NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO: Los laboratorios son instalaciones donde se debe trabajar con mucha seriedad, precisin y pulcritud.

La precisin es la manera cuidadosa de realizar un experimento de acuerdo con las instrucciones, y haciendo observaciones muy cuidadosas de lo que sucede para adquirir una completa comprensin del experimento. La precisin requiere la anotacin inmediata de las observaciones. La pulcritud implica limpieza en el manejo de los reactivos y equipos. * No se permitir comer, beber, fumar y/o almacenar comidas as como cualquier otro tem personal (maquillaje, cigarrillos, etc.) dentro del rea de trabajo. * Usar bata de manga larga dentro de laboratorio, la cual se pondr al momento de entrar y deber ser quitada inmediatamente antes de abandonar el laboratorio. * Asegurarse de no presentar cortes, raspones u otras lastimaduras en la piel y en caso de que as sea cubrir la herida de manera conveniente. * Usar guantes de ltex de buena calidad para todo manejo de material biolgico o donde exista, aunque sea de manera potencial, el riesgo de exposicin a sangre o fluidos corporales. Cambiar los guantes toda vez que hayan sido contaminados, lavarse las manos y ponerse guantes limpios. * No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas. * No abandonar el laboratorio o caminar fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos. * Bajo ninguna circunstancia se pipeteara sustancia alguna con la boca, para ello se utilizaran peras plsticas o pipeteadores automticos. * Lavar las manos con jabn y agua inmediatamente despus de realizar el trabajo. Descartar los guantes de latex en un recipiente con solucin desinfectante. * No detener manualmente la centrifuga, no destaparla antes de que cese de girar. * No permitir la entrada de personas ajenas al laboratorio y/o que no tengan sus implementos de bioseguridad adecuados. * Emplear en todo momento las medidas de bioseguridad aqu expuestas. * Usar mascarilla en los procedimientos en los que pueda haber riesgo de salpicadura de material biolgico en las mucosa bucal y nasal. * Debern usarse zapatos cerrados dentro del laboratorio para evitar el contacto de la piel con material contaminado o cualquier producto qumico peligroso, por derramamiento o salpicadura. * Debera usarse gorro de tela para evitar el contacto directo del cabello con material contaminado o sustancias qumicas peligrosas. * Todo el equipo reusable (puntas de micropipetas, canulas, , tubos, etc.) deber ser ubicado en un recipiente metlico o de plstico resistente a punciones y cortaduras,

que contenga liquido descontaminante y debera estar localizado en el mismo lugar de trabajo. * Las sustancias qumicas no se deben tocar con las manos. * Las sustancias qumicas nunca se deben probar, a menos que se indique lo contrario. * Cuando se quiere examinar el olor de una sustancia nunca se acerque la cara sobre el recipiente. Se debe colocar el recipiente a cierta distancia y con las manos se dirigen los vapores hacia la persona. Nunca perciba el olor cuando acabe de retirar un recipiente cuyo lquido esta en ebullicin. * Revisar cuidadosamente las etiquetas de los frascos de reactivos de los laboratorios antes de utilizar su contenido. * Nunca eche residuos de sodio, potasio u otras sustancias que puedan explotar con el agua. * Lave con bastante agua, si se derrama un cido o cualquier sustancia corrosiva a menos que no se indique lo contrario. * Cuando caliente un recipiente debe dejar pasar un tiempo suficiente para que se enfre. A menos que se indique otra cosa, no coloque un recipiente caliente sobre una superficie fra. * Es evidente que no se deben manipular lquidos orgnicos cerca de la llama y deben tomarse las precauciones para evitar que se dispersen vapores de esta clase de lquidos en el laboratorio. Para mayor seguridad se debe adquirir el hbito de mantener los recipientes con sustancias qumicas bien tapados. Apagar los mecheros inmediatamente se termine de usar. * Los papeles y slidos que no sean peligrosos se deben echar en la basura; teniendo en cuenta que los recipientes donde son desechados estas sustancias deben estar debidamente marcados y diferenciados en: inertes o no peligrosos, peligrosos, radiactivos, corrosivos u otra clasificacin que sea empleada dependiendo de las normas de bioseguridad del laboratorio. * Se usaran gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos de proteccin cuando sea necesario proteger los ojos y el rostro de salpicaduras, impactos y fuentes de radiacin ultravioleta artificial. * Se dispondr de espacio suficiente para realizar el trabajo de laboratorio en condiciones de seguridad y para la limpieza y el mantenimiento. * Las paredes, los techos y los suelos sern lisos fciles de limpiar, impermeables a los lquidos y resistentes a los productos qumicos y desinfectantes normalmente utilizados en el laboratorio. Los suelos sern antideslizantes. * la iluminacin ser adecuada para todas las actividades. Se evitaran los reflejos y brillos molestos.

Eugenia Emperatriz Soto Rodrguez Clave 12 Curso de Histologa

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

INMUNOHISTOQUIMICA:
Corresponde a un grupo de tcnicas de inmunotincin que permiten demostrar una variedad de antgenos presentes en las clulas o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas tcnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse especficamente a los correspondientes antgenos. Esta reaccin es visible slo si el anticuerpo est marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloracin. En las tcnicas de inmunofluorescencia se utilizan como marcadores compuestos de fluorescena que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de fluorescena emite luz verde amarillenta intensa. Estas tcnicas necesitan muestras en fresco y congeladas, sin fijacin convencional, pues los antgenos estn presentes en superficies celulares o son muy lbiles a la fijacin en formalina. La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con fluorescena, se aplica corrientemente en el diagnstico de las enfermedades cutneas en donde tiene indicacin y utilidad muy precisas como en enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatas . Esta tcnica pese a ser muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la fluorescencia, requiere de microscopa especializada y el detalle morfolgico es pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reaccin. En las tcnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas ms frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamene al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o protena A. El espectro de anticuerpos disponibles comercialmente crece da a da y actualmente es posible encontrar marcadores para una amplia gama de antgenos (Tabla). EJEMPLOS DE MARCADORES INMUNOHISTOQUIMICOS Anticuerpo CD1a CD4 CD8 CD30 CD45 CD68 S100 HMB-45 AE1 Clulas/antgenos detectados clula de Langerhans linfocito T de auxilio linfocito T citotxico clula de Reed-Sternberg leucocitos macrfagos clulas de Schwann melanocitos citoqueratinas de bajo peso molecular

AE3 DESMINA GFAP CEA AFP REN VIM

citoqueratinas de alto peso molecular clulas musculares gla antgeno carcino-embrionario alfa-fetoprotena receptores nucleares de estrgenos sarcomas

Las tcnicas inmunohistoqumicas enzimticas permite una localizacin ms precisa de las reacciones, ya que la tincin es permanente, estable, puede contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material as estudiado puede archivarse por aos sin prdida de la intensidad de la reaccin. Los anticuerpos monoclonales ha permitido aumentar la especificidad, sensibilidad y gama de esta tcnica. Desventajas existen: presencia de reaccin inespecfica, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales, algunos reactivos son potencialmente carcingenos y su manipulacin debe ser cuidadosa, requieren estandarizacin precisa y estricto control de calidad. Existen diversos tipos de tcnicas, cuya indicacin depender del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y antgenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmticos o nucleares). Estas tcnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos. El control negativo se obtiene realizando la misma tcnica, pero con omisin del paso de incubacin con anticuerpo primario. Existen sistemas automatizados que permiten la tincin de un gran nmero de casos simultneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarizacin de las variable usuales con costo relativamente bajo y en mucho menor tiempo. La inmunohistoqumica tiene utilidad diagnstica en identificacin de diferenciacin y de marcadores pronsticos de neoplasias (marcadores tumorales). Por ejemplo, es posible la identificacin de los productos de oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales, especialmente contra c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53; la identificacin de marcadores de diferenciacin como HMB-45 para melanocitos (melanoma), AE1 para carcinomas, vimentina para sarcomas y CD45 para leuocitos (linfomas). Un elemento importante a considerar es la ptima preservacin del tejido y por ende de los antgenos. La mayora de los antgenos se conservan adecuadamente despus de la fijacin en formalina e inclusin en parafina. Algunos son ms lbiles y slo se detectan en cortes de congelacin. Uno de los problemas actuales con estas tcnicas no es la tcnica en s, manual o automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos anticuerpos existentes, sino la interpretacin de los resultados. Los errores de interpretacin disminuyen a nivel aceptable cuando el patlogo y sus colaboradores tiene experiencia en estas tcnicas y los resultados se analizan a la luz de los dems hallazgos clnico-patolgicos.

Biologa molecular aplicada a histopatologa Este conjunto de tcnicas, que han sido tomadas tanto de la gentica molecular como de la bioqumica, nos permite analizar fenmenos biolgicos y patolgicos en el nivel molecular. Al igual que la microscopa electrnica y la inmunohistoqumica, estas tcnicas pueden aplicarse para refinar el diagnstico en Anatoma Patolgica. Pueden enumerarse las siguientes tcnicas: hibridacin in situ, reaccin en cadena de polimerasa (PCR), in situ-PCR , anlisis de polimorfismo de fragmentos de restriccin, Southern blot, Western blot y Northern blot. Todas las tcnicas mencionadas pueden aplicarse al material obtenido por biopsia, autopsia e incluso muestras citolgicas. La tcnica de Southern blot permite el anlisis de ADN genmico o fragmentos definidos de ADN despus de digestin con endonucleasas de restriccin. La tcnica de Northern blot permite estudiar ARN en forma anloga. El Western blot es una tcnica inmunolgica derivada , que se utiliza para analizar antgenos proteicos. Las protenas se separan mediante electroforesis y se transfieren a una membrana slida o membrana o filtro. La membrana se incuba con anticuerpos, los que se detectan ulteriormente con sondas marcadas radioactivamente o con enzimas.

REACTIVO P53
Objetivo. Analizar el valor pronstico que posee la protena p53 en cada estadio tumoral, como indicador de riesgo de recidiva. Pacientes y mtodo. Estudio prospectivo de una cohorte de 288 pacientes intervenidos por adenocarcinoma colorrectal. Cuarenta y dos pacientes (14,6%) se encontraban en estadio I de la clasificacin TNM (tumor-nodo-metstasis); 144 (50%), en estadio II, y 102 (35,4%), en estadio III. Se analizaron, en muestras tumorales fijadas en formol y parafinadas, variables histopatolgicas y se determinaron mediante inmunohistoqumica las protenas p53 (anticuerpo DO7) y PCNA (proliferative cell nuclear antigen) (anticuerpo PC10). Se analizaron los resultados de p53 en cada una de las categoras de las variables clnicas e histopatolgicas. Se calcul la supervivencia sin recidiva mediante el mtodo de Kaplan-Meier. Se analiz el valor de cada variable como indicador predictivo de aparicin de recidiva tumoral mediante anlisis de regresin de Cox. Se calcularon las hazard ratio y los intervalos de confianza (IC) del 95%, como indicadores del riesgo relativo. El anlisis se aplic en toda la cohorte de pacientes y, posteriormente, fue repetido en cada estadio tumoral TNM por separado. Resultados. Los tumores con sobreexpresin de protena p53 desarrollaron con mayor frecuencia recidiva tumoral y presentaron menor supervivencia sin recurrencia a los 5 aos de seguimiento. Sin embargo, nicamente en los tumores en estadio III la asociacin entre expresin de p53 y evolucin postoperatoria alcanz significacin estadstica. En este subgrupo de pacientes, la supervivencia sin recidiva a los 60 meses de seguimiento fue del 60% en los tumores con p53 negativo y del 26% en aquellos con p53 positivo (p = 0,010). En el anlisis multivariante, p53 se mostr como un factor pronstico independiente asociado a un riesgo elevado de recidiva en tumores en estadio III (hazard ratio = 2,76; IC del 95%, 1,29-5,9; p = 0,009). La sobreexpresin de p53 aport valor pronstico

como indicador de riesgo elevado de recidiva en forma de metstasis (hazard ratio = 2,23; IC del 95%, 1,04-4,75) y no como factor pronstico de recidiva locorregional. No se observ relacin entre el estado de la protena p53 y el efecto de la quimioterapia adyuvante postoperatoria. Conclusin. La protena p53 no posee el mismo valor como factor pronstico en todos los estadios tumorales. Esta protena nicamente posee valor predictivo indicativo de riesgo elevado de recidiva en el subgrupo de pacientes con tumores en estadio III.

Eugenia Emperatriz Soto Rodrguez Clave 12 Curso de Histologa

REACTIVO P53