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Enucncroil Cor,lrrNUADA

L. Castao, J.R.Bilbao,B. Calvo An EspPediatr1997;46:87-92.

Introduccin a la biologamolecular y aplcacin a Ia pediatra(3): Enzimasde restriccin.Reaccin en cadenade la polimerasa. Formasde estudiode mutaciones
SITIO DE RESTBICCION

Introduccin
En este captulo, iniciaremos la descripcin delos diferenquenospermiten testilesy tecnicas detrabajo conocer la esffucturay funcionalidad delADN delosgenes. Comenzaemos describiendo tcnicas en brevemente algunas deusomuycorriente y quemerecen particular, BiologaMolecular, un tratamiento paraposteriormente y planteconcentrarnos enla metodologa amientos deestudio delasalteraciones esffucturales delosgenes. Este resumen no pretende serun manual detcnicas delaboray torio,sinofamiTaizar al mcoclnicoconunosconceptos queaunque unanomenclatura fuerade suprctica habitual, le permita genticos y unamayorcomprensin delos aspectos queforman parte moleculares delosdiferentes trastornos.

a l t r c A A C C A A T T T } A G T T C G T T A

FRAGMENTOS DE RESTRICCION

L Enzimasde restriccin
En la interfase del ciclo celular, el ADN estestructurado queseenrolla comounadoblehebra denucletidos formando poder un ovillo. Frecuentemente,para estudiarlo en el laborapequeos, y estose torio,esnecesario dividirloenfragmentos (o endonucleasas) consigue mediante lasenzimas de restriccin (ER). que LasER sonenzimas, aisladas de diferentes bacterias, poseen la capacidad de cortarla molcula deADN enlugares y especficos pan cada determinados enzima. Hay cientos de y senombran enzimas diferentes, procedentes consiglas dela (EcoRI, bacteria dela queproceden BamHI,HindnI,....etc.). queencuentre Cada unadeellascortael ADN siempre la secuenporla misma (Fig.1).El lugarde ciadenucletidos reconocida (genecorte delADN sellamasitioderestriccin dela enzima ralmente, y 1os unasecuencia de4 a 8 nucletidos), fragmentosdeADN resultantes sonlosfragmentos derestriccin. Un genpuede determinado contener variossitiosderesriccinpara cada ER,y sudigestin lugara varios dar fragmentos. El conjuntodesitiosderestriccin quetiene un gensellamamapade restriccin deesegen(Fig,2). Desde paracortar un puntodevistatcnico, un determinado genconunaenzima derestriccin, el ADN seincuba conla enzima a unatemperatura adecuada durante variashoras(3 4
Unidadde Investigacin, Departamento de Pediatra, Hospitalde Cruces, Barakaldo, Vizcaya. Correspondencia: Dr. Luis Castao. Unidadde Investigacin, 2" plantaEdif. Anatoma Patoigica. Hospitalde Cruces, Plazade Crucess/n,48903Barakaldo, Viacaya.

y mecanismo Figura 1. Sitio derestriccin de cortedeunaenzima derestriccin.La enzima y secciona reconoce la secuencia la doblecadena, para originarlos fragmentos de restriccin. Los sitiosde restricciny la forma del cortesonpropiasde cadaenzima.

horas). Los fragmentos resultantes sepueden separar unosde otros, enfuncinde sutamao, mediante unaelectroforesis en un gel de agarosa o acrilamida, Sonde granaplicacin enla deteccin demutaciones, entcnicas denominadas RFLP (vaseapartadb 3.L2.).

2, Reaccinen cadena de la polimerasa(PCRI


Comohemos vistoenel captulo anterior, cuando serealiza un estudio deADN, steseextrae del tejidoquenosinteresa, generalmente quedisposangre, aunque enocasiones tenemos (encasos nerdel ADN deun rgano determinado enquequeramos estudiar unaalteracin especifica delmismo, comociertasneoplasias). Unavezextrado el ADN genmico, el problemafundamental conel quenosencontramos en el laboratorio esla escasa representacin del genqueinteresa estudiar en la muestra de ADN total.Porestemotivo,senecesitan tcnicas quenospermitan gen,paraobteamplificar especficamente ese nercantidades suficientes dematerial conel quetabaju, e inclupoder sopara detectarlo convenientemente. A pesar dequeexisten mtodos varios deamplificacin de ADN (Reaccin plsmidos, enCadena dela Polimerasa, fagos, etc.)noscentraremos enla descripcin delprimero deellos, ya queesel mssencillo, y msutilizado hoyenda.La Reac-

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(3): Enzimas Introduccin y aplicacin a la biologamolecular a la pediatra de restriccin. Reaccin en cadena de la pomerasa ...

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Figura 2. a) Mapaderestriccin de un fragmento deADN, en el queapaecenlos sitiosdecorteparalasenzimas BamHI y Eco RI. b) Separacin de los fragmentos de restriccin en unaelectrofoesis, en la quelos fragmentos mayores migranmslentamente, pudindose ordenar los mismos Dortamao.

Figura 3. Esquema de una reaccinde PCR, que secomponedel ADN "molde", generalmente el ADN genmicototal. los primersespecficos del fragmentoque se desea amplificar,los cuatronucletidos y 1apolimerasa. Estamezclasesomete a ciclosconsecutivos de tresfases: desnaturalizacin o separacin de las hebras, annealing o unin de los primers y elongacin o sntesis de la nuevacadena.

(PCR,delingls cinen Cadena de la Polimerasa PolymeraseChain Reaction) quesirveparaamplificar esunatcnica in vitro secuencias especficas deADN. Secaracteriza por amplificar material (picogramos), a partirde cantidades mnimas e incluso y plrreza. material deescasa calidad Debido a la rentabilidaddeeste mtodo de amplificacin, esunatcnica deuso comn previoa otrosestudios comopaso deADN. Conceptualmente, el PCResunatcnica que muy sencilla, consiste en aprovechar determinadas caractersticas fsico-qumicas del ADN: desnaturalizacin mediante calory renaturalizacin cuando y replicacin bajala temperatura, enpresencia dela enzima ADN polimerasa y nucletidos (vase cap.1,apartadoLB.).Pararealizar unatcnica dePCRserequieren distintoscomponentes: el ADN quesequiere amplificar, la enzimaADN polimerasa, (A, C, G y T) y los cuatro nucletidos losdosprimerso cebadores (pequeos fragmentos deaproximadamente 20 nucletidos deADN, complementarios a cada unodelosextremos quesedesea (Fig. delfragmento amplificar) 3).La tcnica consiste enmltiples ciclos repetitivos enloscualesocunen tresreacciones por cambios simples, facilitadas en la temperatura (Fig.3).Estas deincubacin delasmuestras tres fases son: - Desnaturalizacin, durante la cual,unaelevada temperatura(superior a 90"C)produce la separacin, por roturade los puentes dehidrgeno, de ambas cadenas complementarias del ADN(vase cap.1, apartado LB.)(Fig.3). - Fase deannealing, o unindelos primers o cebadores a cada unadelashebras delADN desnaturalizado. Enesta etapa, el descenso dela temperatura quelashebras hace tiendan a renaturalizarse, perola presencia provoca queeste delos primers proceso tenga lugarentrelasdoscadenas deADN y cada uno (cada delos dosprimers cadena conit primerrespectivo). La temperatura ptimade annealing primer,y espropiade cada

supuesta a puntoesfundamental para obtener unaamplifica(slodel fragmento cin especfica quenosinteresa) y efrcaz (grannmero decopias delmismo). Esimportante que sealar parala replicacin, los primers sonnecesarios ya quela ADN polimerasa ira aadiendo nucletidos sloa partirde un fragmento inicialdedoblecadena, por la cadena formada moldey el primer(Fig.3). - Elongacin o amplificacin propiamente dicha, enla que ocune la sntesis dela nueva cadena mediante la unin denucletidos complementarios por la enzima a la cadena molde ADN (Fig.3). Hoy endaseutilizanpolimerasas polimerasa estaqueresisten blesa altastemperaturas, ciclosrepetidos de desnaturalizacin-annealing-elongacin. La enzima msutilizada, llamada Taqpolimerasa, seaisldeunabacteria queviveen y resiste aguas termales bienlaselevadas temperaturas dela PCR. Finalizada la elongacin, vuelve a producirse la desnaturalizacin, dando comienzo el segundo ciclo.En el primerciclo partimos deunamolcula deADN condoscadenas complequeactan mentarias, demoldepanla formacin dedosnue(dando vascadenas complementarias, lugara 2 molculas de ADN). En el segundo ciclodisponemos 4 cadenas delasquese producen otras 4. En el tercero, secomienza con8 cadenas producindose otras 8, y asprogresivamente, ocurriendo unamulgeomtrica tiplicacin encada ciclo (Fig.4). De este modo,al final del experimento, quenormalmente seprolonga entre3040 ciclosy tieneunaduracin de3 a 5 horas, seobtienen millo(Fig.5). nesdecopias del genquenosinteresa estudiar mtodos Otros deamplificacin sebasan enla introduccin (plsdelfragmento a amplificar enesfructuras deADN bacteriano midos) queposteriormente o vrico(fagos), sereplican enestos procariotas. organismos Suusoselimitaa ocasiones enlasque no esposible realizar PCR, o sepretende estudiar la funcionali(produccin daddelgenendichos organismos deprotenas, etc.)

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L. Castao y cols,

ANALESESPANOLES DE PEDIATRIA

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I I I I

TSbla I
Nombre

Glasificacin de tcnicas "blot" de hibridacin o deteccin de protenas


Material ADN digeridopor ER

Electroforesis SI SI SI NO

Tipo de sonda ADN o ARN ADN o ARN Anticuerpos ADN o ARN

Aplicacin Variacionesde tamaode ADN (RFLP) Variaciones de tamao e intensidad del ARNm Tamaode protenas Presencia./Ausencia e intensidad

Blot Southern

Northen Blot Westem Blot DotBlot

ARN Protenas ADN oARN

ER: enzimas de restriccin

clclo

......
NCCICLOS AMPLIFICACION NCCICLOS AMPLFICACION

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4 5 6

10 11 12
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4 I 16 32 64 128 256 5'12 1.O24 2.O44 4.096 8.192 16.384 32.768

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

65.s36 131.072 262.144 542.288 1.048.576 2.097.152 4.194.304 8.388.608 16.777.216 33.554.432 67.'t08.864 1U.217.728 268.435.456 1.073.74'1.824

geomtrica de PCR de unareaccin Figura 4. Esquema de la progresin durante los cuatroprimerosciclos.

Figura 5. Rendimiento tericode unareacindePCRde 30 ciclos,a para amplificar. En la prctica tir de unasolacopiainicial de la secuencia ya quelos componentes de 1a los mil millones de copias, no sealcanzan perola amplificacin obtenida sueleebasar el reaccin sevan agotando, ordende masnitud106.

3. Formas de estudio de las mutacones


gentico queregulan la copiadelmaterial Losmecanismos y existen y sutransmisin situaa la descendencia soncomplejos, delADN effores enla replicacin ciones enlasquesecometen mutacromosmicos, etc., apareciendo o enlosreordenamientos las anterior, ciones enlos genes. Comoya sevi enel captulo pueden mutaciones serms consecuencias fisiolgicas deestas y del graves, dependiendo del carcter dela mutacin o menos gen(o genes) escapaz deateafectado. Hoyenda,la Medicina y muy nuarlosefectos nocivos demuchas deestas alteraciones, prontoser posible el objetivo conegirlas in situ.Sinembargo, Molecular enla actualidad esel diagfundamental dela Gentica genticas mediante la deteccin de nstico delasenfermedades presentes en conel fin deactuar lasmutaciones enlosgenes, portadoras gentico o estaa familias delasmismas, el consejo precoz adecuado enqueste blecer un tratamiento enloscasos posible. sea gentico A la horadeplantearse el estudio deunaenfermeclnicoy bioqumico esfundamental. dad,un correcto diagnstico gentico, porun Entre lasenfermedades deorigen seencuentran ya patognica ladoaquellas mutacin ha descrita con cuya sido grucomoesel caso dela hemofilia. Un segundo anterioridad, poraquellas po estara formado enfermedades enlasqueseconG pero queproducen nolasmutaciones la enferceel genafectado, (como degenes conoocurre enla mayora delos casos medad deanlisis aplicable a unoy otrogrupo cidos). La metodologa peroel planteala misma, esfundamentalmente detrastornos En el primercaso, el protomientodel estudio ser diferente. gentico generalmente establecido, mienesti colodediagnstico grupo, quedisear habr unaestrategia trasqueenel segundo para dela mutacada caso, enfuncindela naturaleza deestudio y estructura delgenen encontrar, deltamao cinqueseespera y losrecursos disdela sensibilidad necesaria estudio, ascomo pueden ponibles. stas En 1oqueserefiere al tipo demutacin, cromosenormes deleciones o reordenamientos variardesde (mutacin puntual) micos, a alteraciones deun solonucletido pre(vase 2.).Por otro1ado, el conocimiento cap.2,apartado el anlisis delgenpuede simplificar vio delascaractersticas genes a sufrirdelemolecular. As,algunos sonmssusceptibles queenotros,comoel gendela fibrosisqusmientras ciones, puntuales. infinidad demutaciones ticaocurren pueden los genes asociados a patologas ser Porotraparte, determinante de sexo comoel genSRY(factor muy simples, quepresenta depequeo tamao, o ser masculino) un soloexn (responcomoel genla distrofina estructuralmente complejos, porunaregin codifimuscular) formado sable dela distrofia

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(3): Enzimasde restriccin. ... Reaccin en cadena de la polimerasa y aplicacina la pediatra lntroduccin a la biologamolecular

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OETErcION DE LOS FilGMENTOS DE FESTRICCION

3.1.1.Hibridaci.n in situfluorescenteen cromo (FI SH): somas Lastcnicas citogenticas dealtaresolucin sontilespara (>lMb -megadetectar deleciones o inserciones degran tamao base-), ascomoreordenamientos cromosmicos de esta magnitud. Mtodos como lahibridacin (FISH, in sifufluorescente delingls Fluorescent in situhybridisation),basada enla hibricante de 14kb (kilobases) por80exones (y 79intro- dacin constituida desondas marcadas conun compuesto fluorescente aprenes). El estudio deestos ltimospuede simplificarse mediante paraciones cromosmicas, soncapaces de detectar no solola el anlisis producido deADN complementario (o ausencia) presencia a partirdelARN deun determinado fragmento cromosmensajero, lo quepermite (va- mico,sinoquepuede estudiar nicamente los exones determinar suposicin enel genoma. Esta secap.2, apartado 3.), siempre quesedisponga deunamues- tcnica esespecialmente til parala deteccin deaneuploida tradeltejidoqueexpresa gen.Cuando ese esto noesas,el an- (nmero anormal decromosomas), y duplicaciones deleciones lisisdeADN genmico sehace inevitable. gentico, dematerial ascomoreordenamientos cromosmiDesde unpuntodeprctico, podemos clasificar lastcnicas coscomplejos. dedeteccin demutaciones endosgtupos por una arbitrarios: parte, seencuentran aquellas metodologas quesebasan enel 3.1.2. Hibridacin Southern blot - RFLP: estudio directo delADN genmico y porotrolado, completo, Latcnicade Southern blotesunodelosmtodos mssenlasque analizan regiones concretas previamente cillosparala deteccin del genoma genmicas, demutaciones y presenta por la tcnica amplificadas dePCR(vase apartado 2.). la ventaja dequeno handeconocerse endetalle la estructura o secuencia del gena estudio. Sedefine comola hibridacin con 3.1.Mtodos de anlisis directoen genoma completo: sondas marcadas, por enzimas delADN genmico digerido de Losmtodos basados enel estudio enel genoma sinampli- restriccin. Tcnicamente, el ADN genmico delpaciente se ficacin gnica porPCRsehanutilizado clsicamente enel an- digiere conla enzima y losfragmentos derestriccin elegida, de lisisgentico. Hoy endaestn indicados encasos enlosquela restriccin seordenan po tamao mediante electroforesis. Pospropiaestructura del genhace muydifcil quesea amplificado teriormente, sehibridan conunasonda marcada, complementaconvenientemente, ascomocuando quela muta- ria al genestudiado, sesospecha la cuallocalizar el fragmento corresponcinimplica grandes extensiones deADN, imposibles deampli- diente enel genoma, mostrindonos el tamao delgen,quepueficar(deleciones o inserciones amplias). En estos mtodos, la de compararse a un patrn denormalidad. Estatcnica estil proporcin delgendeinters frente al resto delgenoma esmuy paradetectar y deleciones inserciones moderadas, queprovopequea, lo queimpidesudeteccin/visualizacin directa. Para carn unadiferencia detamao delosfragmentos derestriccin poner demanifiesto estas secuencia$de ADN, serecuffe a tc- (Fig.6),Tambin puede para servir detectar mutaciones punnicas dehibridacinconsondas. tuales, cuando stas ocurren enel sitioderestriccin dela enzi-

Figura 6. Esquema de un experimento de RFLPpor Southern b1ot. El ADN genmicode los individuos a estudiarse digierecon la enzimade restriccin (ER) adecuada, y los fragmentos derestriccinseseparan por electroforesis. Esteproceso provocala migracinde ios fragmentos el desde polopositivoal negativo, quedndose rezagados los fragmentos demayor y obtenindose tamao, un odenamiento por tamaos delos mismos. Este ADN separado por tamao,en el que no es posibleidentificarlos diferentes fragmentos, sehibridacon una sonda especfica parael genobjeto "bandeestudio. En el ejemplo de1afigura,el controlnormalpresenta dos das"(calleN). El individuo 1,ha sufridounainsercin, con1oqueel fragmentomayorha aumentado de tamao,el 2, por el contrario, ha sufrido una delecin,y el fragmentodisminuyede tamao.El individuo 3 slo presenta por unadelecinmsimportante, unabanda,

Sedefine sonda(enngls probe)comounafragmento de cidonucleico queseutilizaparalocalizar conocido, alguna secuencia concreta delgenoma, a la quepuede por ser unirse complementaria. Lassondas pueden serdeADN o ARN, y de (desde tamao variable pocos nucletidos a milesdebases). Para pueden suvisualizacin, ir marcadas conradiactividad o con otrosistema dedeteccin. La hibridacinsebasa en el hecho de queunamolcula deADN sometida a caloro a la accin deun lcalisedesnaturaliza,para volverse a renaturalizar cuando serestablecen las condiciones normales. Si el ADN genmico sedesnaturaliza en presencia deunasonda marcada, cuando ocurra la renaturalizacin,la sonda seunira sussecuencias complementarias en el genoma. El marcaje permitir dela sonda y visualocalizarla, lizarconjuntamente susecuencia complementaria enel genoma analizado. La hibridacin consondas esla base tcnica devarios mtoquesediferencian dosde estudio, en el materialsobre el que serealiza: hibridacin sobre cromosomas ntegros o sobre ADN purificado. A continuacin sedetallan algunos delosmscomnmente utilizados:

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ANALESESPANOLES DE PEDIATRIA

(aadiendo o anulando unoexistenun sitionuevo mautilizada delos fragmentos cambio enel tamao te, conel consecuente tambin RFLP blot sedenomina El Southern derestriccin). porque (Re analiza Polymorphism), Length strictionF ragment (polimorfismos) de los fragmentos del tamao lasvariaciones derestriccin. a stesonel NorthernBlot, ene\ Otrosmtodos anlogos y elWestem BIot (o quesehibridala sonda a ARN mensajero, porelecprotenas separadas enel quesedetectan Immunoblot), marcados. troforesis mediante anticuerpos 3.L3. Hibrideci.n dot blot: podraconsiderarse de la unasimplificacin Estatcnica y la por enzimas y omitela digestin de restriccin anterior, posterior. As,el ADN totalsehibrida conla sonelectroforesis pondr de manifiesto La aparicin o no de seal da marcada. y un anlisis buscada, dela secuencia la presencia o ausencia puede si existe delecin deunodelos determinar cuantitativo alelos. para pequeas unodelos especficas cada Utilizando sondas gen,llamadas alelooligonucletidos un determinado alelos de (ASO, Allele Oligonucleotides) del ingls Specific especficos pueden grannmero hibridemuesffas enpocotiempo, analizar para y normal el aleo la sonda el alelo dando lasmuestras con (Fig. mensajees muy utilizada con ARN mutado 7). Tambin el grado deexpresin del gen ro, ya quesirveparacuantificar estudiado.

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DIAGNOSNCO

dot blot utilizandooligonucietidos alelo-especfiFigura 7. Hibridacin En el ejemplo,seutilizan dos sondas, unapara cos (ASO) como sondas. normal,y otraparala secuencia mutada.El ADN de cadaindila secuencia y sehibridacon cadaunade las sonen unamembrana viduo sedeposita de sealindicala presencia de esealelo en dicho indidas.La aparicin viduo. As, aquellosque dan sealcon la sondanormal son individuos "N"; por aquellos a los queunicamente hibridala sone1contrario, sanos, "patognica" afectos, "A". Finalmente, los quepresentan hibridada son paraambosaleios(un croseranheterozigotos cin con ambassondas y en esteejemcon el gennormaly el otro con el genpatognico", mosoma "P". portadors plo ios consideramos

secuencias deADN, ascomosulocalizacin crodeterminadas mosmica. deADN Fragmento de restriccin: cada unodelostrozos por la digestin deuna conenzimas derestriccin originados molcula deADN. Hibridacindot blot: hibridacin enla quela sondase hibrida a ADN o ARN sin digestin enzimtica ni separacin Glosario para presencialausencia por de que electioforesis, sirve detectar la palabra la inglesa hace referencia a unin Annealing: que quiere de ADN o ARNm concretos. primers secuencias la secuencia se amplificar especfica delos a enla quela sonHibridacinNorthernblot: hibridacin porPCR. Sedenomina de astambin a la fasede la reaccin por parala detechibrida a ARN separado electroforesis, que da se dichaunin. PCRenla ocurre (del y medida cuantificacin de ARNm especficos, como de Allecin alelo-especficos ingls, ASO: Oligonucletidos genes. para los pequeas actividad de diseadas le specffic sondas, oligonucleotide), enla quela sonda Ilibrid-acin Southern blot: hibridacin quepuedan alelos(o mutaciones discernir entrelos diferentes genmico hibrida con ADN conenzimas gen. marcada se digerido serutilizadas enhibrideundeterminado Suelen conocidas) para y por ya Es tcnica para de restriccin separado electroforesis. una el screening demutaciones conocidas. dacindot blot, RFLP. primer. la deteccin de vase Cebador: paraponer demanifiesto la Ilibridacin: tcnica utilizada proceso hebra de Elongacin: de sntesis deunanueva (o presencia ADN ARN) entre polimerasa, partfu primer de determinadas secuencias de ADN por accin a deun de la ADN (genoma ...) compleja decidos nucleicos completo, o cebador. Fase de la reaccilde PCR en la queocurreeste unamezcla (o la fragmento de ADN ARN) meante uninespecfica deun proceso. querecibe el nombre desonda. llamadas endonucleasas marcado, Enzimasde restriccin:tambin deresquereconocen illupuh. restriccin: sucesin linealdelos sitios especfisecuencias derestriccin, sonenzimas y cortan enun segmento enzimas derestriccin la doblecadena de triccinparadiferentes casdeADN lsitiosde restriccin) proximidade$. un exon, etc.). ADN enese lugar(o ensus Sedesignan connom- deADN (ungen, vase ReacPCR:(delingls, Polymerase Chain Reaction), a la cepa bacteriana dela quehansidoaislados bresreferentes (EcoRI, HindIII, PvuII, etc.); de la polimerasa. obte- cin0n cadena enla actualidad sepueden (genePrimer: (o cebador) secuencia cortadenucletidos distintos. nercomercialmente msde 100enzimas (delingls por lo quetambin 15-30 bases, sedenominan oligoFISH: Hibridacin in sila fluorescente Fluores- ralmente nucletido) capaz deunirse a unahebra deADN desnaturalimarcada conun centin situHybridisation), enla queunasonda por la ADN polimeeshibridada a unapreparacin cromo- zadoy servirdeinicio parala elongacin compuesto fluorescente queflanquean pormicroscopa En la PCR,Ia pareja deprimers la secuensmica, defluorescencia, rasa, conel fin dedetectar,

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(3): Enzimas Reaccin en cadena de la polimerasa . y apiicacin a la pediatra Introduccin a la biologamolecular {e restriccin.

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a esa paraunirse solamente diseados estn cia a amplificar especfica la amplificacin conlo queseobtiene secuencia, deinters. delfragmento (PCR):tcnica de de la polimerasa en cadena Reaccin dedesnatuconsecutivos enla queciclos Molecular Biologa (primers)y elongacin delos cebadores nlizacin,annealing (copiar) determiamplificar consiguen porla ADN polimerasa utiSesuele deunmillndeveces. deADN ms nada secuencia de de deteccin previoa diferentes tcnicas lizarcomopaso mutaciones. Plymor' Length Fragment Restriction RFLP: (delingls, derestricdelos fragmentos del tamao phism)Polimorfismo enlostamaentre individuos a variaciones referencia cin,hace enlosprodebido a mutaciones derestriccin osdefragmentos dos entre o a inserciones/deleciones piossitiosderestriccin la hibri' sesuele emplear Para sudeteccin, derestriccin. sitios por deamplificacin blot,o bienunproducto dacinSouthern cap,4.). PCR(vase queesreconocida concreta secuencia Sitio de restriccin: As,por restriccin. enzimade y sobre determinado la queacta GAAITC, Bam la secuencia EcoR[ reconoce la enzima ejemplo, etc.). GGATCC, HI reconoce

marcadeADN (o ARN),generalmente Sonda:fragmento genoma, quese regin del a determinada complementario do, procesos de hibridacin. para en sta ltima utiliza localizar quesepadeprotenas, dedeteccin blot: tcnica Western presencia de antipor incubadas en son radas electroforesis, (separacin la metodologa La analoga de marcados. cuerpos quesea incluietc.)hace detamao, deteccin electrofortica, "blot". daconlosotros

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