Facultad de Farmacia Gua de laboratorio 3

Ctedra de Microbiologa
LABORATORIO N 3
Observacin macro y microscpica de cultivos
1. Observacin acroscpica
1.1. !ultivos slidos
Cuando una clula microbiana se siembra sobre un medio de cultivo slido, sta se
desarrolla multiplicndose varias veces hasta formar una estructura macroscpica denominada
colonia. As, se puede definir una colonia como el desarrollo aislado de una cepa microbiana,
la cual crece hasta alcanzar un tamao determinado que se mide en milmetros. Una colonia
est formada por aproimadamente !"
#
clulas $clones de la clula ori%inal que dio ori%en a la
colonia&. 'u aspecto macroscpico es caracterstico de cada especie, siempre ( cuando se
siembre en el mismo medio ( se incube ba)o las mismas condiciones ambientales. *a
caracterizacin de colonias se hace en base a los si%uientes criterios+
,& -A.A/0 %rande, mediana, pequea, puntiforme
1& C02'3'-42C3A blanda, firme, mucosa a viscosa $propia de bacterias capsulazas&
5& 'U64783C34 lisa, ru%osa, brillante, seca, opaca, h9meda
#& 0*07 aromtico, desa%radable, ausente
#& C0*07 ausente o presente. 'e debe considerar color de la colonia $endopi%mento&,
pero tambin la produccin de pi%mentos que difunden al medio $eopi%mento&, e).
Pseudomonas aeruginosa.
1.". Observacin macroscpica en medios l#$uidos
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4n la ma(ora de los casos el desarrollo de las bacterias en medios lquidos se aprecia por
la aparicin de turbide% en el caldo sembrado. 'in embar%o, para ciertos microor%anismos, el
medio puede permanecer transparente con un crecimiento que se aprecia como mi&a'as en
suspensin. 4n el caso de bacterias aerobias estrictas, se %enera un velo en la superficie del
medio, o un anillo cuando stas son capsuladas o presentan slime $cpsula laa poco
or%anizada&.
4n cultivos lquidos tambin se puede observar caractersticas como olor ( cambio de color
si la bacteria produce eopi%mantos.
". Observacin microscpica
*os microor%anismos pueden ser observados directamente usando un instrumento de
precisin, el microscopio. 'i la finalidad es ver microor%anismos vivos, para observar su
movilidad o su reaccin frente a elementos qumicos, se les debe observar '32 teir. 6or el
contrario, si se desea observar detalles de forma, estructuras o a%rupacin, es necesario tratar
los microor%anismos con colorantes, proceso llamado tincin.
".1. Observacin de microor&anismos sin tincin
(reparacin )*meda+ es la forma ms simple de observar clulas vivas. 4sta tcnica
consiste en suspender un inculo del cultivo en suero fisiol%ico estril $",,:",#; 2aCl&. *ue%o
se deposita una %ota de sta suspensin sobre un portaob)eto limpio. 8inalmente la %ota se
cubre con un cubreob)eto ( se observa al microscopio.
".". Tinciones
(reparacin de la muestra a te,ir+ 6ara teir microor%anismos se debe depositar una
pequea cantidad de la muestra a eaminar sobre un portaob)eto limpio $! < = %otas de cultivo
lquido&. 'i la muestra proviene de un medio slido, esta se emulsiona con unas %otas de suero
fisiol%ico estril. *a muestra se etiende con el asa, hasta que quede una fina pelcula sobre el
portaob)eto. 4sta pelcula se denomina -rotis.
6ara teir el frotis, ste debe estar seco. 4sto se lo%ra mediante un procedimiento llamado
-i'acin, que puede realizarse usando sustancias qumicas o calor. *o ms usado es la fi)acin
por calor que consiste en pasar el portaob)eto, con el frotis, varias veces sobre la llama del
mechero. 4ste procedimiento deshidrata ( mata las clulas presentes en el frotis ( hace que se
adhieran al porta ob)eto.
!oloracin de la muestra+ Una vez fi)ado el frotis, se procede a aplicar el o los colorantes,
esto depende del tipo de tincin que se desea realizar. *os colorantes son compuestos
qumicos, %eneralmente sales, que tienen afinidad por ciertas estructuras celulares a las cuales
se fi)an.
'e pueden diferenciar tres tipos de tinciones+
!. Tincin simple hace uso de un solo colorante. 6ermite ver forma ( tamao.
=. Tincin di-erencial permite separar $diferenciar& las bacterias en %rupos de
acuerdo a su reaccin diferencial frente a dos colorantes. 4). tincin de >ram (
tincin de ?iehl:2eelsen.
@. Tincin especial 9til para observar estructuras celulares $e). cpsula, esporas (
fla%elos& o microor%anismos difciles de teir $e). Micoplasma ( Rickettsias&.
".".1. Tincin di-erencial de .ram
4s la tincin de uso corriente en microbiolo%a ( permite dividir las bacterias en dos %rupos,
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%rampositivas ( %ramne%ativas.
T/cnica+ 1. realizar frotis ( fi)acin de la muestra
". teir con cristal violeta por ! min
3. lavar con a%ua ( aplicar lu%olA por ! min
0. lavar con a%ua ( decolorar con alcohol por @" se%
1. lavar con a%ua ( teir con fucsina bsica
2. lavar con a%ua ( de)ar secar al aire
3. observar al microscopio con ob)etivo de inmersin
A 4l lu%ol es un mordiente que tiene por funcin aumentar la afinidad del colorante $en este caso
cristal violeta&, por las estructuras celulares a las cuales ste se une.
4undamento de la tincin de .ram
6robablemente la diferencia entre bacterias %rampositivas ( %ramne%ativas se debe a la
naturaleza fsica de sus paredes celulares. 6arece ser que, en %rampositivas, durante la etapa
de decoloracin, el alcohol contrae los poros de la %ruesa capa de peptido%lucanoB ( en
consecuencia el comple)o cristal violeta:lu%ol queda retenido dentro de la clula ( las bacterias
adquieren un color azul:violeta. 6or el contrario la capa de peptido%lucano de las
%ramne%ativas es ms fina, con menos enlaces ( con poros de ma(or tamao. Adems, es
posible que el alcohol etrai%a suficientes lpidos de la membrana eterna %ramne%ativa como
para aumentar su posterior porosidad. 6or este motivo el alcohol elimina ms fcilmente el
comple)o cristal violeta:lu%ol en las bacterias %ranme%ativas.
".".". Tincin di-erencial de 5ie)l6Neelsen
*os microor%anismos pertenecientes al %nero Mycobacterium se caracterizan por tener
una pared celular completamente diferente a las dems bacterias. *a pared de micobacterias
posee un alto contenido de l#pidos que la hace impermeable a los a%entes hidroflicos, por lo
tanto estos microor%anismos no se tien adecuadamente con la coloracin de >ram. 6ara teir
micobacterias se usa el mtodo de ?iehl:2eelsen $o -incin Acido:Alcohol 7esistente&, el cual
utiliza como solucin decolorante una mezcla de etanol ( cido clorhdrico. 4stos
microor%anismos una vez coloreados son resistentes a la decoloracin cido:alcohlica ( por
eso se denominan Bacilos Acido Alco)ol Resistentes 7BAAR8.

T/cnica de Tincin 5ie)l6Neelsen
!. Certer sobre el frotis previamente fi)ado, de !" a !, %otas de carbol fucsina.
=. Calentar hasta emisin de vapores. 7epetir ! a D veces el mismo procedimiento.
@. Eecolorar con alcohol clorhdrico $FCl:etanol&.
D. *avar con a%ua.
,. -eir con azul de metileno, durante un minuto.
1. *avar con a%ua ( de)ar secar.
5. 4aminar al microscopio con ob)etivo de inmersin.
4undamento y resultados de la tincin
*as micobacterias debido a su alto contenido lipdico a nivel de pared celular, son
relativamente impermeables a los colorantes. 6or ello, el colorante carbol fucsina se aplica con
calor de modo de GablandarH ( permeabilizar la pared celular. 6or otra parte, el colorante en
forma de vapor posee un ma(or poder de penetracin ( adems, el carbol fucsina tie los
cidos miclicos propios de la pared celular de micobacterias. Al a%re%ar la solucin
decolorante $FCl:etanol&, se produce un efecto de deshidratacin, lo cual GcierraH las vas de
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entrada, quedando el colorante al interior de las clulas. 8inalmente al a%re%ar azul de
metileno, en fro, este no penetra al interior de las clulas. Ee este modo, las micobacterias se
observan de color ro)o, mientras que otros %neros bacterianos aparecen teidos de azul.
".".3. Tincin especial+ 9sporas
T/cnica+ 1. realizar frotis ( fi)acin de la muestra
". cubrir el frotis con papel filtro
3. teir con verde malaquita a emisin de vapores por !" a !, min
0. de)ar enfriar el porta ob)eto ( lavar con a%ua
1. teir con safranina por ! min
2. lavar con a%ua ( de)ar secar al aire
3. observar al microscopio con ob)etivo de inmersin
4undamento de la tincin de esporas
*as endoesporas son estructuras de resistencia a condiciones adversas como por e)emplo+
altas temperaturas, radiaciones UC, etc. Como estructuras de resistencia, poseen, entre otras
caractersticas, tres %ruesas cubiertas protectoras, las cuales las hacen impermeables a los
colorantes. Eebido a esto, para teir una endoespora es necesario aplicar el colorante con
calor para GablandarH sus capas protectoras. Adems, el colorante vaporizado penetra, los
microporos que se forman con el calor, ms fcilmente que en estado lquido. Al enfriar ( lavar
el portaob)eto con a%ua, los microporos se cierran quedando el colorante $verde malaquita&,
atrapado dentro de la endoespora. 8inalmente, en esta tincin se usa un colorante de
contraste, la safranina, que tie la clula ve%etativa de color ro)o, contrastando con las
endoesporas que se observan de color verde.