobacterias y las azotobacterias. - No se conoce ningn eucariota que fije nitrgeno. Los organismos fotoauttrofos (plantas o algas) requieren por lo general de nitrato (NO3-) como forma de ingresar su nitrgeno; los hetertrofos (p.ej. los animales) necesitan el nitrgeno ya reducido, en forma de radicales amino, que es como principalmente se presenta en la materia viva.

CICLO DEL NITROGENO

Proceso por el cual el nitrgeno circula y recircula a travs del mundo. Las tres etapas principales de este ciclo son: 1- Amonificacin 2- Nitrificacin 3- Asimilacin

Amonificacin
Es el proceso por el cual los compuestos nitrogenados encontrados en el suelo, productos de la descomposicin de materiales orgnicos complejos tales como protenas, aminocidos, cidos nucleicos y nucletidos son degradados a compuestos simples por organismos que habitan el suelo, principalmente bacterias y hongos. Estos microorganismos metabolizan estos compuestos y liberan el exceso de nitrgeno en forma de amonaco o in amonio.

AMONIFICACION Materia orgnica

Suelo Compuestos nitrogenados orgnicos Se descomponen Proceso de amonificacin

NH3
O

Bacterias y hongos

El exceso

NH4+

Constituyen sus propias protenas

La amonificacin es la conversin del nitrgeno que en la materia viva aparece principalmente como grupos amino (-NH2) o imino (-NH-) a ion amonio .

Nitrificacin
La nitrificacin es el proceso por el cual varias especies de bacterias comunes en los suelos son capaces de oxidar el amonaco o el in amonio. Es un proceso generador de energa, y la energa liberada es utilizada por estas bacterias como fuente de energa primaria. Un grupo de bacterias oxida el amonaco o in amonio a nitrito y luego otro grupo lo oxida a nitrato.

No se conoce ningn quimiolittrofo que lleve a cabo la oxidacin completa de amonio a nitrato; por ello, la nitrificacin en la naturaleza resulta de la accin secuencial de dos grupos separados de organismos, las bacterias oxidantes de amonaco o nitrosificantes y las bacterias oxidantes de nitritos, las verdaderas bacterias nitrificantes. Histricamente las bacterias nitrificantes fueron los primeros organismos en los que se demostr la quimiolitotrofa (capacidad de un organismo de oxidar una sustancia inorgnica como fuente de energa); Winogradsky demostr que eran capaces de producir materia orgnica y masa celular cuando se les suplementaba con CO2 como nica fuente de carbono. En las membranas de las bacterias nitrificantes se ubica la enzima clave de la oxidacin del amonaco, amonaco monooxigenasa, que oxida el NH3 hasta hidroxilamina (NH2OH); este ltimo es oxidado a nitrito mediante la accin de otra enzima, la hidroxilamina oxidoreductasa presente en el periplasma de las bacterias nitrosificantes. Las bacterias oxidantes de nitritos emplean la enzima nitrito oxidoreductasa para oxidar el nitrito a nitrato.

Primera reaccin

Segunda reaccin

NH3, NH4+

oxidacin Bacterias comunes del suelo

NO2-

oxidacin

NO3-

Primera reaccin

2NH3 + 3O2

Bacterias del gnero Nitrosomonas

2NO2- + 2H2O + 2H+

Es txico para muchas plantas, no se acumula Segunda reaccin

2NO2 + O2

Nitrobacter

2NO3-

suelo

Raices plantas

Nitrosomonas y Nitrobacter juegan un papel central en el reciclado del nitrgeno

La combinacin de amonificacin y nitrificacin devuelve a una forma asimilable por las plantas, el nitrgeno que ellas tomaron del suelo y pusieron en circulacin por la cadena trfica.

La enzima de membrana amonaco monooxigenasa, oxida el NH3 hasta hidroxilamina; la hidroxilamina oxidoreductasa presente en el periplasma de las bacterias nitrosificantes oxida la hidroxilamina a nitrito. Las bacterias oxidadoras de nitritos emplean la enzima nitrito oxidoreductasa para oxidar el nitrito a nitrato.

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Asimilacin
consumo de E clula vegetal amino ac protenas transferencia a ac.nucleicos

NO3-

NH4+

nucletidos
Proceso de asimilacin

plantas animales

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El ciclo se completa
plantas
mueren

animales
mueren

suelo Compuestos nitrogenados

Procesados por los microorganismos del suelo Adsorbidos por las races de las plantas

Reconvertidos a compuestos orgnicos

Se vuelve a completar el ciclo.

Los microorganismos son clave en el ciclo del nitrgeno en la naturaleza

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Ciclo del nitrgeno

Los organismos auttrofos requieren tpicamente un suministro de nitrgeno en forma de nitrato (NO3-), mientras que los hetertrofos lo necesitan en forma de grupos amino (-NH2), y lo toman en sus alimentos formando parte de la composicin de distintas biomolculas. Los auttrofos reducen el nitrgeno oxidado que reciben como nitrato (NO3-) a grupos amino, reducidos (asimilacin). Para volver a contar con nitrato hace falta que los descomponedores lo extraigan de la biomasa dejndolo en la forma reducida de in amonio (NH4+), proceso llamado amonificacin; y que luego el amonio sea oxidado a nitrato, proceso llamado nitrificacin. El ciclo se completa con los procesos de fijacin de nitrgeno, que origina compuestos solubles a partir del N2, y la desnitrificacin que es una forma de respiracin anaerobia que devuelve N2 a la atmsfera completando el ciclo.

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Las plantas pueden tomar el amonio y el nitrato a travs de las races y pueden usarlos para la sntesis de sus protenas y los cidos nucleicos. Los animales obtienen su nitrgeno al comer las plantas o a otros animales. En el metabolismo de los compuestos nitrogenados en los animales acaba formndose in amonio que es muy txico y debe ser eliminado. Esta eliminacin se hace en forma de amonaco (algunos peces y organismos acuticos), o en forma de urea (el hombre y otros mamferos) o en forma de cido rico (aves y otros animales de zonas secas). Estos compuestos van a la tierra o al agua de donde pueden tomarlos de nuevo las plantas o ser metabolizados por diferentes organismos.

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Los animales, que no oxidan el nitrgeno, se deshacen del que tienen en exceso en forma de distintos compuestos. Los acuticos producen directamente amonaco (NH3), que en disolucin se convierte en in amonio. Los terrestres producen urea, (NH2)2CO, que es muy soluble y se concentra fcilmente en la orina; o compuestos nitrogenados insolubles como la guanina y el cido rico, que son purinas, y sta es la forma comn en aves o en insectos y, en general, en animales que no disponen de un suministro garantizado de agua. El nitrgeno biolgico, en la mayor parte en ecosistemas continentales, es convertido a amonio por la accin de microorganismos descomponedores.

(NH2)2CO urea

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Perdida de nitrgeno del suelo

Remocin de plantas del suelo Desaparicin de la capa superior del suelo por erosin o por destruccin por el fuego. Lixiviacin por el agua que se filtra a travs del suelo y arrastra los iones nitrogenados. Proceso de desnitrificacin en suelos poco drenados por el metabolismo bacteriano.

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Recuperacin del nitrgeno del suelo

Por fijacin simbitica ( a travs de la simbiosis rhizobium-leguminosa). Por fijacin qumica ( descargas elctricas). Por fijacin industrial ( agregado de fertilizantes nitrogenados).

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Los procesos principales que componen el ciclo del nitrgeno que pasa por la biosfera, la atmsfera y la geosfera son cinco: 1- La fijacin del nitrgeno 2- la toma del nitrgeno (crecimiento de organismos) 3- la mineralizacin del nitrgeno (desintegracin) 4- la nitrificacin 5- la denitrificacin. Los microorganismos, particularmente las bacterias, juegan un importante papel en todas las principales transformaciones del nitrgeno. Como procesos de mediacin microbiana, ocurren ms rpidamente que los procesos geolgicos, tales como los movimientos de placas, que es un proceso puramente fsico. La velocidad de las transformaciones llevadas a cabo por los microorganismos se ven afectadas por factores ambientales como la temperatura, la humedad y la disponibilidad de recursos que influyen en la actividad microbiana.

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1- La fijacin del nitrgeno

Proceso por el cual el N2 se convierte en amonio. Este proceso es esencial porque es la nica manera en la que los organismos pueden obtener nitrgeno directamente de la atmsfera. N2 NH4+ Algunas bacterias, por ej. las del gnero Rhizobium, son unos de los pocos organismos que fijan nitrgeno a travs de procesos metablicos. Esta simbiosis ocurre con la familia de las leguminosas. En esta relacin, la bacteria que fija el nitrgeno habita los ndulos de las races de las legumbres y reciben carbohidratos y un ambiente favorable de su planta anfitriona a cambio de parte del nitrgeno que ellas fijan.

Parte del sistema de la raz de una planta de trebol nodulada por Rhizobium.

Existen tambin bacterias que fijan nitrgeno sin plantas anfitrionas. stas son conocidas como fijadores libres de nitrgeno. Es el caso de las algas azul verdosas o cianobacterias que constituyen un importante fijador de nitrgeno en ambientes acuticos

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Adems del nitrgeno que fija la bacteria hay eventos naturales que pueden causar la fijacin de pequeas, pero significativas cantidades de nitrgeno. Fijacin biolgica (microorganismos) Fijacin de N2 Fijacin por eventos naturales
relmpagos fuegos forestales flujos de lava quemado de combustible fsil

Fijacin antropognica

fertilizantes nitrogenados sintticos cultivo de legumbres que fijan N2

A travs de diversas actividades como el quemado de combustible fsil, la incorporacin de fertilizantes sintticos y el cultivo de legumbres, los seres humanos han duplicado en el curso del siglo XX la cantidad de nitrgeno que se dispersa en la biosfera cada ao.

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Aumento de la fijacin antropognica de nitrgeno en relacin a la fijacin natural.

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2- La toma del Nitrgeno NH4+ N orgnico

El amonio producido por el nitrgeno que fija la bacteria es usualmente incorporado rpidamente en la protena y otros compuestos de nitrgeno orgnico, ya sea por la planta anfitriona, por la misma bacteria, o por otro organismo del suelo. Cuando los organismos ms cercanos a lo alto de la cadena alimenticia (como nosotros) comen, incorporan el nitrgeno que ha sido inicialmente fijado a travs del nitrgeno que fija la bacteria.

3- La Mineralizacin del Nitrgeno

El N orgnico NH4+ Luego que el nitrgeno se incorpora en la materia orgnica, frecuentemente se vuelve a convertir en nitrgeno inorgnico a travs de un proceso llamado mineralizacin del nitrgeno, tambin conocido como desintegracin. Cuando los organismos mueren, los organismos descomponedores (como las bacterias y los hongos) consumen la materia orgnica y llevan al proceso de descomposicin. Durante este proceso, una cantidad significativa del nitrgeno contenido dentro del organismo muerto se convierte en amonio. Una vez que el nitrgeno est en forma de amonio, est tambin disponible para ser usado por las plantas o para transformaciones posteriores transformndolo en nitrato (NO3-) a travs del proceso llamado nitrificacin.

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4- La nitrificacin
NH4+ NO3Parte del amonio producido por la descomposicin se convierte en nitrato a travs de un proceso llamado nitrificacin. Las bacterias que llevan a cabo esta reaccin obtienen energa de la misma. La nitrificacin requiere la presencia del oxgeno. Por consiguiente, la nitrificacin puede suceder solamente en ambientes ricos de oxgeno, como las aguas que circulan o que fluyen y las capas de la superficie de los suelos y sedimentos. El proceso de nitrificacin tiene algunas importantes consecuencias. Los iones de amonio tienen carga positiva y por consiguiente se pegan a partculas y materias orgnicas del suelo que tienen carga negativa. La carga positiva previene que el nitrgeno de amonio sea barrido (o lixiviado) del suelo por las lluvias. Por otro lado, el in de nitrato con carga negativa no se mantiene en las partculas del suelo y puede ser barrido del perfil de suelo. Esto lleva a una disminucin de la fertilidad del suelo y a un enriquecimiento de nitrato de las aguas corrientes de la superficie y del subsuelo (contaminacin).

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5- La denitrificacin
NO3N2+ N2O A travs de la denitrificacin, las formas oxidadas de nitrgeno como el nitrato y el nitrito (NO2-) se convierten en dinitrgeno (N2) y, en menor medida, en gas xido nitroso (N2O). La denitrificacin es un proceso anaerbico llevado a cabo por bacterias que utilizan compuestos nitrogenados como aceptores de electrones en la respiracin anaerbica y que pueden convertir el nitrato en formas ms reducidas de nitrgeno (NO, N2O, N2) que se van a la atmsfera dando lugar al proceso de desnitrificacin a travs de la siguiente secuencia de reacciones: NO3NO2NO N2O N2. El xido ntrico y el xido nitroso son gases importantes para el ambiente. El xido ntrico (NO) contribuye a formar smog, y el xido nitroso (N2O) es un gas de invernadero importante, por lo que contribuye a los cambios globales climatolgicos. Una vez que se convierte en dinitrgeno, el nitrgeno tiene pocas posibilidades de reconvertirse en una forma biolgica disponible, ya que es un gas y se pierde rpidamente en la atmsfera. La denitrificacin es la nica trasformacin del nitrgeno que remueve el nitrgeno del ecosistema (que es esencialmente irreversible), y aproximadamente balancea la cantidad de nitrgeno fijado por los microorganismos fijadores de nitrgeno.

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Reduccin de nitratos y desnitrificacin. Las formas de nitrgeno inorgnico ms comunes en la naturaleza son el amonaco y el nitrato, que se pueden originar ambas en la atmsfera por procesos qumicos inorgnicos, y el gas N2, un gas tambin atmosfrico, que es la forma ms estable del nitrgeno en la naturaleza. El proceso de desnitrificacin, el cual es estrictamente anaerbico, es un proceso perjudicial para la agricultura; sin embargo para el tratamiento de aguas residuales es beneficioso ya que convierte el NO3- en N2, disminuyendo significativamente la cantidad de nitrgeno que puede estimular el crecimiento de algas (eutrofizacin). La desnitrificacin es empleada, en los procesos tcnicos de depuracin controlada de aguas residuales, para eliminar el nitrato, cuya presencia favorece la eutrofizacin y reduce la potabilidad del agua, porque se reduce a nitrito por la flora intestinal, y ste es cancergeno.

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Reduccin desasimiladora de nitrato Todas las enzimas que intervienen son desreprimidas por las condiciones anxicas. Algunos organismos como Escherichia coli solo pueden realizar el primer paso. Algunos procariotas pueden reducir el NO3- a NH4+ en el metabolismo desasimilador.

NH3

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Reduccin de nitratos

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a) NO3-

Reduccin asimilativa (plantas, hongos, bacterias).

b) Reduccin desasimilativa (bacterias).

a) Nitrato reductasa, enzima soluble, contiene molibdeno, se inhibe por NH3. NO3luego NO2NO2-

NH2OH NH3 N orgnico (R-NH2) hidroxilamina Nitrito reductasa, inhibible por NH3 amino cidos, protenas, nucletidos

b) Nitrato reductasa, enzima particulada, su sntesis es reprimida por el O2. NO3Luego NO2o NH3 NO oxido ntrico NO2N2O oxido nitroso
atmosfera

N2

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Ciclo del nitrgeno

El ciclo del nitrgeno consiste en varios bancos o bolsas de almacenamiento de nitrgeno y de procesos por los cuales las bolsas intercambian nitrgeno (flechas)

Las flechas amarillas indican las fuentes humanas de nitrgeno para el ambiente. Las flechas rojas indican las transformaciones microbianas del nitrgeno. Las flechas azules indican las fuerzas fsicas que actan sobre el nitrgeno. Y las flechas verdes indican los procesos naturales y no microbianas que afectan la forma y el destino del nitrgeno.

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FIJACIN BIOLGICA DE NITRGENO

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Hay dos procesos fundamentales que aseguran la disponibilidad de carbono y de nitrgeno por los seres vivos. Estos son la fotosntesis y la fijacin biolgica de N2. vegetales Fotosntesis Algunos procariotas Fijacin biolgica de N2 (FBN) Solamente algunos procariotas (Eubacterias y Archaea) La fijacin de nitrgeno funciona en bacterias adaptadas a distintos ambientes ecolgicos y distintos estilos de vida. Todas poseen el sistema enzimtico responsable de la reduccin llamado nitrogenasa. El proceso de FN por los organismos se llama fijacin biolgica de nitrgeno (FBN). Se estima que actualmente la FBN es de 200 millones de toneladas por ao. La atmsfera contiene 1015 toneladas de N2. El ciclo del nitrgeno involucra 3x109 toneladas de N2/ao.

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Fijacin del Nitrgeno

La utilizacin del N2 como fuente de nitrgeno se llama fijacin de nitrgeno. Solo unos pocos microorganismos pueden fijar N2 N2 + 6e- + 6H+ 2 NH3 forma orgnica

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Fijacin biolgica del nitrgeno

El nitrgeno en forma de amonaco es la fuente de nitrgeno para todos los aminocidos. Los aminocidos son las piezas con las que se construyen las protenas y la fuente de nitrgeno para muchas otras molculas importantes como las purinas, pirimidinas, grupos prostticos, etc.

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Los esqueletos carbonados de los aminocidos provienen de la va glicoltica, la va de las pentosas o el ciclo del cido ctrico.

En azul se muestran los productos biosintticos derivados de precursores metablicos intermediarios

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Los microorganismos utilizan ATP y un potente reductor para reducir el nitrgeno atmosfrico a amonaco.
Este proceso recibe el nombre de fijacin del nitrgeno. Los organismos superiores son incapaces de fijar N2. Solamente algunas bacterias y arqueobacterias son capaces de fijar nitrgeno. Las bacterias simbiticas Rhizobium forman ndulos en las races de las plantas leguminosas en donde fijan el N2. Los organismos diaztrofos fijan aproximadamente el 60% de todo el N2 que se fija en la Tierra. Los rayos y la radiacin UV fijan un 15% y el 25% restante se fija por procesos industriales.

Mtodo de Fritz Haber en 1910. Se realiza a partir de H2 gaseoso en presencia de un catalizador de hierro a unos 500oC y a una presin de 300 atmsferas. N2 + 3H2 2NH3 El enlace N = N tiene una energa de 225 kcal mol-1 y es muy resistente al ataque qumico.

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El complejo nitrogenasa
El proceso de fijacin biolgica del N2 requiere de un complejo enzimtico con mltiples centros redox. El complejo nitrogenasa est formado por dos protenas: una reductasa, que aporta los electrones con elevado poder reductor y una nitrogenasa que utiliza estos electrones para reducir el N2 a NH3. La transferencia de electrones desde el componente reductasa al componente nitrogenasa est acoplada a la hidrlisis de ATP por parte de la reductasa. El complejo nitrogenasa es sumamente sensible a la inactivacin por O2, el cual la inhibe en forma irreversible. En los ndulos la concentracin de O2 se mantiene baja gracias a la leghemoglobina, una protena homloga a la hemoglobina.

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Debido a la gran estabilidad del triple enlace entre los dos tomos de N, el N2 es muy inerte, y su activacin es un proceso que requiere mucha energa. Se deben transferir 6 electrones para reducir el N2 a 2 NH3 a travs de una serie de pasos intermediarios. Se cree que los tres pasos sucesivos de reduccin se producen directamente en la nitrogenasa, sin acumulacin de intermediarios libres.

diimina

hidrazina

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La fijacin de nitrgeno en la naturaleza es muy reductora y el oxgeno inhibe el proceso porque la dinitrogenasa reductasa es inactivada rpida e irreversiblemente por O2 (incluso cuando se aisla de fijadores de nitrgeno aerbicos). En bacterias fijadoras de N2 aerbicas, la fijacin de N2 se realiza en presencia de O2 en clulas enteras pero no en preparaciones purificadas de la enzima. En estos organismos, la nitrogenasa es protegida de la inactivacin por el O2, bien sea eliminando rpidamente el O2 por respiracin, bien produciendo capas mucosas que retardan el O2, o bien mediante la compartimentacin de la nitrogenasa en un tipo especial de clula (el heterocisto). Adems, aunque la fijacin de N2 no tiene lugar en extractos celulares xicos, en fijadores aerbicos de nitrgeno como Azotobacter la nitrogenasa se protege de la inactivacin por el oxgeno mediante formacin de complejos con una protena especfica. Este proceso se conoce como proteccin conformacional. Proteccin de la actividad nitrogenasa frente al O2 1- Consumo rpido del O2 2- capas mucosas 3- Compartimentalizacin 4- Proteccin conformacional

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Microorganismos fijadores de N2

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La fijacin de nitrgeno por la simbiosis leguminosa Rhizobium tiene una gran importancia en la agricultura porque causa un aumento significativo del nitrgeno combinado en el suelo. Una de las simbiosis mas efectivas se establece entre Bradyrhizobium japonicum y soja, donde el 70% de FN por la bacteria es asimilada por la planta. En condiciones normales, ni las leguminosas ni Rhizobium pueden fijar nitrgeno. En cultivo axnico, Rhizobium puede fijar N2 slo si se cultiva en condiciones microaeroflicas estrictamente controladas. Aparentemente, Rhizobium necesita algo de O2 para generar energa para la fijacin de N2; sin embargo la nitrogenasa es inactivada por el O2. En el ndulo las concentraciones exactas de O2 estan controladas por la leghemoglobina, que es una protena que se une al O2. Es una protena que contiene hierro. Su formacin es inducida por la interaccin de ambos organismos. La leghemoglobina funciona como tampn de oxgeno manteniendo una concentracin de O2 dentro del ndulo baja pero constante. En el interior del ndulo la relacin entre el O2 ligado a la leghemoglobina y el O2 libre es del orden de 10.000:1.

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Complejo nitrogenasa

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Esquema de la reaccin
En principio, la reduccin de N2 a NH3 es un proceso en el que intervienen seis electrones. 2NH3 N2 + 6e- + 6H+ La reaccin biolgica genera al menos un mol de H2, adems de dos moles de NH3 por cada mol de N2. 2NH3 + H2 N2 + 8e- + 8H+ Los 8 e- de elevado potencial proceden de la ferredoxina reducida, generada durante la fotosntesis o procesos oxitativos. Por cada molcula de N2 reducida se hidrolizan al menos 16 molculas de ATP. 2NH3+H2+16 ADP+16 Pi N2+8e-+8H++16ATP

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Fijacin de nitrgeno
Flujo de eFerredoxina nitrogenasa reductasa nitrogenasa N2 NH3 La ruptura del piruvato a acetil -CoA + CO2 da el potencial reductor necesario para reducir la ferredoxina. La unin y ruptura de ATP en ADP + Pi es requerida tambin para bajar el potencial de reduccin de la nitrogenasa (Ede - 0.25 V a - 0.40 V) y hacer posible la ruptura del enlace covalente triple entre los dos tomos de N.

nitrogenasa reductasa (Fe) dmero 60 kDa Complejo nitrogenasa nitrogenasa (Fe-Mo-Co) tetramero 22,240 kDa

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Fe-protena
El componente reductasa y nitrogenasa del complejo nitrogenasa son protenas ferrosulfuradas, en las cuales el hierro se encuentra entrelazado con un tomo de azufre de un residuo de cistena y con sulfuro inorgnico. La reductasa o ferro-protena , es un dmero de subunidades idnticas de 30 kd conectadas mediante una agrupacin 4Fe-4S. La funcin de la reductasa es la transferencia de e- desde un donante apropiado, como la ferredoxina reducida, al componente nitrogenasa. La unin e hidrlisis de ATP desencadena un cambio conformacional que acerca el componente reductasa al componente nitrogenasa, para as poder transferir su electrn hasta el centro donde se reduce el nitrgeno.

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El componente nitrogenasa es un tetrmero 22 (240 kd). Los electrones se incorporan a las agrupaciones P, localizadas en la interfase -. Estas agrupaciones estn formadas por 8 tomos de hierro y 7 iones sulfuro. Cada agrupacin se une a la protena mediante 6 residuos de cistena. Los electrones se desplazan desde la agrupacin P hacia el cofactor FeMo. El cofactor FeMo de la nitrogenasa, tambin llamada molibdeno-ferroprotena, es el lugar donde se fija el nitrgeno. Cada uno de los 6 tomos centrales de hierro est unido solamente a 3 tomos, lo que deja abierta la posibilidad de que se una el N2. Probablemente el N2 se une a la cavidad central de este cofactor. La formacin de mltiples interacciones Fe-N en este complejo debilita el triple enlace en el N2, y por lo tanto disminuye la barrera de activacin para la reduccin.

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Estructura del cofactor FeMo, molibdeno-ferro-protena (MoFe-protena).

En el cofactor con hierro y molibdeno de la nitrogenasa el cubo Fe7S8 se une al molibdeno, y esta estructura se une a los tomos de oxgeno del homocitrato (todos los tomos de oxgeno se muestran en verde) y a los tomos N y S de la nitrogenasa. Por cada molcula de nitrogenasa hay dos molculas de FeMo-co.

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Complejo nitrogenasa
Est constituido por dos metaloprotenas y contiene tres tipos de grupos prostticos.
2 unidades de dinitrogenasa

2 unidades de dinitrogenasa reductasa El complejo nitrogenasa (MR 300000; 4Fe-S; 2 Mo; 30 Fe/30 S)

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Funcin de la nitrogenasa.
a) Pasos de la fijacin de N2 empezando por el piruvato. Los electrones son aportados desde la dinitrogenasa reductasa a la dinitrogenasa, de uno en uno, y cada electrn se asocia con la hidrlisis de 2-3 ATPs. b) Pasos hipotticos en la reduccin de N2 y liberacin de H2 y resumen de la actividad nitrogenasa.

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Gentica y regulacin de la fijacin de N2 El proceso de fijacin de N2 tiene una elevada demanda energtica. En Klepsiella neumoniae los genes genes de la nitrogenasa y de la nitrogenasa reductasa son parte del reguln nif que ocupa 24 kb de DNA y contiene 20 genes (estructurales, regulatorios y que intervienen en el transporte de electrones) dispuestos en varias unidades transcripcionales. En K. neumoniae la fijacin de N2 slo tiene lugar en condiciones anaerbicas.

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Nitrogenasa

subunidad subunidad

nifD nifK

Nitrogenasa reductasa (dmero)

nifH

nifN nifV
FeMo-co

regulador positivo regulador negativo

nifA nifL

nifZ nifW nifB nifQ

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La nitrogenasa es una protena altamente conservada. En todos los fijadores de N2 examinados, genes similares a nifHDK estn presentes, lo que sugiere que los requerimientos genticos para la nitrogenasa son bastante especficos. La nitrogenasa est sometida a controles regulatorios muy estrictos. La fijacin de nitrgeno se bloquea por O2 y por nitrgeno fijado, incluyendo NH3, NO3- y algunos aminocidos. La mayor parte de esta regulacin es a nivel transcripcional. El NH3 reprime la fijacin de N2 mediante la protena NtrC, cuya actividad est regulada por el estado de nitrgeno de la clula. Cuando hay limitacin de amoniaco NtrC activa y promueve la transcripcin de nifA, el gen que da lugar a la produccin de NifA, la protena activadora de la fijacin de nitrgeno, y se inicia la transcripcin de nif.

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El amonaco producido por la nitrogenasa no reprime la enzima porque, tan pronto como se forma, se incorpora a forma orgnica y se usa en la biosntesis. Pero cuando hay altos niveles de NH3 en el medio, la enzima se reprime rpidamente para evitar malgastar ATP en la elaboracin de un producto que ya est en gran cantidad en el medio. En algunas bacterias fijadoras de N2, la actividad de la nitrogenasa est tambin regulada por NH3, un fenmeno llamado efecto interruptor del amonaco o efecto switch off. En este caso, el exceso de amonaco se une covalentemente a la nitrogenasa reductasa y sta pierde la actividad enzimtica. Cuando la concentracin de amonaco vuelve a ser factor limitante, est protena modificada se convierte en la forma activa y se reinicia la fijacin del N2. La regulacin por amonaco es un mtodo rpido y reversible de control del consumo de ATP por la nitrogenasa.

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Algunos sustratos artificiales que son estructuralmente similares al N2, como el acetileno y el cianuro, son tambin reducidos por la nitrogenasa. En el laboratorio la actividad nitrogenasa se mide fcilmente por cromatografa gaseosa midiendo la reduccin del acetileno a etileno ya que la nitrogenasa puede llevar a cabo esta reaccin.

Cuando comienza el experimento (a tiempo 0), los resultados no muestran C2H4, pero, a medida que pasa el tiempo la produccin de C2H4 aumenta. Cuando se produce etileno, se consume el acetileno. Si el vial contuviera un extracto enzimtico, las condiciones deberan ser anxicas, aunque la nitrogenasa procediera de una bacteria aerbica. La prueba directa de la fijacin de N2 se obtiene con un istopo no radioactivo de nitrgeno, 15N, como trazador y por espectrometra de masa.

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Algunas bacterias fijadoras de nitrgeno sintetizan nitrogenesas sin molibdeno en ciertas condiciones de crecimiento; son las denominadas nitrogenasas alternativas, que carecen de molibdeno y en su lugar contienen vanadio (y hierro) o solamente hierro. Estas nitrogenasas aseguran que se produzca la fijacin de nitrgeno cuando hay deficiencia de molibdeno en el hbitat. Se ha descubierto una nitrogenasa con molibdeno funcional y estructuralmente novedosa en el estreptomiceto termfilo Streptomyces thermoautotrophicus que es un procariota termfilo filamentoso. Este organismo fija nitrgeno pero su nitrogenasa no es reprimida por amonaco y no reduce el acetileno. Aunque la nitrogenasa contiene molibdeno, es completamente insensible al O2. El componente dinitrogenasa de la nitrogenasa de S. thermoautotrophicus , denomonado Str1, contiene 3 polipptidos diferentes que muestran algunas semejanzas estructurales con los polipptidos dinitrogenasa de otros fijadores de nitrgeno; pero el componente dinitrogenasa reductasa, conocido como Str2, no muestra ningn parecido con otras dinitrogenasa reductasa.

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Sin embargo, Str2 muestra una semejanza de secuencia muy elevada con las superxido dismutasas, que contienen manganeso. De hecho Str2 es una superxido dismutasa cuya funcin en la clula es consumir superxido (O2-), formando O2 en el proceso, e impidiendo as el dao oxidativo a los componentes celulares. Se ha demostrado que Str2 suministra electrones a Str1. La fuente de estos electrones es O2-, que forma parte de la reduccin de O2 por una molibdeno CO deshidrogenasa. Flujo de e- en la fijacin de nitrgeno clsica piruvato flavodoxina dinitrogenasa reductasa dinitrogenasa

Flujo de e- en thermoautotrophicus CO O2- Str2 Str1.

la

fijacin

de

nitrgeno

en

Streptomyces

Sorprendentemente, el oxgeno, en vez de inhibir la nitrogenasa, como sucede con todas las nitrogenasas que han sido examinadas, en S. thermoautotrophicus es necesario en el mecanismo de reaccin de la enzima.

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Claramente el sistema nitrogenasa de Streptomyces thermoautotrophicus es un sistema fijador de nitrgeno nico, tanto estructural como funcionalmente. Se desconoce si su verdadera funcin en la clula es la fijacin de nitrgeno pero este hallazgo ha renovado la esperanza de obtener por ingeniera gentica un sistema nitrogenasa aplicable a la produccin agrcola, por ejemplo, del maz. El hecho de que los componentes de esta nitrogenasa sean expresados constitutivamante, no sea lbil al oxgeno y su requerimiento energtico sea mucho menor (emplea solo 25 a 50% del ATP que utilizan las nitrogenasas clsicas), podra llegar a convertir en realidad el sueo de disponer algn da de cosechas fijadoras de nitgeno.

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Asimilacin de nitrgeno
La mayora de los organismos lo asimilan a partir de amonio o de nitrato. Pocos microorganismos pueden asimilarlo a partir de N2.

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Incorporacin de amonio
La incorporacin de nitrgeno en materiales orgnicos a partir de amonio es relativamente fcil porque esta en una forma mas reducida que otras formas de nitrgeno inorgnico. El amonio es incorporado inicialmente en el esqueleto de la cadena carbonada por uno de los dos mecanismos que siguen: 1) aminacin reductiva; 2) sistema glutamina sintetasaglutamato sintasa. Una vez incorporado, el nitrgeno puede ser transferido a otros esqueletos carbonados por las enzimas llamadas transaminasas.

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 La principal aminacin reductiva es la formacin de glutamato a partir de - cetoglutarato. En muchas bacterias y en hongos esta reaccin es catalizada por la glutamato deshidrogenasa, cuando la concentracin de amonio es elevada. -cetoglutarato + NH4+ + NADPH (NADH) + H+ Glutamato + NADP+(NAD+) + H2O Una vez sintetizado el glutamato, el grupo amino puede ser transferido a otros esqueletos carbonados por transaminasas especficas que poseen la coenzima piridoxal fosfato (PLP), la cual es responsable de la transferencia del grupo amino.

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Pathway asimilatorio de amonio

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El ion amonio se incorpora a los aminocidos a travs de glutamato y de glutamina

El glutamato y la glutamina desempean un papel crucial en la la etapa de incorporacin de nitrgeno a las biomolculas a partir del in NH4+. El grupo amino de la mayora de los aminocidos proviene del -amino grupo del glutamato por una reaccin de transaminacin. La glutamina, otro dador importante de nitrgeno aporta el nitrgeno de su cadena lateral a la biosntesis de una amplia gama de compuestos biolgicos. El glutamato se sintetiza a partir de NH4+ y -cetoglutarato, un intermediario del ciclo del cido tricarboxlico por accin de la glutamato deshidrogenasa. 1) NH4+ + -cetoglutarato + NADPH + H+ L-glutamato + NADP+ + H2O

La enzima glutamina sintetasa incorpora un segundo in amonio al glutamato para dar la glutamina. Esta amidacin est dirigida por la hidrlisis del ATP. 2) Glutamato + NH4+ + ATP glutamina + ADP + Pi + H+

La regulacin de la glutamina sintetasa juega un rol crucial en el metabolismo del nitrgeno. Todos los organismos tienen glutamato deshidrogenasa y glutamino sintetasa.

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La mayora de los procariotas tienen tambin una enzima que no est emparentada evolutivamente con las anteriores, la glutamato sintasa, que cataliza la aminacin reductiva del -cetoglutarato. El dador de nitrgeno en esta reaccin es la glutamina. Se forman dos molculas de glutamato. 3) -cetoglutarato + glutamina + NADPH + H+ 2 glutamato + NADP+

Cuando el NH4+ es el factor limitante, la mayor parte del glutamato se produce por la accin secuencial de la glutamina sintetasa y la glutamato sintasa. La suma de estas reacciones (2 + 3) es: NH4+ + -cetoglutarato + NADPH + ATP glutamato + NADP+ + ADP + Pi

Esta va es ms costosa porque usa ATP. Sin embargo a veces los procariotas utilizan esta va porque el valor del Km de la glutamato deshidrogenasa para el NH4+ es elevado (aproximadamente 1mM) y, por lo tanto esta enzima no esta saturada cuando el NH4+ escasea. Por el contrario la afinidad de la glutamina sintetasa hacia el NH4+ es muy elevada. Por lo tanto, para captar el amoniaco cuando ste escasea, es necesaria la hidrlisis del ATP. El resto de los aminocidos se sintetizan a partir de intermediarios del ciclo del cido tricarboxlico y de otros importantes intermediarios metablicos.

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Si bien las vas para la biosntesis de aminocidos son muy variadas, los esqueletos carbonados provienen de intermediarios de la gliclisis, de la va de las pentosas fosfato o del ciclo del cido ctrico. En base a estas consideraciones de partida, los aminocidos se pueden agrupar en seis familias biosintticas.

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Los seres humanos pueden sintetizar algunos aminocidos pero deben obtener el resto a partir de la dieta

La denominaciones esenciales o no esenciales hacen referencia a las necesidades de un organismo bajo una serie de condiciones concretas.

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Las deficiencia de tan solo un aminocido da lugar a un balance de nitrgeno negativo. En estas condiciones se degrada ms protena de la que se sintetiza y, por lo tanto, se excreta ms nitrgeno del que se ingiere. Los aminocidos no esenciales se sintetizan mediante reacciones bastante sencillas, mientras que las vas para la formacin de aminocidos esenciales son bastante complejas. Por ej. los aminocidos alanina y aspartato se sintetizan en un nico paso a partir de piruvato y de oxalacetato respectivamente. Por el contrario las vas de los aminocidos esenciales requieren entre 5 y 16 pasos. La nica excepcin a este patrn es la sntesis de novo de arginina que requiere 10 etapas, aunque habitualmente se sintetiza en slo 3 pasos a partir de la ornitina como parte del ciclo de la urea. La tirosina, clasificada como aminocido no esencial, porque se puede sintetizar en un solo paso a partir de la fenilalanina, necesita 10 etapas para sintetizarse a partir de cero y resulta esencial cuando la fenilalanina escasea. aspartato + -cetoglutarato alanina + -cetoglutarato

Oxalacetato + glutamato Piruvato + glutamato

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Bibliografa

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FIN

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