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La inmovilizacin de un biocatalizador

Consiste en la localizacin de una clula o enzima en una regin definida de


espacio, manteniendo al mismo tiempo una actividad cataltica deseada. Adems,
en el caso concreto de las clulas, esto involucra a su viabilidad.
Uno de los principales principios de cualquier sistema con biocatalizadores
inmovilizados data en el transporte de substratos y productos producidos por
mecanismos difusionales.
Los principales mtodos de inmovilizacin de biocatalizadores, en funcin del
mecanismo en que se basan, se pueden dividir en:
Mtodo por Adsorcin
Mtodo de Enlace Covalente
Mtodo por Enlaces Cruzados y Autoinmovilizacin
Mtodo de Sistemas con Membranas

Inmovilizacin por adsorcin
Se produce por interaccin de tipo inico o fuerza de atraccin dbiles tales
como puentes de hidrgeno o fuerzas de van der Waals, sobre la superficie de un
soporte.
Consiste en poner en contacto una solucin acuosa de enzimas o una suspensin
de microorganismo con un adsorbente activo, y despus de un tiempo, una vez
efectuada la adsorcin, lavar el complejo formado para eliminar cualquier cantidad
de biocatalizador que no se haya inmovilizado.
En general es un tipo de inmovilizacin muy suave que no suele afectar la
actividad de las enzimas ni la viabilidad de las clulas. El problema ms
importante que presenta es su reversibilidad, dado se puede provocar la
desadsorcin del soporte debido a cambios en el pH la fuerza inica o incluso la
temperatura.





Los principales factores que influyen en la adsorcin, son:

El pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas que
presenta la superficie de la protena y del slido;
La fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin de la
enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte
que la protena;
El dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamao del
eje mayor de la enzima;
La presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya que
pueden incrementarla carga enzimtica del derivado.

Como principales ventajas de este mtodo destacan:

Preparacin sencilla,
Su bajo coste,
No hay cambios de especificidad enzimtica,
Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en
agua.

Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente:

La optimizacin de las variables que controlan la adsorcin,
Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista
mecnico,
La unin al soporte es dbil.

Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear resinas de
intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones mviles.
Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la
misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.

Inmovilizacin por enlace covalente

Este mtodo se aplica a la inmovilizacin de enzimas preferentemente, debido a
que en el caso de clulas los reactivos que se utilizan y las condiciones de
reaccin suelen afectar negativamente su actividad y viabilidad.
Se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con
nuclefilos de las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se
encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin
de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la
histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido
asprtico y glutmico.

Cabe mencionar que los soportes utilizados son tanto de origen natural (celulosa
agarosa, dextrano, etc.), como sinttico (derivados de
la poliacrilamida, poliestireno, copolmeros de anhdrido maleico, etc.). Tambin se
utilizan materiales cermicos y vidrio. Por lo general la mayora de los mtodos
suelen incluir una etapa inicial de modificacin de la superficie, o activacin del
soporte.
Es importante considerar en este mtodo de inmovilizacin la interaccin entre la
superficie del soporte y la mezcla reaccionante, la cual puede hacer que las
propiedades del fluido situado en el entorno de las partculas slidas de soporte,
difieran de las de la masa del fluido en el medio de la reaccin. Lo anterior puede
ocasionar un desplazamiento en la curva que relaciona el PH del medio de
reaccin y la actividad de una enzima en funcin de la naturaleza de la carga del
soporte.
Este mtodo presenta las siguientes ventajas:

La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla;
La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin;
Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados,
de lecho fluidizado tanque agitado.
Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de
los disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura
terciaria.


En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de
Inconvenientes:

Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de
superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su
geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.

El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo.
Para evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia
de un inhibidor que bloquee el centro activo.

La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy
sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc.




Inmovilizacin por Enlaces Cruzados y Autoinmovilizacin
Se caracteriza por la generacin de partculas slidas provenientes del
biocatalizador sin la presencia de un soporte de por medio, sino gracias a la
interaccin directa entre enzimas o clulas.
En el caso de la formacin de enlaces cruzados, la agregacin de distintas
molculas de enzimas o clulas, se logra mediante un agente bifuncional de
bajo peso molecular, que se enlaza covalentemente a los grupos funcionales de
las enzimas o de las paredes de las clulas. Tal es el caso del glutaraldehdo
En cuanto a la autoinmovilizacin, esta se lleva a cabo en todos aquellos casos en
que las clulas empleadas en un determinado proceso tienen la capacidad de
formar agregados macroscpicos, denominados flculos o pellets, con lo que no
se requiera la adicin de ningn reactivo ni soporte para soportar la inmovilizacin.

Inmovilizacin con Sistemas de Membranas
Consiste en la retencin del biocatalizador en un espacio limitado por
una membrana semipermeable. Mediante una formulacin correcta de las mismas
es posible controlar el tamao de sus poros y por tanto el transporte de unas
molculas determinadas en funcin de su peso molecular.
El tamao de poro controlado de las fibras permite el paso de nutrientes y
productos a travs de las mismas, intentando mimetizar la situacin en la que se
encuentran las clulas en los tejidos animales.

Poder cataltico
Es difcil comparar la rapidez de reaccin de las reacciones catalizadas por
enzimas con la rapidez de reaccin que ocurre en ausencia de las enzimas bajo
condiciones similares de temperatura, pH, etc. Esto se debe principalmente a las
dificultades para medir las rapideces demasiado bajas de las reacciones no
catalizadas por enzimas.
Koshland (1956) inform que las rapideces de ciertas reacciones eran mucho ms
altas en presencia de enzimas que en ausencia de estas. As, la hexocinasa,
fosforilasa, deshidrogenasa alcohlica y la creatinina cinasa incrementaban las
rapideces de reaccin en >1010, >3 x 1011, >2 x 108, y >104, respectivamente.
Otra caracterstica importante de las enzimas es su capacidad para funcionar
como catalizadores en un intervalo moderado de temperatura (~ 300 K), pH (2-10)
y presin (~ 1 atm).
Un ejemplo es la fijacin de nitrgeno catalizada por el complejo de la enzima
nitrogenasa, la cual se realiza ptimamente a 300 K, pH neutro y presin
atmosfrica. En contraste, la sntesis industrial de amoniaco a partir de nitrgeno
requiere una tempe-ratura de 700-900 K, presiones de 100-900 atm y la presencia
de fierro como catalizador.
Alto poder cataltico; se logra un aumento de hasta 10
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a 10
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en la rapidez sobre
la actividad no enzimtica.

Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas
La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la
enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que
retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente.
Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se
restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de
enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte.
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:
1.- El aumento de la estabilidad de la enzima;
2.- La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del
proceso.
3.- La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control,
adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son:
1.- La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo.
2.- La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir
distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de
uniones al soporte.
3.- Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la
movilizacin
4.- El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.
En general, los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos grandes
categoras: 1) Retencin fsica y 2) Unin qumica.



Atrapamiento
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una
matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmerosfotoentrucruzables
o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de
poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin
de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la
polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo
qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms
resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el
interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida
dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, de gran
sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima
para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre
ninguna alteracin en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un
control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin
de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la
protena.

Unin a soportes
Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una
mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan
determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar
que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin,
ampli el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contamina-ciones
microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las
condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido
para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales
como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos materiales
difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los
encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de
esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
Soportes inorgnicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de
soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez,
slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio de tamao de
poro controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.)
Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en:
Polmeros naturales: a su vez divididos en:
Polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina,
chitosan, etc).
Protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc). Polmeros sintticos: divididos en:
Poliolefinas (como el poliestireno)
Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos
(alcohol polivinlico, poliamidas, etc).

Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas
Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden
clasificar en:
1.- Aplicaciones analticas: biosensores
2.- Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
3.- Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentaria y
de tratamiento de residuos.

Biosensores
Los biosensores se estn convirtiendo en una herramien-ta imprescindible en
medicina, en el control de calidad de los alimentos y en el control medioambiental.
En principio, se puede disear un biosensor para cualquier tipo de compuesto que
sea capaz de interaccionar especficamente con un sis-tema biolgico.
Generalmente, el biosensor (Figura 5) contie-ne una molcula biolgica
inmovilizada (enzimas, clulas, anticuerpos) prxima a un traductor que, en
contacto con el analito, transformar la seal qumica producida en una seal
elctrica o de otro tipo (ptica, calorimtrica, acstica, etc.).
El empleo de los biosensores presenta las siguientes ventajas
1. la instrumentacin requerida es barata y sencilla,
2. el anlisis es muy sensible,
3. permite el uso de muestras con color o turbias que no se podran medir con
mtodos espectroscpicos.

Aplicaciones mdicas
Existen muchas enfermedades causadas por una alteracin o carencia de una
determinada enzima. Tambin hay enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante
y con otras acciones teraputicas. El tratamiento con estas enzimas inmovilizadas
permitira una accin ms prolongada, ya que seran ms resistentes a la accin
de las proteasas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de
leucemias y cnceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse.
En la actualidad se ha diseado un hemodializador de fibra hueca que contiene
asparaginasa inmovilizada. La tripsina o la colagenasa se utilizan para eliminar los
tejidos muertos de heridas, quemaduras, lceras, etc.; para acelerar el crecimiento
de nuevos tejidos e injertos de piel, y tambin para inhibir el crecimiento de
algunos microorganismos contaminantes. Este tipo de enzimas se pueden
inmovilizar en celulosas o fibras que formarn parte del tejido de apsitos y
vendas.

Aplicaciones en la Industria Farmacutica
La Industria Farmacutica trabaja con molculas lbiles, y en muchos casos con
molculas quirales. El empleo de enzimas inmovilizadas es una alternativa seria a
la sntesis qumica en pasos clave, donde no conviene trabajar a temperaturas
altas o se requiere una elevada especificidad de sustrato. Los enzimas son unos
reactivos quirales estrictos, es decir, biocatalizadores con una estructura
tridimensional asimtrica definida que permiten la obtencin de productos de gran
pureza ptica. Se trata de una ventaja fundamental cuando las reglamentaciones
exigen la sntesis de compuestos pticamente puros, ya sean frmacos, hormonas
o antibiticos.

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