ACARA II ISOLASI DNA TANAMAN A. Pendahuluan 1.

Latar Belakang Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging. Pada kali ini kita bahan isolasi DNA tanaman. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandungn protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel. Deteksi DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan alat yang dapat menunjang proses isoasi DNA. PCR merupakan teknik untuk mengamplifikasi DNA dalam jumlah kecil melalui proses enzimatik secara in vitro. Penggandaan yang dilakukan PCR bertujuan untuk

memperbanyak jumlah DNA agar dalam isolasi dapat diperoleh DNA

dalam jumlah besar. Biasanya mesin itu digunakan sebagai amplifkasi DNA mikroorganisme. melalui elektroforesis dapat dilakukan dengan gel agarose dan gel polyacrilamide. Namun, pada praktikum kali ini menggunakan gel agarose. Karena jumlah DNA yang hanya mencapai 10 ng mampu terdeteksi oleh gel agarose. Proses elektroforesis gagal dilakukan, waktu dan arus yang terlalu tinggi ditengarahi menjadi faktor utama kegagalan tersebut. Manfaat dari praktikum isolasi DNA tanaman ini adalah untuk mengetahui teknik dalam mengisolasi DNA dan mengetahui langkah serta fungsinya. 2. Tujuan Praktikum Praktikum bioteknologi acara isolasi DNA tanaman bertujuan untuk : a. Membandingkan 3 metode isolasi yang berbeda b. Mengetahui proses isolasi DNA c. Memahami fungsi tiap- tiap perlakuan d. Mendapatkan DNA yang baik dan sesuai standar 3. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum Acara I Prinsip Dasar Dan Pengenalan Alat Serta Bahan Bioteknologi dilaksanakan pada Hari Rabu tanggal 12 Maret 2014 pukul 13.00-15.00 di Laboratorium Bioteknologi, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. B. Tinjauan Pustaka Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Deoxyribo nucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo 2004).

Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih. Padahal tidak selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan sekitar. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. (Arhan 2009). Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Achmad 2010). Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Upaya untuk mengeluarkan DNA dari sel dilakukan dengan merusak dinding dan membran sel dan juga membran inti. Cara yang digunakan untuk merusak membran-membran tersebut sangat beraneka ragam, misalnya dengan pemblenderan atau penggerusan dengan mortal dan pistil. Selain perusakan secara fisik, membran dan dinding sel dapat pula dirusak dengan menggunakan senyawa-senyawa kimia. Perusakan dinding sel dan

membran sel pada praktikum isolasi DNA kali ini dilakukan dengan cara penggerusan. DNA yang didapatkan dalam pengamatan kali ini adalah DNA yang berupa benang-benang halus (Istanti 2000). Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Arsis 2010). C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja 1. Alat a. Alat-alat gelas (erlenmeyer, labu takar, petridish, tabung reaksi, beaker glass, dll) b. Alat-alat non gelas (pinset, spatula, gunting, dll) c. Alat ukur (gelas ukur, pipet ukur+rubber, bulb filler, mikropipet) d. Alat sterilisasi (oven, autoclave, incubator) e. Alat pemanas (hot plate, bunsen burner, water bath) f. Alat sentifus (centrifuge) g. Alat ukur keasaman (pH meter, indikator lakmus) h. Timbangan (timbangan, timbangan analitis) i. Mortar dan pestle j. Instrument (Thermocycler, UV transilluminator, Spektrofotometer, Vortex, Elektroforesis, dll) 2. Bahan a. Tris-EDTA b. CTAB c. Mercaptoetanol d. CIAA e. Isopropanol f. Aquades g. Sodium Acetat h. Loading Dye i. Floresafe/Etidium Bromide j. TAE/TBE k. Etanol l. Chloroform

3. Cara Kerja Cara kerja pada acara isolasi DNA tanaman ini menggunakan metode 2 dari Setiawan 2014, yaitu sebagai berikut a. DNA genomik sampel diisolasi dengan menggunakan 50 mg daun, digerus hingga halus, sebelumnya daun didinginkan dalam freezer terlebih dahulu hingga beku. b. Memanaskan buffer ekstraksi CTAB (yang sudah ditambahkan 10% Mercaptoetanol) 800l pada suhu 65C selama 30 menit. c. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam Waterbath selama 60 menit dan setiap 10 menit dibolak-balik. d. Setelah 60 menit dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut ditambahkan dengan 500l kloroform isoamil alkohol (24:1) e. Campuran disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm. f. Supernatan yang terbentuk diambil dengan hati-hati dan dipindahkan ke mikrotube yang baru dan mencatat volumenya. g. Menambahkan isopropanol 2/3 volume, kemudian di vortek hingga tercampur rata dan menyimpan dalam freezer selama minimal 1 jam. h. Sampel kemudian di sentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm. i. Setelah disentrifugasi, buang cairan atas dan endapan DNA dicuci dengan menambahkan etanol 70% 400l. j. Melakukan sentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. k. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 25l bufer TE (10Mm Tris-HCl pH 8,0 ; 1 Mm EDTA pH 8,0). l. DNA disimpan pada suhu 4C.

D. Hasil dan Pembahasan 1. Hasil

1. Sterilisasi Alat dan Bahan

2a. Pemanasan Larutan Buffer CTAB

2b. Mendinginkan dengan mortar & pastle dalam freezer selama 30 menit

Water bath

3. Memotong, Menimbang dan Menggerus dengan larutan buffer CTAB, memasukkan hasil ke tabung effendof yang ditambahkan chloroform (800 nm) dan digojog hingga homogen
Khloroforom

4. Melakukan sentrifuge pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit

5. Mengambil cairan lapisan atas, kemudian dipindahkan ke tabung baru

Lapisan Atas

Sodium Asetat

6. Menambahkan 1/10 dari volume 2,5 Soidum asetat & 650 ul Isopropanol dingin, mencampur hingga homogen kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 13.000 selama 5 menit
Supernatant

Isopropanol dingin

7. Membuang supernatant, kemudian mencuci pellet dengan etanol 70% 500 ul

+ etanol

Ditutup dengan tissue Pellet

-20 oC

8. Mengeringkan pellet DNA dengan kering angin 10. Menyimpan dalam suhu rendah -20 oC kering angin 9. Melarutkan DNA 200 ul TE, menghitung konsetrasi DNA dengan spektrofotometer OD kering angin

2. Pembahasan Isolasi DNA adalah cara untuk memisahkan DNA dari sel baik dari inti, mitokondria dan kloroplas. Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi dan ekstraksi DNA secara maksimal. Isolasi DNA dapat dilakukan dengan beberapa tahap, yaitu isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, diekstraksi dalam larutan, purifikasi dan presipitasi (Anonim, 2010). Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni yang bebas dari RNA maupun protein lainnya hal ini didasarkan pada proses sentrifugasi (berat molekul),kemudian dilanjutkan dengan

amplifikasi DNA dengan PCR. Hal tersebut bermanfaat dalam memperbanyak jumlah DNA agar bisa dimanfaatkan lebih maksimal karena jumlahnya lebih banyak. Kemudian diidentifikasi dengan proses RFLP agar tahu variasi-variasi dari bahan genetic tersebut. Dan hasilnya dilihat menggunakan Elektroforesis Gel Poliakrilamid untuk mengetahui visualisasi dari semua praktikum diatas. Agar bisa ditentukan berat molekul dan menentukan keberhasilan teknik tersebut. Isolasi merupakan pemishan materi dari materi lain untuk di identifikasi. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging. Pada kali ini kita bahan isolasi DNA tanaman. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandungn protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak

asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel. Salak (Salacca zalacca (Gaertner (Voss) merupakan tanaman asli Indonesia. Buahnya banyak digemari masyarakat karena rasanya manis, renyah dan kandungan gizi yang tinggi. Salak mempunyai nilai ekonomis dan peluang pasar yang cukup luas, baik di dalam negeri maupun ekspor. Pulau Jawa sebagai salah satu pusat keragaman kultivar salak, mempunyai potensi yang cukup besar untuk menghasilkan varietas-varietas unggul yang lebih bernilai ekonomis dan kompetitif. Pusat keragaman genetik yang ada di pulau Jawa meliputi: Condet (Jakarta), Manonjaya (Tasikmalaya- Jawa Barat), Banjarnegara, Bejalen, Saratan, Njagan, Lawu (Jawa Tengah), Sleman (Yogyakarta), Malang, Pasuruan dan Madura (Jawa Timur) (Sudaryono et al. 1992). Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris: deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Pengujian DNA dilakukan untuk mendapatkan genetik tanaman yang unggul sesuai dengan yang kita inginkan. Sehingga bermangaat bagi kehidupan manusia. Pengujian DNA biasanya dilakukan untuk dalam bidang pertanian ntuk mendapat kan tanaman yang tahan dan resisten terhadap hama dan penyakit tanaman. Langah awal pada isolasi DNA yang harus dilakukan adalah dengan mensterilkan sample, mortar dan pastel agar tidak terkontaminasi dengan partikel lainya, karena partikel DNA merupakan partikel yang sangat kecil

sehingga gangguan partikel lain akan mengakibatkan gagalnya percobaan isolasi DNA ini. Kemudian menimbang bahan yang akan digunakan untuk diisolasi DNA-nya sebanyak 0,05 gram daun Salak. Setelah digerus kemudia ditambah dengan CTAB dan ditambahkan dengan 10% mercapthotanol. Hasil penambahan kemudian di vortex ke dalam mikrotube sebagai tempat menaruh ekstrak sel yang akan di amati DNAnya. Setelah didapatkan ekstrak dan dimasukan ke dalam mikrotube kemudia di inkubasi di waterbath selama 60 menit (1 jam). Selama menginkubasikan dilakukan pembalikan setiap 10 menit sekali agar anas dari alat incubator dapat merata ke seluruh ekstrak DNA yang ada di mikrotube. Setelah di inkubasi di waterbath didiamkan di dalam suhu kamar hingga mendingin. Setelah mendingin ditambah dengan 500L khlorofoam isoamil alcohol (24:1) dan di sentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan putaran sentrifuge sebesar 12.000 rpm. Kemudian mengambil super natan dan memindahkan ke dalam mikrotube baru dan mencatat volumenya. Setelah dipindahkan ke dalam mikrotube baru di tambah dengan Isopropanol 2/3 dari volume ekstrak yang di pindahkan ke dalam mikrotube tadi kemudia di vortex kembali. Kemudia disimpan ke dalam freezer selama kurang lebih satu jam dan di sentrifuge kembali selama 10 menit dengan kecepatan putaran 12.000 rpm. Setelah di sentrifuge akan membentuk endapan cairan atas dan bawah, cairan atas dibuang dan memcuci endapan dengan etanol 70% sebanyak 400L lalu di sentrifuge selama 5 menit kecepatan 12.000 rpm. Endapan DNA akan mongering, kemudian dilarutkan ke dalam 25 L buffer 1E (10 mM tris. Hcl pH 8; 1 mM EDTA pH 8.0). Kemudian DNA disimpan ke dalam suhu 40C atau disimpan dalam lemari es di dalam freezer. Setelah DNA disimpan DNA dapat digunakan untuk proses selanjutnya.

C. Kesimpulan dan Saran 1. Kesimpulan Berdasarkan data dan hasil pengamatan diatas maka dapat disimpulkan : a. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. b. Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Cara yang digunakan praktikum ini adalah metode Prof. Nandariyah. c. Hasil isolasi DNA berupa supernatan dan cairan bening. 2. Saran Waktu penyusunan laporan terlalu singkat sebaiknya ditambah lagi. Dan waktu saat menunggu terlalu lama seharusnya dapat digunakan untuk membuat laporan sementara sehingga tidak menumpuk pada akhir kegiatan.

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2010. Isolasi DNA. Http://www.biology.arizona.edu/biochemistry. Diakses tanggal 16 April 2014. Asris 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/.diakses pada 3 April 2014

Achmad 2010. Wendy. Isolasi DNA. Bandung. Istanti 2000. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM. Neil, Campbell 2002. Biologi. Jakarta : Erlangga. Suryo 2004. Genetika Strata 1. Yogyakarta : UGM Press.