Consiste en la localizacin de una clula o enzima en una regin definida de
espacio, manteniendo al mismo tiempo una actividad cataltica deseada. Adems, en el caso concreto de las clulas, esto involucra a su viabilidad. Uno de los principales principios de cualquier sistema con biocatalizadores inmovilizados data en el transporte de substratos y productos producidos por mecanismos difusionales. Los principales mtodos de inmovilizacin de biocatalizadores, en funcin del mecanismo en que se basan, se pueden dividir en: Mtodo por Adsorcin Mtodo de Enlace Covalente Mtodo por Enlaces Cruzados y Autoinmovilizacin Mtodo de Sistemas con Membranas
Inmovilizacin por adsorcin Se produce por interaccin de tipo inico o fuerza de atraccin dbiles tales como puentes de hidrgeno o fuerzas de van der Waals, sobre la superficie de un soporte. Consiste en poner en contacto una solucin acuosa de enzimas o una suspensin de microorganismo con un adsorbente activo, y despus de un tiempo, una vez efectuada la adsorcin, lavar el complejo formado para eliminar cualquier cantidad de biocatalizador que no se haya inmovilizado. En general es un tipo de inmovilizacin muy suave que no suele afectar la actividad de las enzimas ni la viabilidad de las clulas. El problema ms importante que presenta es su reversibilidad, dado se puede provocar la desadsorcin del soporte debido a cambios en el pH la fuerza inica o incluso la temperatura.
Los principales factores que influyen en la adsorcin, son:
El pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la protena y del slido; La fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte que la protena; El dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor de la enzima; La presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementarla carga enzimtica del derivado.
Como principales ventajas de este mtodo destacan:
Preparacin sencilla, Su bajo coste, No hay cambios de especificidad enzimtica, Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua.
Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente:
La optimizacin de las variables que controlan la adsorcin, Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecnico, La unin al soporte es dbil.
Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear resinas de intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.
Inmovilizacin por enlace covalente
Este mtodo se aplica a la inmovilizacin de enzimas preferentemente, debido a que en el caso de clulas los reactivos que se utilizan y las condiciones de reaccin suelen afectar negativamente su actividad y viabilidad. Se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico.
Cabe mencionar que los soportes utilizados son tanto de origen natural (celulosa agarosa, dextrano, etc.), como sinttico (derivados de la poliacrilamida, poliestireno, copolmeros de anhdrido maleico, etc.). Tambin se utilizan materiales cermicos y vidrio. Por lo general la mayora de los mtodos suelen incluir una etapa inicial de modificacin de la superficie, o activacin del soporte. Es importante considerar en este mtodo de inmovilizacin la interaccin entre la superficie del soporte y la mezcla reaccionante, la cual puede hacer que las propiedades del fluido situado en el entorno de las partculas slidas de soporte, difieran de las de la masa del fluido en el medio de la reaccin. Lo anterior puede ocasionar un desplazamiento en la curva que relaciona el PH del medio de reaccin y la actividad de una enzima en funcin de la naturaleza de la carga del soporte. Este mtodo presenta las siguientes ventajas:
La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla; La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin; Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado tanque agitado. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.
En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de Inconvenientes:
Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.
El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.
La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc.
Inmovilizacin por Enlaces Cruzados y Autoinmovilizacin Se caracteriza por la generacin de partculas slidas provenientes del biocatalizador sin la presencia de un soporte de por medio, sino gracias a la interaccin directa entre enzimas o clulas. En el caso de la formacin de enlaces cruzados, la agregacin de distintas molculas de enzimas o clulas, se logra mediante un agente bifuncional de bajo peso molecular, que se enlaza covalentemente a los grupos funcionales de las enzimas o de las paredes de las clulas. Tal es el caso del glutaraldehdo En cuanto a la autoinmovilizacin, esta se lleva a cabo en todos aquellos casos en que las clulas empleadas en un determinado proceso tienen la capacidad de formar agregados macroscpicos, denominados flculos o pellets, con lo que no se requiera la adicin de ningn reactivo ni soporte para soportar la inmovilizacin.
Inmovilizacin con Sistemas de Membranas Consiste en la retencin del biocatalizador en un espacio limitado por una membrana semipermeable. Mediante una formulacin correcta de las mismas es posible controlar el tamao de sus poros y por tanto el transporte de unas molculas determinadas en funcin de su peso molecular. El tamao de poro controlado de las fibras permite el paso de nutrientes y productos a travs de las mismas, intentando mimetizar la situacin en la que se encuentran las clulas en los tejidos animales.
Poder cataltico Es difcil comparar la rapidez de reaccin de las reacciones catalizadas por enzimas con la rapidez de reaccin que ocurre en ausencia de las enzimas bajo condiciones similares de temperatura, pH, etc. Esto se debe principalmente a las dificultades para medir las rapideces demasiado bajas de las reacciones no catalizadas por enzimas. Koshland (1956) inform que las rapideces de ciertas reacciones eran mucho ms altas en presencia de enzimas que en ausencia de estas. As, la hexocinasa, fosforilasa, deshidrogenasa alcohlica y la creatinina cinasa incrementaban las rapideces de reaccin en >1010, >3 x 1011, >2 x 108, y >104, respectivamente. Otra caracterstica importante de las enzimas es su capacidad para funcionar como catalizadores en un intervalo moderado de temperatura (~ 300 K), pH (2-10) y presin (~ 1 atm). Un ejemplo es la fijacin de nitrgeno catalizada por el complejo de la enzima nitrogenasa, la cual se realiza ptimamente a 300 K, pH neutro y presin atmosfrica. En contraste, la sntesis industrial de amoniaco a partir de nitrgeno requiere una tempe-ratura de 700-900 K, presiones de 100-900 atm y la presencia de fierro como catalizador. Alto poder cataltico; se logra un aumento de hasta 10 9 a 10 12 en la rapidez sobre la actividad no enzimtica.
Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte. Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar: 1.- El aumento de la estabilidad de la enzima; 2.- La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso. 3.- La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada. Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son: 1.- La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo. 2.- La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte. 3.- Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la movilizacin 4.- El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa. En general, los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos grandes categoras: 1) Retencin fsica y 2) Unin qumica.
Atrapamiento Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmerosfotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.
Unin a soportes Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ampli el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contamina-ciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos: Soportes inorgnicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.) Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en: Polmeros naturales: a su vez divididos en: Polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc). Protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc). Polmeros sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol polivinlico, poliamidas, etc).
Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en: 1.- Aplicaciones analticas: biosensores 2.- Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas 3.- Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentaria y de tratamiento de residuos.
Biosensores Los biosensores se estn convirtiendo en una herramien-ta imprescindible en medicina, en el control de calidad de los alimentos y en el control medioambiental. En principio, se puede disear un biosensor para cualquier tipo de compuesto que sea capaz de interaccionar especficamente con un sis-tema biolgico. Generalmente, el biosensor (Figura 5) contie-ne una molcula biolgica inmovilizada (enzimas, clulas, anticuerpos) prxima a un traductor que, en contacto con el analito, transformar la seal qumica producida en una seal elctrica o de otro tipo (ptica, calorimtrica, acstica, etc.). El empleo de los biosensores presenta las siguientes ventajas 1. la instrumentacin requerida es barata y sencilla, 2. el anlisis es muy sensible, 3. permite el uso de muestras con color o turbias que no se podran medir con mtodos espectroscpicos.
Aplicaciones mdicas Existen muchas enfermedades causadas por una alteracin o carencia de una determinada enzima. Tambin hay enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones teraputicas. El tratamiento con estas enzimas inmovilizadas permitira una accin ms prolongada, ya que seran ms resistentes a la accin de las proteasas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y cnceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. En la actualidad se ha diseado un hemodializador de fibra hueca que contiene asparaginasa inmovilizada. La tripsina o la colagenasa se utilizan para eliminar los tejidos muertos de heridas, quemaduras, lceras, etc.; para acelerar el crecimiento de nuevos tejidos e injertos de piel, y tambin para inhibir el crecimiento de algunos microorganismos contaminantes. Este tipo de enzimas se pueden inmovilizar en celulosas o fibras que formarn parte del tejido de apsitos y vendas.
Aplicaciones en la Industria Farmacutica La Industria Farmacutica trabaja con molculas lbiles, y en muchos casos con molculas quirales. El empleo de enzimas inmovilizadas es una alternativa seria a la sntesis qumica en pasos clave, donde no conviene trabajar a temperaturas altas o se requiere una elevada especificidad de sustrato. Los enzimas son unos reactivos quirales estrictos, es decir, biocatalizadores con una estructura tridimensional asimtrica definida que permiten la obtencin de productos de gran pureza ptica. Se trata de una ventaja fundamental cuando las reglamentaciones exigen la sntesis de compuestos pticamente puros, ya sean frmacos, hormonas o antibiticos.