1

5. Enzimas
- Identificar y mencionar el papel de vitaminas hidrosolubles como precursores de
las coenzimas e identificar al magnesio, al manganeso y al fierro como ejemplos de
cofactores metlicos.
- Conocer los conceptos de zimgeno e isoenzima y su importancia biolgica.
- Entender el mecanismo de accin de las enzimas, definir el concepto de
especificidad y velocidad de reaccin.
- Cintica enzimtica
- Identificar en una reaccin enzimtica al sustrato, al complejo enzima-sustrato y al
producto.
- Conocer las ecuaciones de Michaelis Menten y de Lineweaver-Burk para definir la
velocidad de una reaccin enzimtica y el significado de los valores de Vmx y de Km
y su importancia biolgica (hexocinasa y glucocinasa).
- Discutir las estrategias de control de la actividad de las enzimas: disponibilidad de
sustrato, modificacin covalente, alosterismo, retroalimentacin y concentracin de la
enzima.
- Identificar el mecanismo de accin de inhibidores y moduladores alostricos
biolgicos y farmacolgicos sobre la actividad de las enzimas (nucletidos de adenina
y aspirina).
- Conocer el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica y lo
asociar a algunos padecimientos.
Aplicacin clnica 1: Aspectos mdicos de la enzimologa
2

Aplicacin clnica 2: Aplicar el concepto de enzimas de escape en el diagnstico clnico
de las siguientes enfermedades: hepatitis, infarto al miocardio, cncer seo, cncer de
prstata.
Aplicacin clnica 3: Describir la etiologa de los padecimientos congnitos del
metabolismo como fenilcetonuria, albinismo, anemia en relacin con la glucosa 6 fosfato
deshidrogenasa.
- Conocer la funcin y clasificacin de las enzimas.
- VISION DE CONJUNTO
-
- En los sistemas biolgicos, prcticamente todas las reacciones qumicas estn
mediadas por enzimas que son protenas, con la excepcin de algunas molculas de
ARN que catalizan su propio empalme o autoprocesamiento (splicing) denominadas
ribozimas.
- Las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones sin experimentar cambios en el
proceso. Entre las muchas reacciones biolgicas que son energticamente posibles,
las enzimas conducen selectivamente los reactantes (sustratos) en vas tiles.
- La catlisis es necesaria, porque a la temperatura y el pH en que se desarrollan las
reacciones qumicas de los seres vivos, no ocurriran a la tasa suficiente para apoyar
por ejemplo la actividad muscular, la generacin del impulso nervioso y todos aquellos
procesos requeridos para la vida.
- En este captulo se examina la naturaleza de estas molculas catalticas y sus
mecanismos de accin.
-
3

INTRODUCCIN Y CONCEPTOS
- Definir los conceptos de catalizador, enzima, ribozima, coenzima, cofactor y
grupo prosttico.
En las reacciones del metabolismo intermediario del organismo participan molculas
proteicas o de RNA catalizadoras, capaces de acelerar la velocidad de las mismas. La
mayora son de naturaleza proteica; sin embargo, algunas molculas de RNA tambin
cumplen con esta funcin. Las enzimas son indispensables para la vida, puesto que
cualquier ausencia de expresin o su presencia en cantidades insuficientes interfieren con la
homeostasis del organismo.
En general, estas protenas son globulinas de estructura terciaria o cuaternaria, con
aminocidos de diferentes porciones mono o multicatenarias que le permiten formar un sitio
activo cataltico, mediante el cual interactan con sustratos especficos para transformarlos
en productos especficos con un mnimo de energa de activacin que aumenta la velocidad
de la misma, sin modificarse, utilizarse o consumirse en el proceso de generacin de
productos. Estas enzimas pueden ser estructuras monomricas u oligomricas, o pueden
formar parte de un complejo multienzimtico.
EFECTO DE LOS GRUPOS PROSTTICOS COENZIMAS Y METALES.
Algunas enzimas son protenas simples porque no contienen componentes no protecos
unidos a la parte proteca (apoproteina) de la enzima
Cuando el grupo prosttico de una protena no est covalentemente unido, frecuen temente
se encuentra disociado de la protena y puede removerse por dilisis, en cuyo caso, se
denomina coenzima. An en el caso de que una coenzima no est covalentemente unida a la
protena, frecuentemente tiene una afinidad muy alta para la unin a la enzima, que bajo
condiciones ordinarias permanecer unida a la enzima. Numerosas enzimas tambin pueden
verse como si estuvieran unidas a un segundo sustrato en la reaccin enzimtica. En virtud
de que estos compuestos que existen con las enzimas en pequeas cantidades funcionan de
una manera semejante en numerosas reacciones enzimticas, han sido agrupados en la
4

categora especial de coenzimas. Varias coenzimas comunes son derivados de vitaminas
hidrosolubles. Una enfermedad que surge de la deficiencia de una vitamina, debe ser el
resultado de una falta de una cantidad suficiente de la coenzima correspondiente para
reacciones enzimticas importantes.
Una situacin parecida resultara verdadera para la interaccin de protenas con metales.
Numerosas enzimas son activadas por metales especficos que son fcilmente removibles de
la protena. Otras protenas contienen metales que estn fuertemente unidos a ellas y que
siempre se aslan con la protena. Estas ltimas protenas se denominan metalo-enzimas. En
el caso de que las protenas tales como la hemoglobina y los citocromos, el metal en este
caso Fe++ o Fe+++ es parte de un grupo prostetico denominado HEM, mientras que en otros
casos el ion metlico est directamente unido a la protena.
Los iones ms frecuentemente encontrados en las enzimas son: Mg en las
fosfotransferasas, Zn en la deshidrogenasa alcohlica, Mn en arginasa, Fe++ en la
ferredoxina y Ca++ en la citocromo oxidasa.

COENZIMAS ACCIN VITAMINA
Oxidorreductasas
nicotin adenin dinucle
tido (NAD)
transferencia de
hidrgeno
Nicotinamida
fsforo pidiendo clio tido transferencia de
hidrgenos
Nicotinamida
nicotinamida adenina
dinucletido fosfato n a d
p
transferencia de
hidrgenos
Nicotinamida
flavin adenin dinucletido transferencia de
hidrgeno
Riboflavina
flavin mononcleo tido transferencia de
hidrgeno
Riboflavina

B) TRANSFERASAS
tadenosn trifosfato
(ATP)

5

Fosfo adenosil fosfo
sulfato ( p a p s)
Transferencia de sulfatos ---
Citidin difosfato (CDF) Transferencia de lipidos ---
Uridin difosfato (UDF) Transferencia de
azucares
---
S-adenosilmetionina
(SAM)
Transferencia de grupos
metilo
----
Tetrahidrofolato (THF) Met y transf de formiato Acido Folico
biotina coenzima carboxilaciones Biotina
Co_A.SH Transf gr acilos Ac Pantotenico
Pirofosfato de tiamina
(PPT)
Transf de acetaldehdo
activo
Tiamina
C) ISOMERASAS Y
LIASAS

Uridin difosfato (UDF) isomerizacion de
azucares
----
Fosfato de piridoxal descarboxilaciones Piridoxina
Pirofosfato de tiamina
(PPT)
descarboxilaciones Tiamina
Coenzima B12 Desplazamiento de
carboxilos
Cobalamina




CARACTERSTICAS DE LAS ENZIMAS.
Las enzimas pueden incrementar la velocidad de la reaccin por un factor arriba de 10
16
con
respecto a una reaccin no catalizada.
Su gran estereoespecifidad, capaces de diferenciar entre enantimeros y entre grupos
funcionales prcticamente idnticos.
La velocidad de la reaccin depende sobre su energa de activacin, G.
6

No llevan a cabo reacciones que sean energticamente desfavorables.
No modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aceleran su consecucin.
La caracterstica ms sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad del sustrato.
Las enzimas reconocen selectivamente sus sustratos sobre otras molculas.
Las enzimas generan productos con rendimiento superior al 98%, lo que determina la
ausencia de sub-productos.
Protege del desaprovechamiento de metabolitos en las clulas.
Las enzimas son polmeros biolgicos que catalizan las reacciones qumicas que hacen
posible la vida como la conocemos.
La presencia y el mantenimiento de un completo y equilibrado conjunto de enzimas es
esencial para la descomposicin de nutrientes que suministran energa y la construccin de
qumica bloques , el conjunto de estos bloques de construccin en las protenas ,
ADN , membranas , clulas y tejidos , y el aprovechamiento de energa para la motilidad
celular y la potencia muscular contraccin . Con la excepcin de algunos ARN cataltico
molculas, o ribozimas , la gran mayora de las enzimas son protenas . Las deficiencias en
la cantidad o la actividad cataltica de enzimas clave pueden resultar de defectos genticos,
dficiencias nutricionales o presencia de toxinas. Las enzimas defectuosas pueden surgir a
partir de mutaciones genticas o una infeccin por virus o bacterias patgenos (por ejemplo,
Vibrio cholerae ) . Los cientficos mdicos corrigen los desequilibrios en la actividad
enzimtica mediante el uso de frmacos que inhiben enzimas especficas e investigan los
beneficios de la terapia gnica como un medio para remediar las deficiencias en el nivel de
la enzima o funcin. Las enzimas son catalizadores altamente efectivos y especficos. Las
enzimas que catalizan la conversin de uno o ms compuestos (sustratos) en uno o ms
diferentes compuestos (productos) mejoran las tasas de las reacciones correspondientes no
catalizadas por factores de por lo por lo menos 10
6
. Como todos los catalizadores, las
enzimas no son ni consumen ni son permanentemente alteradas como consecuencia de su
participacin en una reaccin. Adems de ser altamente eficientes, las enzimas son tambin
catalizadores muy selectivos. A diferencia de la mayora de los catalizadores utilizado en la
qumica sinttica, las enzimas son especficas tanto para el tipo de reaccin catalizada y para
un solo sustrato o un pequeo conjunto de sustratos estrechamente relacionados. Las
enzimas tambin son catalizadores estereoespecficos y tpicamente catalizar reacciones
slo de estereoismeros especficos de un determinado compuesto - por ejemplo, D - pero
no L - azcares , L - pero
no D-aminocidos . Dado que se unen a travs de sustratos al menos " tres puntos de
anclaje , " las enzimas pueden incluso convertir sustratos no quirales a los productos quirales
. Figura 7-1 ilustra la razn por la reduccin catalizada por enzimas de la piruvato sustrato no
quiral produce L lactato en lugar de una mezcla racmica de D - y L - lactato. La exquisita
especificidad de catalizadores enzimticos impregna las clulas vivas



7



La caracterstica ms sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad del sustrato.
Las Enzimas reconocen selectivamente sus sustratos sobre otras molculas.
Las Enzimas generan productos con un alto rendimiento- por arriba del 98%. Lo que
determina la ausencia de sub-productos.
Protege del desaprovechamiento de metabolitos en las clulas.
El grado de especificidad es variado:
Absoluta: especficas para un sustrato Numerosas enzimas son estreoespecficas.
Meda: Clases de molculas con un comn denominador estructural.
Amplia: actan sobre diferentes sustratos de estructura relacionada, aunque lo hacen a
velocidades ampliamente diferentes.

Ejemplos de especificidad: Tripsina (enzima digestiva proteoltica). Solamente corta sobre el
lado carboxilo de Lys o Arg.

ADN polimerasa: Sintetiza ADN en el nucleo, hace copias de una cadena molde (ADN
existente).



RIBOZIMAS
Las ribozimas son molculas de RNA con actividad cataltica, que actan acelerando
reacciones qumicas. Reciben este nombre por la abreviacin de ribonucletido-enzima, lo
cual nos muestra su carcter no proteico, pero con funcin cataltica, que pudo haber sido un
sistema inicial durante el surgimiento de los seres vivos con funcin doble del RNA (
informacin y como catalizador) antes de que las protenas tomaran esa funcin.
8

Numerosas actividades necesarias que se requirieron en el metabolismo temprano de los
nucletidos se derivaron de las ribozimas entre las cuales incluimos la actividad cono
polimerasa.
La estructura elemental del RNA es sencilla y neutra, a diferencia de las protenas que
cuentan con diversos grupos funcionales con cargas y propiedades que les permiten
mltiples interacciones qumicas, sin embargo, aun as las ribozimas pueden llevar a cabo la
aceleracin de reacciones de escisin con eficiencia de hasta 1 milln de veces.
Las ribosimas pueden llevar a cabo reacciones de transferencia de fosfatos o participar en el
procesamiento nucleoltico de virus de plantas o patgenos humanos. Estos llevan a cabo
cortes sitio-especficos de la cadena de RNA, mediante el ataque del grupo 2-hidroxilo en el
fsforo adyacento. Se plantea la hiptesis de que el proceso de corte-empalme del RNA
mensajero en eucariontes es un evento catalizado por RNA, aunque an no ha sido probado
por completo. Conocemos que la actividad de peptidil transferasa de la subunidad ribosmica
grande reside en el RNA y no en alguna protena, por lo que el ribosoma es en s mismo una
ribozima y probablemente sea considerado como el fsil molecular del mundo antiguo de la
enzimologa, que an funciona correctamente.
ISOENZIMAS
Las isoenzimas o isozimas son ismeros de enzimas, variaciones de la molcula que le
confiere caractersticas fisicoqumicas distintas, que le permiten interactuar con los sustratos
de diferente manera, es decir a distinto pH, con diferente Km (afinidad), diferente sensibilidad
a efectores (inhibidores o estimuladores), de tal manera que pueden llevar a cabo reacciones
iguales con los mismos sustratos, pero que actan en condiciones distintas a la enzima
original o ideal.
9

Las causas de la formacin de isozimas pueden ser debido a que la protena en s misma o
en el caso de enzimas oligomricas, el que alguna de sus subunidades o protmeros, estn
codificados en diferentes cromosomas; asimismo, en ocasiones puede ocurrir la generacin
de isozimas por mutaciones puntuales que deriven en la traduccin de formas diferentes de
la protena, todas normales pero con variaciones en la secuencia de aminocidos, que les
permita su funcionalidad en condiciones diferentes.
Definir los conceptos de energa de activacin y de estado de transicin de una
reaccin
Una enzima disminuye la energa de activacin de un substrato en productos de manera
reversible o irreversible facilitando el equilibrio qumico. La enzima no cambia la constante de
equilibrio (Keq) de la reaccin ya que esta es inherente a la misma y no a las caractersticas
inmodificables de la enzima. Por lo tanto, podemos decir que la catlisis es responsable de
incrementar la tasa o cantidad transformada de substrato por unidad de tiempo, sin cambiar
las propiedades termodinmicas del sistema con el cual esta interactuando.
Tasa Velocidad de reaccin Cambio en cantidad (moles, gr.) de los reactantes o
productos por unidad de tiempo. Energa de activacin Nivel mnimo de energa que dos
molculas que colisionan deben poseer para dar
lugar a una reaccin qumica. Estado inicial. Estado de menor energa Estado de
transicin. Estado de mxima energa. G La variacin de la energa que es capaz de
efectuar trabajo. Keq Indica que tan posible es que la reaccin qumica se lleve a cabo.


- Conocer la funcin y clasificacin de las enzimas.
CLASIFICACION
Algunas enzimas actan con la ayuda de estructuras no protecas. En funcin de su
naturaleza se denominan:
10


Cofactor. Cuando se trata de iones o molculas inorgnicas.

Coenzima. Cuando es una molcula orgnica. Aqu se puede sealar, que muchas vitaminas
funcionan como coenzimas;
Cada enzima es designada por:
Nombre recomendado: corto y apropiado para su uso general.
Nombre sistemtico: identifica la reaccin que cataliza.
Nmero: se emplea cuando se necesita la identificacin inequvoca de la enzima.

Numero:
Cada enzima es nombrada por 4 dgitos: EC a.b.c.d.
a. Clase de enzima atendiendo a la clase de reaccin que catalizan:
1. Oxidorreductasas: participan en reacciones redox.
2. Transferasas: catlisis de transferencias de grupos.
3. Hidrolasas: hidrlisis.

Numero:
4. Liasas: adicin de grupos para formar dobles enlaces o eliminacin de grupos para formar
dobles enlaces.
5. Isomerasas: isomerizacin cambiando de sitio los grupos.
6. Ligasas: formacin de enlaces que requieren aporte de ATP

a. Numero:
b. Tipo de grupo que interviene.
c. Clase de sustrato sobre el que actan.
d. Orden de clasificacin



Este nmero ayuda a subclasificar cada enzima de manera especfica en un cdigo de 4
nmeros separados por puntos, en el cual el primer nombre corresponde a una de estas 6
actividades principales.
Para llevar a cabo su actividad como catalizadores, las enzimas requieren en ocasiones la
co-participacin de grupos adicionales llamados grupos prostticos, que pueden ser de
origen inorgnico, denominados cofactores, como iones metlicos Ca, Mg, Mn, Cu, etc, o
pueden ser de origen orgnico, llamados coenzimas, como las vitaminas y otras molculas
nucleotdicas. Estas coenzimas generalmente son termoestables y de bajo peso molecular y
11

son muy necesarias para lograr la actividad cataltica de la enzimas, ya que pueden actuar
como molculas transferentes de grupos funcionales en el proceso de la reaccin.
La porcin proteica sola se reconoce con el nombre de apoenzima, mientras que a la
estructura formada por la unin de la apoenzima con su cofactor o coenzima se le denomina
holoenzima, En ambas condiciones (como apoenzima o como holoenzima, las enzimas
realizan su funcin cataltica.


- Describir las caractersticas de un sistema enzimtico:sitio activo poder
cataltico, nmero de recambio, especificidad, regulacin.
- NATURALEZA DEL SITIO ACTIVO

- La estructura tridimensional del sitio activo determina la especificidad de las enzimas y
su tridimensionalidad esta determinada por los grupos funcionales y sus orientaciones
tridimensionales. El sitio activo est formado por las cadenas laterales de residuos de
aminocidos especficos, lo que ocasiona que tenga un arreglo particular, diferente al
resto de la protena. Este sitio es afn por la estructura tridimensional del sustrato.
Dentro del sitio activo hay ciertos aminocidos que intervienen en la unin del sustrato
a la enzima y se denominan residuos de unin, mientras que los que participan de
forma activa en la transformacin qumica del sustrato se conocen como residuos
catalticos. El acoplamiento es tal que en 1894 E. Fisher enunci: "el sustrato se
adapta al centro activo o cataltico de una enzima como una llave a una cerradura".
Aunque actualmente se utiliza un modelo de encaje inducido propuesto en 1958 por
12

Daniel E. Koshland.

- Nomenclatura de las enzimas: trivial, recomendada y sistemtica.




Las reacciones qumicas pueden desarrollarse en ambas direcciones, pero los productos
estn en un nivel energtico menor que los reactantes .
La diferencia entre reacciones espontneas y no espontneas pueden ser distinguidas por:

Reacciones espontneas Reacciones no espontneas
Keq > 1 Keq < 1
G < 0 G > 0
Exergnica Endergnica
Favorece la reaccin hacia adelante Favorece la reaccin
Reversa



PGARZONM
13


CINETICA ENZIMATICA
DR PEDRO GARZON DE LA MORA
COMPLEJO ENZIMA SUSTRATO
A una concentracin constante de enzimas, la velocidad de una reaccin aumenta en forma
directamente proporcional al aumento de la cantidad de sustrato (S) hasta alcanzar un valor
ptimo; es decir que, a una concentracin suficientemente alta de sustrato, los sitios
catalticos de la enzima se saturan y la reaccin alcanza su velocidad ms alta formando en
su totalidad el complejo enzima sustrato (ES) quedando enzima libre (E) despus de
transformar el substrato en producto (P).
El complejo ES puede disociarse para dar origen a E y S o puede generar el P y
liberar E:
1. P E ES S E
K
k
K
k
+ +
4
3
2
1

Donde K es igual a velocidad de reaccin. Cuando la concentracin de ES es constante, la
velocidad a la que se forma es igual la velocidad a la que se est disociando.
2. | || | | || | | | | | ES K ES K P E k S E k 3 2 4 1 + = +
Considerando solamente la etapa inicial de la reaccin, cuando la produccin de P es
insignificante y la de S es constante, el trmino en P se hace cero y la expresin se reduce:
Dado que: a (b)+ a (c)= a (b+c)
3. | || | | |( ) 3 2 1 k k ES S E k + =
rearreglando la reaccin con sus constantes, queda:
4.
| || |
| |
Km
K
K K
ES
S E
=
+
=
1
3 2


5. [E][S] = Km
[ES]
Ahora, si sabemos que la velocidad mxima inicial (Vmax) se logra cuando toda la enzima
est formando el complejo ES, se puede deducir que: V max = k3 (E total), de donde la
velocidad mxima resulta de la relacin de la velocidad de disociacin de ES en Enzima +
Producto para toda enzima participante
K3
[ES]---[E]+[P]
Por lo tanto: [E total]= V max / k3
14

En cualquier otra etapa de saturacin de la enzima, la velocidad inicial (Vi) para la formacin
de P ser:
Vi = k3 [ES]; luego: (ES)= Vi/k3, ya que (E total ) = (E) + (ES) ; en donde (E) =
(E total) (ES).
Sustituyendo las ecuaciones de v y Vmax, observamos que:
E = Vmax v
k3 k3
Si esta ltima ecuacin sustituye E en la ecuacin (E)(S) = Km , obtendremos:
(ES)

| Vmx - v| |S|
k3 k3 = Km. ,.. [ES|
Dado que: (a - b) c = ac - bc
al resolver esta igualdad:
| Vmx - v | |S| = Km |ES|
k3 k3

Km |ES| = Vmx|S| - v |S|
k3 k3

Km |ES| = Vmx|S| - v|S|
k3

Km |ES| = Vmx|S| - v|S| =
|ES| k3
|ES|
1
Km |ES|= Vmx|S| - v|S|
15

|ES| k3
|ES|
1

Km= Vmax |S| - v|S|
k3 |ES|

ab-cb=b(a-c)

Km= |S| (Vmx v)
K3 |ES|
Ahora bien, si substituimos la formula v= K3[ES] para condensarla nos queda:
Km= |S| (Vmx v) si K3[ES] =v
K3[ES]
Km= |S| (Vmax-v)
V
Resolviendo:
|S| (Vmax-v)= Km.v a(b-c)=ab-ac
Vmx|S| -v |S|= Km v
Vmx|S| = Km . v+ v |S| ab+cb=b(c+a)
Vmx|S|= v(Km+|S|)
Despejando v, la ecuacin resultante es:

v = Vmx|S|
Km + |S|
16



DETERMINACIN DE Km Y V max.
Se mide la velocidad de la reaccin a diferentes valores de (S), el valor de Km puede
estimarse a partir de la curva hiperblica obtenida; sin embargo, la Vmx casi nunca puede
ser calculada de esta curva, ya que las concentraciones de sustrato no son suficientes para
saturar a la enzima pero utilizando la recproca de la ecuacin, se obtiene la siguiente
ecuacin lineal, conocida como la ecuacin de Lineweaver Burk:

1 = Km 1 + 1
v Vmx |S| Vmx
La curva obtenida al graficar 1/v contra 1/[S] produce una lnea recta con una pendiente Km/
Vmx y un lugar de interseccion en las ordenadas 1/ Vmx. La pendiente y el intercepto
puede medirse rpidamente utilizando la grfica de manera alternativa, al multiplicar la
ecuacin por |S|.

|S| = Km + |S|
v Vmx Vmx
se multiplica la ecuacin por Vmx y se obtiene la ecuacin

V = -Km v + Vmx
|S|
A partir de esta ecuacin se obtiene la siguiente:
Km = |S| (Vmx 1)
V
la concentracin de S en la cual v =1/2 Vmx, si se resuelve el valor numrico de la
ecuacin para Km se obtiene Km = |S|
*En cualquier otra etapa de saturacin de la enzima, la velocidad inicial v, para la formacin
de P ser:
17

6.
| |
| | | | | |
| | | | | | ES E E donde
ES E E
ES k v
Total
Total
=
+ =
= 3


Sustituyendo las ecuaciones de v y V
mx
en la ecuacin 6 se tiene:
7.
3 3 k
v
k
V
E
mx
=

Si sta ecuacin se sustituye en la 4:
8.
| |
Km
ES
S
k
v
k
V
mx
=
(

3 3


Resolviendo:
9.
| | | |
| | | |
| |
| | | |
| |
| | | |
| |
| |
| |
| |
( ) | | ES Km v V
ES k
S
ES Km
ES k
S v S V
ES Km
k
S v S V
ES Km
k
S v
k
S V
ES Km S
k
v
k
V
mx
mx
mx
mx
mx
= =
=

=
=
3
3
3
3 3
3 3


y sustituyendo el valor de v de la primera parte de la ecuacin 6 se obtiene:
10.
| |
( ) Km v V
v
S
mx
=
Al efectuar el producto:
Vmx|S| - v|S| =Km v
18

Vmx|S| = Km v + v |S|
Vmx|S| = v(Km + |S|),

Resolviendo se despeja el valor de v y queda:
11.
| |
| | S Km
S V
v
mx
+
= Ecuacin de Michaelis-Menten
Pgarzonm

MOTIVOS QUE HACEN DE K
M
UN PARMETRO CINTICO IMPORTANTE

La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parmetro cintico importante pr
mltiples razones:
- K
M
es la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de
reaccin es la mitad de la velocidad mxima. En efecto, si K
M
= [S], la
ecuacin de Michaelis-Menten se reduce a: v = V
max
/2.
- El valor de K
M
da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A
menor K
M
, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor K
M
,
menor afinidad. Este hecho tiene fcil explicacin si tenemos en cuenta que K
M
se define como
(k
2
+k
3
/k
1
), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reaccin 1 lo
forma. As, si K
M
es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo
(poca afinidad hacia el sustrato), y si K
M
es pequea, el complejo ES es estable, ya que
predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).
- La K
M
del sustrato natural es menor que la de los sustratos anlogos. Si dos sustratos del
mismo enzima tienen distinta K
M
, el que presente mayor K
M
tiene menor afinidad por el enzima, y
la reaccin transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor K
M
, salvo a
concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = V
max
.
- Los valores de K
M
de muchos enzimas son prximos a los de la concentracin fisiolgica
de sus sustratos, de forma que pequeas variaciones en la [S] pueden suponer grandes
cambios en la velocidad de toda una ruta metablica.
INHIBICION ENZIMATICA.
19

Cualquier condicin que ocasione desnaturalizacin de protenas o reactivos que reaccionen
irreversiblemente con grupos funcionales del sitio activo de una enzima ejercer una
influencia adversa sobre la actividad de la misma; sin embargo, el trmino INHIBICION
ENZIMATICA habitualmente se aplica efectos menos adversos. La mayora de las
substancias que actan reversiblemente sobre la velocidad de una reaccin catalizada por
enzimas pueden agruparse en: inhibidores competitivos y no-competitivos. Un tercer grupo
de inhibidores son los acompetitivos es poco comn en reacciones sencillas con un solo
substrato.
Inhibicin Competitiva.
Todo inhibidor competitivo compite con el substrato por el sitio activo de la enzima, en
donde suceden las siguientes dos reacciones:
E+ S-----ES---E+P y E + I -- EI
Lo anterir significa que la presencia de un inhibidor ocupa PARTE del total de E y evita que
se forme el complejo ES. En consecuencia, disminuye la velocidad de la reaccin.
Obviamente, si agregamos mas S, desviaremos la reaccin hacia la formacin del mas
complejo ES que EI; por lo tanto, la magnitud de la inhibicin depender de:
1.- Concentracin del inhibidor
2.- Concentracin del substrato
3.- Afinidad relativa del sitio activo para el S y para el I
La afinidad del sitio activo para I, realmente es una medicin de la constante de disociacin
del complejo EI, por lo cual este trmino se define como Ki, donde:
Ki= [E] [I]
[EI]
En virtud de que la velocidad mxima (Vmax) a concentraciones INFINITAS de [S] no se
modifica, la Km aparente, que se define como la [S] a la mitad de la velocidad mxima (1/2
Vmax), se encontrar aumentada en presencia de un inhibidor. De hecho, podemos
considerar a los inhibidores competitivos como compuestos que muestran un estrecho
parecido estructural con el substrato que les permite unirse al sitio activo, donde I entra pero
bloquea a S y en consecuencia impide la reaccin enzimtica.
Ejemplo:
HOOCCH2CH2COOH + E----- E-HOOCCH2CH2COOH E.H2+
20

+ E----- E.

El acido malonico, muy probablemente a travs de sus dos grupos carboxilo se une al sitio
del cido succnico en la enzima; sin embargo, este acido no posee las uniones C-C para
oxidarse, por lo tanto no puede actuar como substrato, pero si acta como inhibidor.
Inhibicion no competitiva.
Estos inhibidores reaccionan con un sitio en la enzima que no es el sitio activo de tal manera
que no puede ser desplazado por el substrato. La presencia de este tipo de inhibidores
puede favorecer bien sea la formacin del complejo ESI la velocidad de disociacin de
este complejo a EI + P. Consecuentemente este tipo de inhibicin depende de:
1.- la concentracin del inhibidor
2.- afinidad de la enzima por el inhibidor
Debido a que el inhibidor no afecta la unin del substrato a su sitio activo, la Km permanece
sin modificarse. Los inhibidores de este tipo son compuestos como los metales pesados que
pueden alterer reversiblemente la conformacin de una protena interactuando con los
grupos SH de la misma.
Grafica de la cintica enzimtica para determinar el tipo de inhibicin.
La aplicacin de la ecuacin de Lineweaver-Burk puede permitirnos precisar si un inhibidor
actua en forma competitiva o no competitiva. Cuando graficamos la velocidad de una
reaccin a diferentes concentraciones de S en presencia y ausencia de una cantidad
constante de I, la interrelacion entre las dos lneas rectas nos indica el tipo de inhibicin. No
todos los inhibidores proporcionan graficas cineticas simples como las indicadas en la
figura..sino que es posible reconocer otro tipo de efectos. Estos dos tipos de inhibicin
ilustran los principios involucrados en las inhibiciones anteriormente mencionads.A
continuacin brindamos algunos ejemplos de inhibidores enzimticos reversibles (Tabla ):
Inhibidores Irreversibles.
Adems de las anteriores reacciones reversibles, algunos compuestos pueden reaccionar
covalentemente de manera irreversible con los grupos funcionales de la protena; as la
iodoacetamida puede reaccionar con grupos SH de una enzima y, puede por lo tanto, destruir
su actividad. De hecho, se han utilizado compuestos que son especficos para reaccionar con
el sitio activo como el diisopropilfluoro fosfato porque su reaccin es irreversible y permite
estudiar el mecanismo de accin de las enzimas.
21



Enzimas Alostricas.


USO CLNICO DE LAS ENZIMAS.
Las enzimas se utilizan clnicamente de tres maneras principales: 1) como indicadores de
actividad enzimtica o concentracin en lquidos corporales como suero y orina para el
diagnstico y pronstico de diferentes enfermedades 2) Como reactivos analticos en la
medicin de actividad de otras enzimas y sustancias no enzimticas; ejemplo: sustratos,
protenas, frmacos en lquidos corporales 3) Como agentes teraputicos.
DIAGNSTICO Y PRONSTICO DE ENFERMEDADES.
Los ensayos enzimticos empleados en el diagnstico de enfermedades son uno de los ms
frecuentemente utilizados entre los procedimientos de laboratorio clnico. El suero sanguneo
es el lquido ms comnmente utilizados para este propsito. Este es utilizado para
numerosos ensayos debido a que la preparacin no requiere de la adicin de anticoagulantes
ya que interfiere con algunos ensayos. Las enzimas plasmticas circulantes son: enzimas
especificas del plasma, normalmente presentes en este para que realicen su funcin principal
mente en la sangre y muestran niveles que habitualmente son superiores a los encontrados
en las clulas de los tejidos; a saber: trombina (enzima involucrada en el proceso de
coagulacin); plasmina (fibrinlisis) y la activacin del complemento as como la actividad de
colinesterasa II para distinguirla de la acetilcolinesterasa del tejido nervioso y la
22

ceruloplasmina. Estas enzimas son sintetizadas principalmente en el hgado, luego liberadas
a la circulacin donde se mantienen en niveles estables. Los defectos enzimticos
hereditarios o por disfuncin heptica pueden ocasionar que estos niveles disminuyan como
sucede con la deficiencia de trombina (plasmina) que ocasiona alteraciones en la
coagulacin y la fibrinlisis, respectivamente. La deficiencia de colinesterasa puede inducir
una parlisis prolongada del msculo cuando la administramos con succinilcolina durante el
proceso de anestesia para inducir relajamiento de msculo esqueltico. La succinilcolina es
un anlogo estructural de la acetilcolina y compite con los receptores a la acetilcolina a nivel
de la placa motora en la unin neuromuscular ocasionando una depolarizacin que induce
una relajacin muscular. El efecto de la succinilcolina finaliza a travs de la accin enzimtica
de la colinesterasa plasmtica; sin embargo, no se altera de manera significativa por la
acetilcolinesterasa en la unin neuromuscular. La medicin de la colinesterasa plasmtica
antes de la ciruga puede evitar este efecto adverso.
Las enzimas no plasmtico-especficas son intracelulares que habitualmente se encuentran
en plasma a concentraciones muy pequeas, casi siempre por debajo de los niveles que
encontramos en los tejidos. Su presencia en plasma normalmente se debe a un recambio de
las clulas tisulares; sin embargo, cuando se vierten hacia la sangre de manera excesiva es
porque existe lisis celular y disfuncin de la membrana.
El dao tisular y el de la funcin de las membranas pueden ser ocasionados por el aporte de
oxgeno disminuido; tal como sucede en el infarto de miocardio, infeccin (hepatitis) y
agentes txicos. La proliferacin de las clulas con un recambio aumentado puede aumentar
los niveles plasmticos de enzimas caractersticos a las encontradas en las clulas; a saber:
aparicin de la fosfatasa cida en suero en el carcinoma prosttico.
Las enzimas intracelulares esencialmente se confinan a su sitio celular de origen. Son pocas
las enzimas secretoras procedente de algunos tejidos como las glndulas salivales, mucosa
gstrica pncreas) del tracto gastrointestinal donde digieren constituyentes alimenticios. Los
niveles plasmticos de enzimas secretoras aumentan cuando se daa la clula o sus
membranas o bien cuando la va habitual de la enzima, cuando se obstruye la via habitual de
secrecin de la enzima, como sucede en los pacientes con pancreatitis que presentan
actividades de amilasa y lipasa elevados. Estas enzimas pueden digerir al pncreas mismo y
al tejido adiposo que le rodea en un proceso reconocido como necrosis enzimtica.
El diagnstico del rgano enfermo puede precisarse mejor por la medicin de actividades de
enzimas caractersticas del tejido u rgano motivo de estudio. La mayora de los tejidos
muestran patrones enzimticos caractersticos que pueden reflejarse a travs de
concentraciones sricas de sus respectivas enzimas durante los procesos patolgicos. El
tejido afectado puede identificarse mediante la determinacin del patrn de isoenzimas de
alguna de estas enzimas; a saber: deshidrogenasa lctica, creatina-quinasa en el suero,
dado que numerosos tejidos poseen distribucin de isoenzimas para una determinada
enzima; ejemplo: la creatina-quinasa es un dmero compuesto de dos subunidades M
23

(msculo) y la B (cerebro) que se presentan en estas tres formas de isoenzimas: BBCK1,
MBCK2,MMCK3 que catalizan la fosforilacin reversible de la creatina con ATP para formar
fosfocreatina y ADP. Esta reaccin proporciona ATP para la contraccin muscular.
Creatina + ATP ---CK---- fosfocreatina + ADP (adenosin difosfato)

La variedad ck3 predominantemente se encuentra en el msculo esqueltico mientras que el
musculo cardiaco contiene Ck3 y ck2.. El suero, normalmente contiene una pequea
cantidad de CK3 procedente del musculo esqueltico. La deteccin de ck2 en el suero
sugiere un dao en el miocardio. En virtud de que pueden presentarse niveles anormales de
isoenzimas con una actividad total aparentemente normal de la enzima, es prudente medir la
concentracin de las isoenzimas
FACTORES QUE AFECTAN LA PRESENCIA DE LAS ENZIMAS INTRACELULARES.
La interpretacin clnica de los niveles de enzimas debe considerar diversos factores, entre
ellos los cambios en la permeabilidad de membrana y la destruccin de clulas que afectan
la liberacin de enzimas intracelulares.estos cambios pueden surgir como consecuencia de
una disminucin en la concentracin de ATP intracelular
FACTORES QUE AFECTAN LA PRESENCIA Y REMOCIN DE ENZIMAS
INTRACELULARES DEL PLASMA.
La interpretacin clnica de los niveles de enzimas circulantes debe considerar los cambios
en la permeabilidad de membrana y los factores de la destruccin tisular, ya que estos dos
ltimos liberan sus enzimas intracelulares. Estos cambios pueden surgir como resultado de
una disminucin en la concentracin intracelular de ATP debido a cualquiera de las
siguientes condiciones: 1. Deficiencia en una o ms de las enzimas necesarias para la
sntesis de ATP (piruvatoquinasa en los eritrocitos); deprivacion de glucosa, hipoxia
localizada y potasio extracelular elevado. Lla disminucin de ATP surge de una actividad
aumentada de la ATPasa Na+K+ dependiente en la membrana plasmtica que es necesaria
para mantener la proporcin de K+/Na+ entre los espacios extracelular e intracelular.
La hipoxia localizada puede reducir el flujo sanguneo disminuido que lleva a la oclusin de
los vasos sanguneos (isquemia). La isquemia puede surgir de la disminucin en el lumen de
los vasos sanguneos por depsitos de lpidos en el endotelio originados en la
ateroesclerosis o por la formacin de cogulos sanguneos dentro de los vasos. La necrosis
isqumica origina la formacin de un infarto. Cuando las clulas del miocardio mueren como
resultado de una isquemia severa, la lesin se conoce cmo infarto de miocardio.
La cantidad de enzimas liberadas depender del grado de dao tisular, concentraciones
intracelulares de las enzimas y la masa del tejido afectado. La naturaleza del dao (infeccin
viral, hipoxia, ciruga, dao qumico, mecnico) no ocasiona cambios en las enzimas
liberadas a la circulacin. La naturaleza de las enzimas liberadas al torrente circulatorio
24

tambin refleja la severidad del dao, as la inflamacin moderada alcanza a liberar enzimas
citoplsmicas mientras que en condiciones de necrosis aparecen enzimas mitocondriales. De
esta manera, en el dao heptico, la aspartato aminotransferasa se encuentra mucho ms
elevada que la alanina aminotransferasa debido a que la isoenzima mitocondrial de la
aspartato aminotransferasa se libera adems de su correspondiente isoenzima citoplsmica.
La cantidad de enzima liberada hacia el plasma a partir de un tejido daado, habitualmente
es mucho mayor que la que puede encontrar sobre la base de la concentracin enzimtica
en los tejidos y la magnitud del dao, debido a que la prdida de enzima a partir de las
clulas puede estimular una sntesis ulterior de enzimas. En experimentos realizados con
animales, al ocluir las vas biliares estimula la sntesis de fosfatasa alcalina. Por otra parte,
numerosas drogas ocasionan un aumento en las enzimas metabolizadoras de frmacos
como resultado una aumento en la sntesis de novo o induccin enzimtica. Estas enzimas
metabolizadoras de frmacos estn localizadas en el retculo endoplsmico liso (fraccin
microsomal) del hgado y otros tejidos y catalizan las siguientes reacciones qumicas:
hidroxilacin, desmetilacin, desetilacin, acetilacin epoxidacin, desaminacin,
glucuronilacin y deshalogenacin. De esta manera, los niveles sricos de algunas de estas
enzimas pueden estar elevados despus de una exposicion a los agentes inductores de
enzimas como el etanol, barbitrico, fenitona e hidrocarburos policclicos. Por otra parte,
aunque los niveles plasmticos de enzimas puedan elevarse debido a un dao tisular; sin
embargo, estos pueden bajar a pesar de que avance el dao a niveles normales o por debajo
de ellos cuando se compromete la circulacin sangunea o bien cuando la parte funcional del
tejido original por otro tejido no especializado como el conectivo en el hgado durante la
cirrosis.
La inactivacin o remocin de las enzimas del plasma puede lograrse a travs de: una
desnaturalizacin de la enzima ocasionada por una dilucion en el plasma o separacin de
sus sustratos naturales o coenzima; presencia de inhibidores enzimticos (actividad
falsamente disminuida de la amilasa en la pancreatitis aguda que cursa con hiperlipidemia);
remocion por el sistema reticuloendotelial; digestin por proteinasas circulantes; captacin
por tejidos y degradacin subsecuente por proteinasas tisulares y por depuracin de las
enzimas de bajo peso molecular como la amilasa y la lisozima por los riones.
Existen numerosas causas para explicar la aparicin y desaparicin de las enzimas
plasmticas especficas. En virtud de que las enzimas varan en su velocidad de
desaparicin del plasma, es importante conocer el tiempo de la toma de muestra en relacin
con el momento del dao. Asimismo, es importante conocer cunto tiempo despus del dao
empezaron a aumentar los niveles de las enzimas. La vida media biolgica de las enzimas y
sus diferentes isoenzimas no son iguales como podemos deducirlo al comparar la velocidad
de desaparicin de las isozimas de la lactato deshidrogenasa (LDH). La LDH consiste de
cuatro subunidades de dos tipos diferentes: H (Heart=corazn) y B (Brain=cerebro). La
combinacin de subunidades proporciona una serie de cinco tetrmero de LDH1 (H4), LDH2
25

(H3M), LDH3 (H2 M2), LDH4 (HM3) y la LDH5 (M4). La velocidad de desaparicin promedio
de las unidades de LDH del plasma es bifsica debido a la desaparicin ms rpida de la
LDH5 (isoenzima predominante del hgado y del msculo esqueltico), seguido de una
remocin relativamente ms lenta de la LDH1 (isoenzima predominante en el corazn,
corteza renal y eritrocitos). Las enzimas de LDH remanentes poseen velocidades intermedias
de desaparicin. En las enfermedades crnicas los niveles enzimticos del plasma
continan elevados. El uso de rangos normales es importante en la evaluacin de niveles
anormales de enzimas plasmticas; sin embargo, puede presentarse un patrn de
isoenzimas anormal a pesar de que exista una actividad total normal. El rango normal de
actividad enzimtica puede resultar afectado por una variedad de factores; a saber: edad,
sexo, grado de obesidad, embarazo, alcohol y el consumo de otras drogas y malnutricin.
Las drogas pueden alterar el nivel plasmtico en vivo e interferir con la medicin in vitro.
Las actividades enzimticas tambin pueden medirse en orina, liquido cerebro espinal,
clulas de medula sea, leucocitos y clulas tisulares. Es posible, realizar localizacin
citoqumica en leucocitos y biopsias de tejidos como hgado, musculo, etc. En condiciones
ideales, puede medirse tanto la concentracin de la enzima como su actividad. Existen
procedimientos como el radioinmunoensayo (RIA), y sus variantes como inmunoensayos
fluorescentes (FIA), inmunoensayos con polarizacin fluorescente (FPIA) y los
inmunoensayos con quimioluminiscencia (CLIA) para medir concentraciones de enzimas asi
como otros parmetros clnicos importantes
MEDICIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA.
El procedimiento ms frecuentemente utilizado cundo intentamos medir los niveles de
enzimas, consiste en la registrar la velocidad de la reaccin qumica catalizada por la enzima.
La velocidad inicial de una reaccin enzimtica es directamente proporcional a la cantidad de
enzima presente cuando las concentraciones de sustrato se mantienen a niveles de
saturacin (cintica de orden cero con respecto a la concentracin de sustrato) y otros
factores como pH, temperatura que deben mantenerse en niveles ptimos y constantes. Bajo
estas condiciones, la velocidad de remocin de substrato o formacin del producto en un
tiempo determinado est relacionado directamente con la actividad enzimatica. La velocidad
de la reaccin se determina midiendo la formacin del producto o la remocin de substrato
en tiempos fijos o midiendo cambios conforme avanza la reaccin, registrando los tiempos de
lectura. Si deseamos obtener una mayor seguridad en las mediciones, es preferible medir la
formacin del producto a la remocin del substrato debido a que el primero implica medicin
de un cambio en la concentracin de un valor inicial de cero o bien niveles bajos hacia
valores elevados. Lo anterior es analticamente ms confiable que el proceso inverso.
En ambos mtodos es necesario realizar un registro de tiempo en forma continua, debido a
que ambos procedimientos son cinticos, en virtud de que se necesita registrar el tiempo y
cambios de absorbancia. A continuacin es prudente enfatizar que pueden obtenerse
resultados imprecisos si medimos durante la fase no lineal o una fase que no sea mxima.
26

En estos procedimientos de tiempo fijo,donde se escoge un intervalo nico para medir la
actividad enzimtica resulta esencial seleccionar las condiciones de reaccin, de tal manera
que la concentracin de sustrato, pH, temperatura o factores que proporciona pendiente
lineal durante el perodo seleccionado. Es posible que surjan valores falsos negativos sobre
velocidades enzimticas cuando es baja la concentracin de substrato, cuando surge una
inhibicin de la enzima por el producto o existe un aumento en la reaccin inversa debido al
acumulo de producto, desnaturalizacin de enzimas, presencia de ciertos metabolitos
endgenos y frmacos o sus metabolitos.
Durante el diseo de un ensayo enzimtico, un elemento clave es la seleccin de un
procedimiento fsico o qumico para registrar la aparicin de un producto o la desaparicin de
substrato.
La velocidad de las reacciones enzimticas se puede controlar continuamente mediante
registros fotomtricos tales como absorcin de la luz, fluorescencia o rotacin ptica) en
caso de reaccin se acompaa de un cambio en las propiedades pticas; por ejemplo, la
fosfatasa alcalina utilizada en el diagnstico de enfermedades hepatobiliares y de hueso se
mide a travs de utilizar su capacidad para catalizar la hidrlisis a pH alcalino del p-
nitrofenilfosfato alcalino que es incoloro en el p-nitrofenol que es un producto coloreado
amarillo con cambios en absorcin a 405 nm.
Numerosas reacciones pueden ser medidas a 340 nm si stas se encuentran unidas directa
o indirectamente a la reaccin de una deshidrogenasa que utiliza NAD+ o NADP+. La
coenzima absorbe luz UV a 340 nm en el estado reducido y no absorbe en su estado
oxidado. Por lo tanto, el cambio de estos cofactores a NADH o NADPH o visceversa puede
registrarse 340 nm; por lo tanto, los cambios de velocidad de reaccin pueden medirse en
cualquier sentido a travs de registrar la absorbancia a la longitud de onda mencionada;
ejemplo:
la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa de los eritrocitos puede medirse especficamente en
hemolizado de glbulos rojos.
Esta enzima cataliza la siguiente reaccin:
D-glucosa-6-fosfato+ NADP<- --->D-glucono-lactona-6 fosfato+ NADPH+ H+
En virtud de que el NADH absorbe la luz a 340 nanmetros y el NADP no puede hacerlo,
esta reaccin puede realizarse para medir el cambio en la absorbancia a esta longitud de
onda en relacin con el tiempo. Un ensayo semejante con lactato y NAD puede ser utilizado
para medir la actividad de la deshidrogenasa lctica en suero. La diferencia en absorbancia
se mide con gran precisin al grado de que varios ensayos se realizan directa o
indirectamente. En el ltimo caso, la reaccin qu va a medirse se encuentra vinculado por
uno o ms pasos a la reaccin en la cual se oxida o se reduce una molcula de NAD. Por lo
tanto, cuando medimos aminotransferasas, uno de los productos de la reaccin inicial o
27

principal sirve como substrato para la siguiente reaccin en la cual se necesita NADH; por
ejemplo, en el ensayo del aspartato aminotransferasa: tenemos;
L-Aspartate + -cetoglutarato oxalacetato (2-oxoglutarato)+ glutamato (reaccin
principal)

El oxalacetato formado en la reaccin inicial se reduce a L-malato por el NADH , as en
presencia de la enzima malato deshidrogenasa:
Oxalacetato + NADH + H + > L-malate + NAD (reaccin indicadora)

Esta reaccin secundaria corresponde a una reaccin indicadora en la cual se precisa la
velocidad de transformacin del sustrato. La reaccin primaria y no la secundaria debe ser el
paso limitante de la velocidad de la reaccin.
La reaccin indicadora debe ser capaz de remover rpidamente el producto formado en la
reaccin principal a fin de evitar o disminuir la reaccin inversa de la reaccin inicial. Cuando
mantenemos un exceso de la segunda enzima ( malato deshidrogenasa) en la mezcla de la
reaccin se satisface este requisito. La reaccin indicadora debe funcionar a la concentracin
del sustrato (oxalacetato) de la enzima indicadora, de tal manera que la velocidad de la
reaccin indicadora sea directamente proporcional a la concentracin del sustrato. Bajo estas
condiciones, la velocidad de la reaccin catalizada por la enzima indicadora es directamente
proporcional a la velocidad de formacin del producto en la reaccin principal o inicial. Por lo
tanto, durante la fase inicial de la reaccin, la reaccin indicadora debe esperar un
determinado perodo de tiempo conocido como fase lag para que la reaccin principal genere
cantidades adecuadas de oxalacetato a fin de permitir la mxima velocidad de conversin del
NADH en NAD.
En los ensayos vinculados con el NAD, los metabolitos endgenos y las enzimas en el suero
pueden ocasionar oxidacin o reduccin de la coenzima pudiendo introducir errores, por
ejemplo, en el ensayo de la aspartato transferasa, el NADH de la reaccin indicadora puede
ser oxidado por la presencia de piruvato y de LDH en el suero:
Piruvato + NADH + H + > L-lactato + NAD+
Esta reaccin puede aumentar errneamente la actividad medida de la aspartato transferasa.
Una manera de evitar lo anterior, consiste en incluir un paso de pre incubacin en el
procedimiento. Este paso consiste en introducir un perodo durante el cual todos los
componentes de la mezcla de la reaccin con excepcin de uno de los sustratos de la
reaccin principal ( en este caso el alfa-cetoglutarato) sean incubados. Este perodo permite
que todas las reacciones no deseables se completen antes de que se inicie la reaccin
principal al aadir el alfa cetoglutarato. En virtud de necesitar mediciones rpidas y seguras
se han introducido procedimientos automatizados utilizando los mismos fundamentos.
28

MARCADORES SRICOS EN EL DIAGNSTICO DEL DAO TISULAR
MIOCARDIO
La oclusin de las arterias coronarias ocasionan dao del miocardio debido y puede dar
origen a un infarto del miocardio. La causa inmediata y ms comn de obstruccin arterial es
la formacin de trombos. La teraputica antitromboltica utilizando estreptoquinasa como el
activador de plasmingeno obtenido de tejido recombinante protege al miocardio de un dao
permanente mediante el restablecimiento del flujo sanguneo. El diagnstico oportuno de
infarto de miocardio es crtico a fin de realizar un manejo adecuado del mismo. Una historia
clnica con antecedentes de dolor precordial y electrocardiogramas resultan esenciales en el
diagnstico de infarto de miocardio. Por lo tanto, es necesario medir protenas circulantes
(protenas enzimticas y no enzimtica) liberadas a partir del tejido miocrdico necrtico.
De las caractersticas de un marcador ideal del dao miocrdico deben cubrir especificidad,
aparicin rpida en el suero, elevacin importante durante un periodo clnicamente til as
como facilidad y rapidez en la realizacin del ensayo analtico. En el momento actual ningn
de los marcadores sricos cubre todos estos criterios. Algunos marcadores cardacos que
aparecen en el plasma son: mioglobina, LDH serica y troponina. Las mediciones se realizan
a intervalos adecuados en base a la aparicin del marcador en el plasma. Los marcadores
frecuentemente utilizados son CKMB y troponina 1 cardiaca (cTnI). Las troponinas son tres
protenas diferentes I, C y T; se expresan tanto en el msculo cardaco como el esqueltico.
El complejo tripartita de troponina regula la interaccin calcio dependiente de la miosina con
la actina. Las troponinas estn codificadas por diferentes genes. Las isoformas cardacas I y
T manifiestan diferencias estructurales muy particulares con respecto a las troponinas del
msculo esqueltico. Sin embargo, la cTnT as como la CKMB avanza hacia una
recapitulacin ontognica y se expresan en el msculo esqueltico en regeneracin siempre
siente con insuficiencia renal crnica. La CKMB tambin est presente en el msculo
esqueltico aunque la encontramos en pequeas concentraciones en comparacin con el
miocardio (aproximadamente 360-400 g), el msculo esqueltico consiste de una masa
muscular mas grande (aproximadamente 40 por ciento). En la rabdomolisis (desintegracin
del msculo), la CKMD y la mioglobina aparecen en el plasma en cantidades significativas.
La mioglobina, pese a que es un marcador inicial, carece de especificidad y la CKMB se
eleva en numerosas circunstancias diferentes al dao cardiaco por ejemplo en la
rabdomilisis, enfermedad renal crnica y enfermedades degenerativas del msculo
esqueltico. La CKMB tiene una isoforma en el plasma debido al hecho de que la subunidad
M procede a una ruptura de un reciduo de lisina del carboxi terminal por accin de una
carboxipeptidasa en el plasma. Las formas plasmticas y tisulares de CKMB se le ha
designado como CKMB2 CKMB1, respectivamente. La proporcin de los niveles sricos de
CKMB2/CKMB1 tambin puede proporcionar informacin til en el diagnstico inicial de
infarto de miocardio. La medicin de las isoenzimas de LDH (LDH1 y LDH2) tambin carecen
de especificidad ya que aparecen significativamente aumentadas despus del dao de
miocardio y muestran una recapitulacin ontognica. La troponina cardiaca I es un marcador
altamente especfico para el infarto de miocardio y que no sufre de estas desventajas; por lo
cual, en cuanto aparece en el plasma casi al mismo tiempo que la CKMB y persiste un
perodo mayor que las isozimas de LDH. Por esta razones, las mediciones de cTnI en suero
pueden ser superiores para la deteccin de infarto de miocardio an en pacientes con
29

enfermedad renal crnica, rabdomilisis, enfermedades degenerativas del msculo
esqueltico como sucede en las distrofias musculares.
PNCREAS
El pncreas es una glndula exocrina y endocrina. La funcin exocrina permite digerir las
sustancias de los alimentos; en cambio, el endocrino esta involucrado en la homeostasis de
la glucosa. Durante los episodios de pancreatitis aguda ocasionada por clculo o abuso del
alcohol ( 80%) se presente una liberacin inapropiada de enzimas pancreticas y su
activacin prematura. La enzma pancreatica principal es el tripsinogeno, el cual despus de
su activacin a tripsina convierte muchas otras enzimas a su forma activa. Algunas de estas
son; Kalicrena, fosfolipasa A II, elastasa, enzimas de la coagulacin sangunea y fibrinolisis
as como complemento. Los efectos de estos procesos anormales son la autodigestin del
pncreas, vasodilatacin, permeabilidad capilar aumentada y coagulacin intravascular
diseminada. Estos pueden conducir a un colapso circulatorio como insuficiencia renal y a una
insuficiencia respiratoria.
El diagnstico de laboratorio de una pancreatitis aguda involucra la medicin de las enzimas
digestivas pancreticas amilasa y lipasa. Asi, cuando detectamos un nivel de amilasa srica
elevado, rpidamente pensamos en la pancreatitis aguda debido a que es un indicador
diagnstico muy sensible; sin embargo, poseen poca especificidad en virtud de que existen
numerosas causas no pancreticas que ocasionan elevacin de la amilasa en sangre. La
amilasa ( PM de 55 KDA) se elimina rpidamente por los riones y regresa a niveles
normales al tercero o cuarto da de la aparicin del dolor abdominal. La actividad de amilasa
en el suero aparece dentro de las 2 a 12 horas despus de la iniciacin del dolor. Por otra
parte, la lipasa srica tambin se mide para hacer diagnstico de trastornos pancreaticos y
manifiesta una especificidad superior a la amilasa srica. Ademas, esta enzima aparece en el
plasma en las primeras 4 a 8 horas y su pico corresponde las 24 horas permaneciendo
elevada durante 8 a 14 das. La medicin de amilasa y lipasa proporciona un 90 a 95 por
ciento de precisin en el diagnstico de pancreatitis aguda que cursa con dolor abdominal.
Los niveles de isoamlasa pancreatica an no se ha comprobado que sean mejores que los
ensayos de lipasa srica.
Las clulas exocrinas del pncreas contienen numerosas enzimas, por lo cual se han
realizado intentos de utilizar marcadores diferentes a la amilasa y lipasa para diagnosticar la
pancreatitis aguda. Una enzima de esa naturaleza parece ser el tripsinogeno que
corresponde a una protena de 25 KDa y que existe en dos formas de isoenzimas:
tripsinogeno-1 (inico), tripsinogeno-2 (anionico). Ambas formas son rpidamente filtrables a
travs a travs de los glomrulos renales- Sin embargo, la reabsorcin tubular de
tripsinogeno-2 es menor que la reabsorcin del tripsinogeno-1. Existe un mtodo sencillo que
se ha desarrollado para detectar tripsinogeno-2 en orina de pacientes en los cuales se
sospecha una pancreatitis aguda. Este ensayo se realiza con una tira reactiva que contiene
anticuerpos monoclonales especficos contra tripsinogeno-2 aparte.
Hgado
30

El hgado es el rgano glandular ms grande del organismo y sus clulas parenquimatosas
se denomina hepatocitos. El hgado deempea numerosas funciones, entre las cuales se
incluye: metabolismo, detoxificacin, formacin y excrecion de bilis, almacenamiento y
sntesis. Las enfermedades hepticas como la cirrosis por abuso de alcohol, drogas.
Hepatitis C crnica, esteatosis heptica, esteatohepatitis, enfermedades autoinmunes,
hemocromatosis, enfermedad de Wilson, deficiencia de alfa 1 antitripsina, malignidad,
envenenamiento, agentes infecciosos
Estos padecimientos requieren de un seguimientos constante de laboratorio especficos que
implica la medicin de enzimas en el suero. Estas las dividimos en dos categoras: 1)
marcadores utilizados en la necrosis hepatocelular y los marcadores de la colestasis. Las
enzimas del suero utilizadas como marcadores de colestasis incluyen la fosfatasa alcalina,
5`- nucleotidasa y gama glutamil transpeptidasa. La alanin-aminotransferasa y la piruvato-
aminotransferasa son marcadores de necrosis hepatocelular. Otros ensayos utilizados en la
medicin de lacolestasis incluyen la cuantificacin de bilirrubina, albmina y alfa- feto
protena.
ENZIMAS UTILIZADAS COMO REACTIVOS ANALTICOS.
El uso de enzimas como reactivos analticos en el laboratorio tiene numerosas aplicaciones
en la medicin de sustratos asi como la actividad de otras. Los procedimientos dependientes
de enzimas, tales como la medicin de urea y colesterol proporcionan muchas ventajas sobre
los procedimientos qumicos clsicos. La especificidad del procedimiento hace posible medir
directamente estos compuestos en una mezcla compleja sin necesidad de realizar
separaciones ni purificacin del reactivo enzimatico que puede ser utilizado para medirlos
mediante reacciones de punto final.
En estas reacciones, el sustrato se convierte completamente en producto antes de ser
medido; en cambio en el ensayo cinetico se produce un cambio en la concentracin durante
un intervalo. Este se reconoce como mtodo cinetico de dos puntos cuando se realiza bajo
condiciones de pH, temperatura, cantidad de enzima, intervalos precisos con lo cual se logra
proporcionar valores precisos de la concentracin de sustrato. Este procedimiento con
soluciones estndar, deben mantener condiciones de reaccin de primer orden con respecto
al sustrato,conservando elevada la concentracin del reactivo enzimtico. Bajo estas
condiciones, al graficar el promedio de las velocidades durante los intervalos seleccionados,
surge un perfil que se traza con una lnea recta, a partir de la cual es posible calcular los
valores del substrato.
Las propiedades pticas se pueden utilizar para realizar ensayos donde se mide la actividad
enzimtica, cuando el sustrato primario o principal ni el producto tienen una propiedad ptica
de absorcin en el rango de luz ultravioleta y visible. Entonces surge la posibilidad de
realizar un ensayo acoplado en el cual se emplean una o ms enzimas para formar un
producto final que posea una propiedad ptica fcilmente medible; por ejemplo, la glucosa
medida en un espcimen biolgico puede detectarse mediante las siguientes reacciones bajo
condiciones ptimas.
31

de escribir la reaccin redactar la segunda reaccin entre parntesis en la cual se forman
NADPH funciona como reaccin indicadora a pesar de que la reaccin de hexoquinasa es
relativamente inespecfica y actua sobre otras hexosas ademas de la glucosa para formar
steres de glucosa-6-fosfato convirtiendo el procedimiento inespecfico en uno altamente
especfico para la glucosa. Por otra parte, las enzimas inmovilizadas sobre una superficie
insoluble que pueden utilizarse repetidamente en el ensayo de la los sustratos. Este tipo de
ensayo es accesible de realizar si el producto de la reaccin puede medirse directamente. La
inmovilizacin puede lograrse a travs de uniones qumicas que involucran grupos diazo,
triazina,y azida con muchos tipos de matrices insolubles tales como la dietil-amino-
etilcelulosa , carboximetilcelulosa, agarosa, celulosa microcristalina y paredes internas de
tubos de plstico.Las enzimas inmovilizadas sobre la superficie interna de tubos de plstico
son particularmente tiles en el anlisis de lujo antgenos. Las enzimas utilizadas como
reactivo que se han inmovilizado incluyen la glucosa oxidasa, ureasa, alfa amilasa, tripsina y
leucin-aminopeptidasa
Aparte de las enzimas reactivo y anticuerpos formados contra molculas especficas pueden
combinarse para determinar la concentracin de una variedad amplia de moleculas contra las
cuales los anticuerpos se han formado de manera especfica. Dichos procedimientos
analticos se conocen cmo Inmunoenzimoensayo (IEE o EIA), donde la enzima reactivo
puede unirse a los anticuerpos o a los antgenos, de tal manera que los complejos posean
actividad inmunolgica enzimtica. Los anticuerpos pueden prepararse en animales
vertebrados inyectndoles protenas especficas.
Adems de las macromolculas existen otras diferentes a las protenas que tambin son
antignicas; asimismo, existen compuestos de peso molecular bajo (substratos, drogas), que
por s mismos no forman anticuerpos; en cambio, si los unimos covalentemente a una
protena transportadora como la albmina y luego los inyectamos en animales, se producen
anticuerpos. El trmino hapteno designa la sustancia de bajo peso molecular que se combina
con el anticuerpo producido contra el complejo proteico transportador. Los
inmunoenzimoensayos pueden ser heterogneos u homogneos. Un ensayo heterogneo
consiste de por lo menos un paso en el cual el reactivo marcado unido a la enzima se
separa de la enzima no unida, permitiendo la medicin de las actividades de la enzima unida
o libre. Un procedimiento basado en este principio se reconoce como ELISA ( Enzyme Linked
Immuno Assay), el cual es anlogo a un radioinmunoensayo; un ejemplo de un
inmunoensayo heterogneo es aquel en el cual se utiliza un sistema de fase slida. Ejemplo
Este mtodo consiste en utilizar anticuerpos de revestimiento o de adsorcin generados en
el animal contra un determinado antgenos humano. La concentracin que se pretende
determinar de un substrato en una muestra de suero problema se pone en contacto con una
superficie slida o una superficie interna de un tubo de plstico. Despus se incuba con el
espcimen de suero en el cual existe el compuesto o moleculas problema. Durante el primer
paso de incubacin el antgeno se combina con el anticuerpo especfico y se fija a una
superficie slida. Posteriormente, los componentes del suero que no han reaccionado se
eliminan mediante aspiracin del lquido; en cambio, la superficie slida que contiene el
complejo antgeno anticuerpo unido, se lava con una solucin buffer adecuada. Despues
sigue la incubacin con anticuerpos covalentemente unidos a las molculas de enzima.
Durante este paso el complejo enzima anticuerpo marcado se combina siempre y cuando el
antgeno se encuentre fijo. Enseguida, removemos los conjugados de enzima-anticuerpo
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que no quedaron unidos al antgeno. Finalmente, la incubacin es especfica para que la
enzima proporcione un producto coloreado que se cuantifica mediante mtodos
espectrofotomtricos adecuados.
Aqu debe quedar claro que deben conservarse constante el intervalo de tiempo para la
incubacin del sustrato y las condiciones de reaccin tanto para los ensayos en suero como
para las soluciones estndar. La reaccin enzimtica se detiene alterando el pH de la mezcla
de la reaccin mediante la adicin de un cido como el cido clorhdrico 1.0 N. El cambio en
la absorbancia de color es proporcional a la concentracin del antgeno en el suero
problema. La concentracin definitiva podemos obtenerla al interpolar una curva estndar en
el cual se encuentran graficadas las concentraciones conocidas de antgeno contra sus
absorbancias. Actualmente existen diferentes modificaciones de este procedimiento; a saber,
si deseamos conocer la concentracin de un anticuerpo, el proceso puede iniciar con la
inmovilizacin del antgeno sobre una fase slida.
Las enzimas utilizadas como marcadores deben tener un elevado valor de recambio, actuar
sobre un sustrato que sea estable, proporcionar productos fcilmente medibles y ser
obtenidos en la forma altamente purificada adems de ser relativamente baratos. Las
enzimas que satisfacen estos criterios son la peroxidasa de raz fuerte, glucosa oxidasa,
fosfatasa alcalina obtenida de intestino de ternera, catalasa y la B-galactosidasa. La unin
covalente de la enzima con la protena (antgeno-anticuerpo) a travs de sus grupos amino
libres puede lograrse con glutaraldehido debido a que es unreactivo bifuncional. El mtodo
de oxidacin con cido peridico que involucra la cadena lateral de las protenas tambin
proporciona grupo reactivos tiles en la preparacin de con jugados. El procedimiento de
ELISA manifiesta niveles elevados de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad se debe al
factor de amplificacin y producido a travs de la actividad cataltica de la enzima marcada,
obteniendo resultados comparables en precisin a los que se miden con radioinmunoensayo.
La especificidad se atribuye al reconocimiento molecular especfico de antigenos y
anticuerpos. El procedimiento de ELISA puede representar ms ventajas que el
radioinmunoensayo, debido a que los reactivos del primero poseen fechas de caducidad ms
largas que los radioistopos y que representan menos peligro para la salud. El procedimiento
de ELISA tambin se ha adaptado para la identificacin de antigenos y anticuerpos en cortes
de tejido mediante el uso de conjugados de protena- peroxidasa.
La velocidad de los procedimientos de inmunoenzimoensayo homogneo es especialmente
til para la determinacin rpida de sustancias de bajo peso molecular (haptenos). De esa
manera estos procedimientos han encontrado aplicacin en la medicin de medicamentos y
en la toxicologa un reactivo comercial para el uso del ensayo de nmeros frmacos se
encuentra disponible en el mercado con el nombre de EMIT (Enzyme Multiplied
Immunoassay Technique). El principio del EMIT se basa en la competencia entre varios
haptenos marcados con enzima que no est libre con el existente en el suero problema, a
travs de una unin con una cantidad limitada de un anticuerpo especfico. Este ensayo
requiere un ligando unido covalentemente a una enzima (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
lisozima o malato deshidrogenasa) con la retencin de actividad enzimatica y los anticuerpos
(preparados mediante inyeccin de stos en un animal) que inhibe la actividad enzimtica
cuando stos se combinan con los reactivos enzima unida al hapteno. La inhibicin por el
anticuerpo de la actividad catalitica de la enzima unida al complejo hapteno por el anticuerpo,
33

puede deberse a impedimento estrico, cambios conformacionales que hace dificil el acceso
del sustrato al sitio activo.
Este sistema de reaccin consiste en la muestra problema,el hapteno marcado con la
enzima, una cantidad de anticuerpo limitada especifico contra el hapteno y el substrato.
Cualquiera hapteno presente en el suero problema compite con el hapteno unido a la enzima
para unirse con el anticuerpo. El hapteno unido a la enzima que no ha quedado unido (libre)
actua sobre el sustrato para convertirlo en un producto fcilmente medible. De esta manera
la actividad enzimatica se puede correlacionar directamente con la concentracin libre de
hapteno en el suero problema. El mtodo se calibra utilizando concentraciones conocidas de
un estndar.
Los sistemas ELISA y el de receptor EIA miden las sustancias a concentraciones tan bajas
que llegan el orden de los nanogramos. Esta sensibilidad no es suficiente para detectar
numerosos compuestos, de tal suerte que se ha necesitado desarrollar nuevos mtodos. Uno
de ellos es el inmunoensayo por quimioluminiscencia (CLIA) que mide concentraciones en
fantogramos ( o sea 1x10
-15
g. El procedimiento CLIA depende de la deteccin de la luz
emitida asociada con la disipacin de energa a partir de un sustrato excitado
electrnicamente como resultado de una reaccin qumica. Un ejemplo de trazador de
quimioluminiscencia es l ester conjugado de acridinium a una protena, polipeptido u otra
molcula orgnica.
El CLIA es semejante al ELISAy al EIA excepto que el ensayo final receptor enzima queda
reemplazado por un trazador de quimioluminiscencia seguido de la medicin de la luz
liberada como resultado de la reaccin qumica. Los principios de un ensayo de
quimioluminiscencia competitiva pueden esquematizarse de la siguiente manera:
esquema
ENZIMAS UTILIZADAS COMO AGENTES TERAPUTICOS.
Las enzimas han encontrado pocas aplicaciones como agentes teraputicos. Algunos
ejemplos son la transfusin de sangre fresca con sus componentes activos en los trastornos
de la coagulacin, la administracin oral de enzimas digestivas en pacientes con
enfermedades digestivas (fibrosis qustica), la administracin de enzimas fibrinolticas
(estreptoquinasa) para recanalizar los vasos sanguneo ocluidos por coagulos (trombos) en
los trastornos tromboemblicos (embolismo pulmonar, infarto agudo de miocardio), para
tratamiento de trastornos de ciertos errores innatos del metabolismo (enfermedad de
Gaucher) y terapia contra el cncer entre parntesis (asparaginasa en la leucemia linfoctica).
Para que las enzimas sean teraputicamente utiles deben derivar de fuentes humanas a fin
de evitar problemas inmunolgicos. Pese a que algunas enzimas derivan de sangre humana,
las enzimas procedentes de tejidos que seran particularmente tiles en el tratamiento
enfermedades innatas del metabolismo son difciles de obtener en cantidades adecuadas.
El transporte de emzimas especificas hacia los tejidos blanco o diana tambin constituye un
problema; sin embargo, actualmente se puede reconocer algunos avances y aplicaciones
comerciales (propagacin de lneas celulares humanas en cultivo de tejidos) aislamiento y
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clonacin de genes especficos) que muestran potencial de sobrepasar estas dificultades
tcnicas mencionadas se han utilizado en la produccin de hormonas peptidicas tales como
las de actina, insulina, interfern y plasminogeno de tejido. En el tratamiento con enzimas o
protenas se requiere realizar una unin covalente entre ellas y un polmero inerte como el
polietilenglicol (PEG) que proporciona muchos beneficios teraputicos. Estos incluyen la
disminucin de la depuracin, disminucin de la inmunogenicidad, prevencin de la
degradacin y unin al anticuerpo. La terapia con enzima-PEG se utiliza en el tratamiento de
enfermedades con inmunodeficiencia ocasionadas por deficiencia en la adenosn deaminasa
y el alfa interfern_PEG qu nos sirve para el tratamiento de hepatitis C.
4.4 Some important therapeutic enzymes
Enzyme
EC
number
Reaction Use
Asparaginase 3.5.1.1 L-Asparagine H
2
O L-aspartate + NH
3
Leukaemia
Collagenase 3.4.24.3 Collagen hydrolysis Skin ulcers
Glutaminase 3.5.1.2 L-Glutamine H
2
O L-glutamate + NH
3
Leukaemia
Hyaluronidase
a
3.2.1.35 Hyaluronate hydrolysis Heart attack
Lysozyme 3.2.1.17 Bacterial cell wall hydrolysis Antibiotic
Rhodanase
b
2.8.1.1 S
2
O
3
2-
+ CN
-
SO
3
2-
+ SCN
-

Cyanide
poisoning
Ribonuclease 3.1.26.4 RNA hydrolysis Antiviral
b-Lactamase 3.5.2.6 Penicillin penicilloate
Penicillin
allergy
Streptokinase
c
3.4.22.10 Plasminogen plasmin Blood clots
Trypsin 3.4.21.4 Protein hydrolysis Inflammation
Uricase
d
1.7.3.3 Urate + O
2
allantoin Gout
Urokinase
e
3.4.21.31 Plasminogen plasmin Blood clots