INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus

Guanajuato (UPIIG)




Laboratorio de Biotecnologa Molecular


5BV1


Integrantes:
Hugo Ramrez Rodrguez 2011660475
Juan Cristbal Garca Garca 2012660213
Jose Gilberto Savi Tejeda 2012660319
Ricardo Rafael Marn Mosqueda 2010660234



Profesores:
Dra. Karla Lizbeth Macias Snchez
M. en C. Francisco Snchez Lpez
Dr. Csar Aza Gonzlez

Composicin del gel de agarosa:
0.3 g de agarosa + 30 mL de Buffer

Especificaciones de electroforesis:
30 min
89V
4W
46mA


RESULTADOS
Siguiendo el protocolo se llevo a cabo la extraccion y purificacion de ADN plasmdico
proveniente de la bacteria Escherichia Coli.

La experimentacin se llev a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa y a
travs del Nanodrop, el cual es un espectrofotmetro de amplio espectro que mide
muestras de 1 microlitro con alta precisin y reproducibilidad mediante mtodos de
tensin superficial. (vila, 2008)

Los resultados obtenidos por cuantificacin por Nanodrop se observan en la tabla 1.

Tabla I. Cuantificacin de DNA por Nanodrop para Escherichia coli.

Muestra I Muestra II
A260 2.530 4.618
A280 1.609 4.700
A260/280 1.57 0.98
A260/230 0.19 0.81
Concentracin de DNA
(ng/L)
230.9 126.5

De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede observar en la tabla I que
la muestra I se encuentra parcialmente libre de protenas presentes, lo cual
es evidenciado por la relacin de absorbancias 260/280 siendo menor a
1.75 considerando ste valor como un ptimo para una muestra libre de
protenas, sin embargo en la muestra II ste valor se encuentra muy por
debajo del valor establecido como ptimo, lo cual representa una
contaminacin de la muestra (probablemente por error humano durante la
tcnica) afectando significativamente los valores de deteccin de DNA en
la muestra contenida

La relacin 260/230 hace referencia a la contaminacin correspondiente
por fenol, cloroformo o carbohidratos. ste valor debe estar por debajo de
0.5, observando la tabla I, sobresalen los valores de ambas muestras, ya
que en la numero 1 el valor esta dentro del rango marcado mientras que la
muestra 2 esta por arriba del valor lmite, afectando directamente la
cuantificacin de DNA de la muestra.

La tabla anterior ilustra que en ambas muestras se obtuvo una
concentracin de DNA, sin embargo no es suficiente informacin para
determinar si se obtuvieron cadenas de DNA en concreto ni su tamao.

La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo normalizado que se
utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de
una tcnica sencilla y rpida que permite diferenciar fragmentos de ADN,
el cual puede localizarse en el gel tiendo con una concentracin baja de
bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se
utiliza como colorante. (Sambrook, 1989). En la figura X se muestran los
pozos de la cmara de electroforesis conteniendo la muestra de DNA
cuantificar teida con el bromuro de etidio, observndose un color azul
marino.


(aqui le ponen la foto donde se ven los pozos azules porfa porque yo
no puedo pegarsela)


Los geles de agarosa permiten una electroforesis rpida, pero con una
resolucin limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles
tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece a los poros y
no puede controlarse (Querci,2010) lo cual puede ser una posible
explicacin del porqu las muestras al ser corridas en el gel, presentan la
apariencia difusa, evidenciada en la figura X2.


(aqui le ponen la foto de las bandas pegadas porfa, esa creo que la
tiene el joto de pedro, pero aun no me la pasa, si alguien mas la tiene
se la pone xfa)

Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso
electrofortico se disipa en forma de calor, pueden producirse efectos
perjudiciales como el aumento de la tasa de difusin de los iones de la
muestra y del tampn con el consiguiente ensanchamiento de las muestras
separadas, formacin de corrientes de conveccin, con la consiguiente
mezcla de las muestras separadas e inestabilidad trmica de las
muestras, que son bastante sensibles al calor (por ejemplo,
desnaturalizacin del ADN) (Querci, 2010).

Alguno de los factores antes mencionados o la combinacin de stos,
pudieron ser los causantes de que las bandas presentes en la corrida en
gel de agarosa no se observan satisfactoriamente, ya que solo se pueden
apreciar detalladamente las bandas correspondientes a los marcadores de
peso molecular (carriles 1 y 11) en contraste con los dems carriles
correspondientes a las muestras de E. coli donde no se pueden apreciar
las bandas con claridad.



La figura X23 muestra los tamaos correspondientes a cada una de las
bandas correspondientes al marcador empleado en la prctica
(Hyperladder 1kB,Bioline), con ayuda del marcador podemos determinar el
tamao de las bandas obtenidas durante la experimentacion,sin embargo
en nuestro caso los resultados no son claros en el gel, como se expres
anteriormente.
Figura X23
(http://www.bioline.com/hyperladder-1kb-formerly-hyperladder-i.html)










































Conclusiones
Mediante tcnicas microbiolgicas se logr la extraccin de ADN plasmdico de la
bacteria Escherichia coli, el cual fue cuantificado por los mtodos de electroforesis en
gel de agarosa y por espectrofotometra efectuada por el Nanodrop. (Checar, Erick)

En cuanto a los resultados obtenidos, es importante puntualizar que mediante el
mtodo de espectrofotometra efectuada por Nanodrop, se comprob que aunque se
pudo extraer de manera adecuada ADN de E.coli, el proceso de purificacin no fue el
ptimo, debido a que las dos muestra, sugieren contaminacin por protenas debido a
que no se alcanz una relacin 260/280>1.75, por lo que para obtener cidos
nucleicos ms puros se sugiere realizar una serie adicional de purificaciones con fenol.
(Koort, 2002)

La forma en la que se presentaron las bandas en la electroforesis en gel de agarosa
sugieren degradacin del DNA, causado posiblemente por una contaminacin de
nucleasas debido a una purificacin ineficiente, muestras de DNA antiguas,
congelamiento y descongelamiento repetido de las muestras ,o bien las muestra se
sometieron a calor o friccin causado por la sonicacin durante el proceso de
extraccin. (Koort, 2002)









CUESTIONARIO
1. Qu modificacin realizara para obtener ADN de bajo peso molecular?
por qu?
Se puede modificar el tiempo de centrifugacin para obtener as un menor
tiempo de replicacin y por lo tanto cadenas ms cortas de ADN. el
modificar el pH puede tambin dar como resultado segmentos de ADN con
bajo peso molecular. (falta poner la referencia)

2. En qu otro lquido se puede resuspender el ADN al final del
Protocolo?
Agua de grado molecular, debido a que no contiene RNA proteasas,
DNAasas ni iones que interfieren en la obtencin de fragmentos de DNA.



3. Menciona que modificacin realizara para obtener ADN de:
a) Plantas
Debido a que las plantas presentan una pared celular rgida, se puede usar
nitrgeno lquido, ya que este rompe los tejidos ms resistentes. Sin
embargo, como el tejido en ocasiones es grueso y duro, es necesario
aplicar una fuerza adicional, esto es, triturar o moler el tejido.
Las plantas tienen diversas sustancias como carbohidratos, fenoles, etc.
Estos son los contaminantes del DNA extrado que se deben eliminar, para
ello se puede usar el cetyl-trimetil-bromuro de amonio, que tiene la
capacidad de formar un complejo insoluble con los cidos nucleicos,
dejando los contaminantes en el sobrenadante que fcilmente es
desechado.
Las centrifugaciones y suspensiones en diversos alcoholes son
determinados en la experimentacin, slo cambian las condiciones, pero el
fundamento es el mismo.( Neal, JR., 1997)

b) Bacterias Gram positivas
No se aplican procesos mecnicos de lisis porque el ADN resulta daado,
la proteinasa K es efectiva en bacterias Gram negativas, mas no as en
bacterias Gram positivas. Debido a las consideraciones anteriores, uno de
los procesos que resultaron exitosos, consiste en aplicar choque trmico
de 195C-100C y SDS a una C de 3%. Las bacterias son centrifugadas, y
los sedimentos son lavados con TE y resuspendidas tambin en TE, el
SDS se aade y se deja reposar.
Pasar a un horno de microondas, disolver en TE.
El DNA es extrado con un mtodo alcalino, en donde se aade una
mezcla bsica para desnaturalizar el DNA y la posterior neutralizacin con
acetato sdico. El proceso descrito anteriormente es el que mejor se ajust
a este tipo de bacterias, y como puede observarse, es ms riguroso que en
el caso de bacterias Gram negativas, que llevan un proceso suave de
extraccin de DNA.

Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3 ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344
pgs.
vila, A. F. (2008). Ecologa molecular. Mxico, D.F.: Instituto
Nacional de Ecologa, SEMARNAT.
Querci, M. (2010). Anlisis de la Presencia de Organismos
Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos.
Organizacin Mundial de la Salud. Oficina Regional para Europa.