INVESTIGACIN

Acceso Abierto
La progesterona en la leche inmunoenzimtica se ensaya como una herramienta para investigar la
ciclicidad ovrica en bfalos de agua en relacin a la calificacin de la condicin corporal y la produccin
de leche
Abstracto
Antecedentes: La aplicacin de tecnologas de reproduccin asistida en bfalos se limita en cierta medida
por la incapacidad de los agricultores para detectar el celo debido a su pobre expresin. l estudio tuvo
como ob!etivo investigar la fiabilidad de un ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas de
progesterona en leche "L#$A% para evaluar la ciclicidad ovrica durante el post&parto' celo y cra post&
perodos en los bfalos de agua.
()todos: Las concentraciones de progesterona se midieron por L#$A en leche de *+ bfalos reci)n
paridos en relacin al celo' el embarazo' la puntuacin de la condicin corporal ",-$% y la produccin de
leche. .os muestras de leche fueron tomadas a intervalos de /0 das de cada mes a partir del da +0 y
continu hasta /10 das despu)s del parto. La ,-$ y la produccin de leche fueron registradas durante la
recogida de la muestra. Las muestras de leche de bfalas criadas se recogieron en el da 0 "da de la cra%'
das /0&/* y das **&*2. Leche desgrasada se conserv a &30 4 - hasta su anlisis. l embarazo fue
confirmado por palpacin por el recto en los das 50&60.
7esultados: .iecisiete bfalos tuvieron 25 ciclos ovulatorios' de uno a cuatro en cada uno' /+ fueron
detectadas en celo una vez "*38 tasa de deteccin del celo%. -oncentracin de 9rogesterona : / ng ; ml en
una de las dos muestras de leche en intervalos de /0 das refle!an la ovulacin y la formacin del cuerpo
lteo. Los intervalos entre el parto hasta la primer actividad luteal y al primer celo detectado vari desde
2/ hasta /*+ das "n < /5% y 3+ a /+1 das "n < /+%' respectivamente. =cho eran los bfalos criados en el
curso del estudio' y siete se encontraron embarazados. stos bfalos tenan un perfil ba!o de progesterona
">/ ng ; ml%' alto ": / ng ; ml% y alto ": / ng ; ml% en el .a 0' das /0&/* y das **&*2' respectivamente.
l ciclismo de los bfalos ms adelante en el perodo post&parto haban perdido el celo menos (P >0'01%.
,falos con un ,-$ superior tuvieron un corto intervalo entre parto&celo y produ!eron ms leche (P
>0'01%.
-onclusiones: L#$A con progesterona de leche es una herramienta fiable para el seguimiento de la
ciclicidad ovrica y un buen ,-$ puede indicar la reanudacin de la ciclicidad en bfalos de agua.
9alabras clave: Leche' progesterona' L#$A' ciclicidad' condicin corporal' ,falo
stro< -elo
?ondo
l mane!o reproductivo de los bfalos es una de las principales preocupaciones debido a las dificultades
en la deteccin del celo y es asociado con importantes p)rdidas econmicas. $hah et al.@/A reportaron una
incidencia de B&5+8 de celos silenciosos o sub celo en los bfalos. sto garantiza el desarrollo y la
aplicacin de tecnologas para identificar celo silencioso en bfalos. Cambi)n es importante para los
agricultores para comprender la importancia de la puntuacin de la condicin corporal ",-$% y su
asociacin con la ciclicidad ovrica y pedir servicios veterinarios cuando los bfalos no presentan
comportamiento de celo.
La concentracin de progesterona en la leche es un buen predictor de determinar el estado funcional del
cuerpo lteo y actividad ovrica en los rumiantes dom)sticos @*A. 9resicce et al. @+A utilizaron una
medicin de la concentracin de progesterona plasmtica !unto con la ecografa para controlar dinmica
folicular ovrica en bfalos mediterrneos italianos y en un estudio reciente utilizaron la medicin de la
concentracin plasmtica de progesterona !unto con la palpacin rectal' 108 de bfalos sospechosos de
anestro Due tenan en realidad sub estro @2A. La leche se prefiere sobre plasma para la determinacin de
concentracin de progesterona en condiciones de campo' porDue la leche es fcil de recoger y en ltima
instancia asegurar el cumplimiento de los agricultores. (uchos de los estudios anteriores midieron la
progesterona en la leche mediante radio inmunoensayo o inmunoensayo enzimtico. 9ero el uso de un
ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas de progesterona en leche "L#$A% con una programa
apropiado de muestreo y su aplicacin en el campo para supervisar el estado cclico de los ovario en los
bfalos an no se ha dilucidado. l monitoreo de concentracin de progesterona en la leche proporciona
informacin prctica para me!orar la reproduccin y para detectar trastornos reproductivos asociados con
disfuncin ovrica @1'BA. La palpacin rectal se puede utilizar para detectar algunos trastornos ovricos en
bfalos pero los resultados no siempre se correlacionan con la actividad ovrica @5AE las conclusiones es
Due puedan deberse a cuerpos lteos Due estn incrustados en el estroma ovrico particularmente durante
el perodo posparto temprano en vacas bfalo @3A. La ecografa podra ser una opcin para resolver este
problema' pero su uso en peDueFas explotaciones agrcolas est limitado por el coste. 9or lo tanto' la
L#$A en progesterona de leche con un muestreo adecuado sigue siendo una de las herramientas ms
pertinentes de evaluacin del estado cclico de los ovarios en los bfalos en condiciones de campo.
la ,-$ es un indicador til del estado nutricional y la buena ,-$ refle!a un balance energ)tico positivo
Due conduce a la anterior reanudacin de la ciclicidad ovrica posparto en vacas @6'/0A.9or lo tanto' es
importante investigar la relacin de la ,-$ con el reinicio de la ciclicidad ovrica y la produccin de
leche en bfalas lecheras en ,angladesh. sto ayudara a educar a los agricultores en la prediccin de la
ciclicidad ovrica y la planificacin de la cra de bfalos post&parto.
l presente estudio tuvo como ob!etivo investigar el ciclicidad ovrica con la L#$A de progesterona en
leche en bfalos de agua durante los perodos de post&parto' celo y apareamiento posteriores y para
relacionar los niveles de progesterona con la ,-$' la produccin de leche y diagnstico de preFez por
palpacin por el recto.
()todos
Geintitr)s bfalos provenientes de *+ fincas ubicadas en seis pueblos del distrito de (ymensingh'
,angladesh fueron seleccionados. l estudio se llev a cabo durante el perodo de !unio *00B a marzo de
*005. -ada familia posea una o * bfalas del tipo de ro autctono. l rango de edad fue 2 a /1 aFos y de
paridad vari entre 0 y 5. Los bfalos fueron alimentados con pa!a de arroz' c)sped cortado y acarreado y
0'1 a /'1 Hg de molienda de subproductos como concentrado "arroz pulido y ; o acopio torta de aceite% con
limitado pastoreo en carretera y tierras comunitarias. Los bfalos fueron seleccionados en base a la
alimentacin similar y patrn de gestin. Los animales se controlaron regularmente para asegurar Due no
estaban estresadas limitando as la variacin de circulacin de los niveles hormonales @//A.
9untuacin de la condicin corporal
Los bfalos se registraron dos meses antes del parto y la edad' la raza' la paridad y la informacin de
gestin de la alimentacin se registr. La condicin corporal de los bfalos se anot mediante el uso de
una escala de /&1 "/ < delgadas y obesas 1 <% @/*'/+A. Las fotografas fueron tomadas desde el punto de
vista lateral y parte trasera de cada bfalo' para determinar retrospectivamente el ,-$. In eDuipo de
cuatro miembros evalu las fotografas y anotaron la ,-$. Las ,-$s se anotaron a los ocho meses de
gestacin' en el parto y en el momento de cada recoleccin de muestras de leche.
La leche recogida de muestra y conservacin
Las muestras de leche fueron recolectadas directamente de las ubres de cada bfalo en medio del ordeFo
de la maFana en un tubo de plstico con tapn de rosca Due contena *&bromo&*&nitro&/' +&propanodiol
",ronopol 3 mg ml tableta ; 20 de leche' . J ? -ontrol $ystems #nc. .ublin' -A' .II.%. l muestreo
de leche se inici +0 das despu)s del parto y dos muestras a intervalos de /0 das se recogieron por mes
hasta /10 das despu)s del parto si el estro no fue detectado. A los agricultores se les pregunt si vean
signos de estro es decir. #nDuietud' bramando' hinchazn vulvar' secrecin mucosa' miccin frecuente de
peDueFas cantidades de orina. n cada gran!a de visita para el muestreo de leche' la produccin de leche y
signos de estro anteriores' es decir' el flu!o vaginal seco o fresco adherido al perineo o de la cola' se
registraron. Ina vez detectado en calor' los animales fueron criados por apareamiento natural. A partir de
entonces tres muestras adicionales de leche fueron recogidas. La primera fue en el da 0 "da de la
reproduccin% mientras Due las muestras segunda y tercera se recogieron en los das /0&/* y **&*2'
respectivamente. Las muestras de leche entera se almacenaron a 2 4 - durante un mximo de dos das. Las
muestras se desgrasaron por centrifugacin a /100 g durante +0 min a 2 4 -' las porciones de leche sin
grasa se recogieron y se conservaron a &30 4 - hasta Due se analizaron por L#$A.
9reparacin de las normas de progesterona para L#$A
.os litros de leche fresca de vaca del bfalo en celo fueron recogidos y desgrasados. l carbn activado
"$igma Aldrich' $t. Louis' (=' .II.% fue aFadido "0'*18 K ; v% y la leche se agit una hora a
temperatura ambiente "Alrededor de ** 4 -% y luego se conserv durante la noche a 2 4 -. La leche con
carbn se centrifug durante /1 min a /100 g a 2 4 -' se recogi el sobrenadante y el residuo de carbn se
filtr con papel de filtro. La centrifugacin repetida y la filtracin se realizan para eliminar carbn vegetal
completamente. ntonces se aFade ,ronopol como conservante "3 mg;20 ml de leche%. Las soluciones
estndar de leche desgrasada Due contiene /00' /0' 1' *'1' /'*1' 0'B+' 0'+/ y 0'/B ng ; ml de progesterona
se prepararon utilizando progesterona comercialmente disponible "-albiochem' ,iociencias #nc. -A'
.II.%. ste procedimiento se realiz inmediatamente antes de la adicin de las muestras y estndares
en la placa de microtitulacin.
L#$A de progesterona en leche
La concentracin de progesterona en la leche se determin a trav)s de un L#$A competitivo siguiendo el
protocolo propuesto por 7asmussen et al. @/2A con modificaciones menores. ,revemente' una 9laca de 6B
pocillos "Lunc #mmuno 9late' 7osHilde' .inamarca% se recubri y se incub durante la noche a 2 4 - con
/00 Ml de un * Ml;ml anticuerpo secundario "anticuerpos de cabra anti&ratn' -albiochem% en tampn de
revestimiento "0'01 ( tampn de carbonato&bicarbonato' pN 6'B%. A continuacin' la placa se lav cuatro
veces con tampn de lavado "0'02 ( + & @L&morfolinoA propanosulfnico cido con 0'018 de CKeen*0
"polisorbato *0%' pN 5'*%. -ien Ml de solucin de anticuerpo monoclonal anti&progesterona "/:20'000
dilucin' =#A' Giena' Austria% en tampn de ensayo "0'02 ( + & @L&morfolinoA propanosulfnico' 0'/*
( cloruro de sodio' 0'0/ ( .CA' 0'018 de CKeen*0' 0'0018 digluconato chlorohexidinedigluconate' y
0'/8 de gelatinaE pN 5'2% se aFadi a cada pocillo de la placa' excepto pozos inespecficos de unin y se
incubaron con agitacin durante /'1 h a temperatura ambiente. 9osteriormente' la placa se lav cuatro
veces con tampn de lavado' y /00 Ml de muestras de control de calidad estndares "1 progesterona ng ; ml
de leche desnatada y tratada con leche con carbn vegetal% y a las muestras de leche a ensayar se
aFadieron a la placa y se incubaron con agitacin durante /'1 h a temperatura ambiente. -incuenta Ml de
peroxidasa de rbano picante "N79% con!ugado "/:*000 en tampn de ensayoE progesterona&+& N79
produce a partir de la progesterona&+&-(=' $teraloids #nc.' LeKport' 7hode #sland' .II.% se aFadi.
La placa se agit de nuevo durante /'1 h y se lav con tampn de lavado cuatro veces. 7eci)n preparados
/*1 Ml de +' + O' 1' 1O& se aFadi sustrato de tetrametilbencidina y se agit durante /1 min a +5 4 - en la
oscuridad para cuantificar la actividad de N79. La reaccin se detuvo mediante la adicin de 10 Ml
solucin de interrupcin "0'1 ( de cido sulfrico% y ledo por un lector de microplacas automtico
"espectrofotmetro de microplacas' .ispositivo (olecular' $unnyvale' -A' .II.% en a!uste
predefinido "longitud de onda primaria 210 nm' referencia longitud de onda de B00 nm' punto final%. La
densidad ptica "=.% valores Due fueron analizados por una ho!a de ($ xcel *00* pre&elaborada para
determinar la concentracin de progesterona @/1A. l intra&ensayo coeficiente de variaciones oscilaban
desde *'*8 a 6'18 "2 pozos% y el coeficiente de variacin entre ensayos de fue del 6'58 "1 ensayos%.
diagnstico de gestacin
Los rganos genitales de los bfalos fueron examinados por el recto para diagnstico de preFez entre el
da 50 y el da 60 despu)s del apareamiento natural.

l anlisis estadstico
Los datos sobre la concentracin de progesterona en leche' la produccin de leche la ,-$ y en contra de
meses y das de muestreo se presentaron grficamente mediante el uso de (icrosoft xcel. Los grficos se
prepararon con los datos de progesterona en leche concentracin' la produccin de leche y la ,-$ contra
mes y das de muestreo. Ina concentracin de progesterona de : /'0 ng ; ml de leche desnatada se refiere
como una progesterona aumento' debido a un corpus funcional lteo @6'/B&/6A. -uando un aumento de
progesterona por encima de / ng ; ml fue detectada en una o ambas muestras recogidas en /0 intervalo de
das' Due era consider Due el bfalo haba ovulado desapercibido el agricultor "perdidas celo%. Ina
concentracin de progesterona de menos de /'0 ng ; ml fue considerado como un nivel ba!o' Due indiDue
la ausencia de un cuerpo funcional corpus @*0A.
La tasa de deteccin del estro ".7' por sus siglas en ingles% se calcul mediante la siguiente la ecuacin
@*/A:
Los intervalos entre el parto y los primeros estros detectados' el parto y el primer pico de progesterona
detectado "un indicador antes de la ovulacin% y el parto y la concepcin fueron calculados. Los
porcenta!es de los bfalos sin celo detectado y bfalos no cclicos durante el perodo de estudio se
calcularon. l anlisis de regresin se realiz para .eterminar la relacin de la ,-$ al momento del parto
y del celo con el parto hasta el primer intervalo del estro y con produccin de leche @**A.
7esultados
La ,-$ de bfalos estudiados vari de /'1 a +'1 en el momento de la deteccin del celo. Las figuras /A&-
muestran los datos sobre la ,-$' las concentraciones de progesterona en la leche y la produccin de leche
de tres bfalas Due son representativas de las vacas Due muestra la actividad luteal en los das +0&50' 5/&
60 y 6/&/+0 del posparto' respectivamente.
?igura /. muestra los datos tpicos para las bfalas Due Duedaron acclicas /10 das despu)s del parto.
Codos los bfalos mostraron una tendencia de ba!ar la ,-$ con la progresin del perodo post&parto. La
mayora de los bfalos redu!eron gradualmente la produccin de leche con la p)rdida de la ,-$. Ina
significativa "9 >0'00/% la relacin lineal existente entre la ,-$ despu)s del parto y la produccin de
leche "?igura *% con mayor produccin de leche se asocia con mayor ,-$.
n los bfalos' los intervalos entre partos de primera actividad luteal y primer estro detectados fueron de
2/ a /*+ "n < /5% y 3+ a /+1 "n < /+% das' respectivamente.
$uponiendo Due cada aumento de progesterona por encima de / ng ; ml en la leche seguido una ovulacin
y un ciclo normal' 25 ciclos ocurrieron en /5 bfalos. l celo fue detectado visualmente en /+ vacas
mientras Due B bfalos Duedaron acclicos /10 das despu)s del parto. sto conduce a una tasa de
deteccin del estro de un *38. Los agricultores en promedio perdieron /'3 estros por bfalo. l nmero
medio perdidas del estro en el da +0&50 despu)s del parto del bfalo "*'11% fue significativamente "9
>0'01% mayor Due los das 5/&60 "/'++% y los da 6/&/+0 "0'B1% despu)s del parto del bfalo. -uando los
agricultores perdieron ms ciclos estrales' la duracin del perodo post&parto "parto a el primer estro
detectado% aument "Cabla /%.
Los bfalos con mayor ,-$ en el momento de la deteccin del estro tenan un intervalo ms corto entre
parto y el primer estro detectado Due aDuellos con menor ,-$ "?igura +E 9 >0'01%. $in embargo' el ,-$
anotado durante el perodo de gestacin y el parto no mostraron ningn efecto significativo en los
intervalos entre el parto y el primer aumento de progesterona en la leche y entre el parto y el primer estro
detectado.
$lo 3 bfalos fueron criados durante el perodo de estudio. $iete bfalos tenan un perfil de progesterona
ba!os ">/ ng ; ml%' alto ": / ng ; ml% y alto ": / ng ; ml% en el da 0' los das /0&/* y das **&*2'
respectivamente. stos bfalos se encontraron embarazados con palpacin rectal del tracto genital entre el
da 50 y el da 60. l bfalo con perfiles de progesterona ba!os' altos y ba!os en 0 da' los das /0&/* y das
**&*2' respectivamente' volvi al estro. n bfalas embarazadas' la concentracin de progesterona en la
leche "media P $(% en los das **&*2 "2'3 P 0'2 ng ; ml% fue significativamente "9 >0'00/% mayor de Due
en los das /0 a /* "*'0 P 0'2 ng ; ml%.
.iscusin
l protocolo y el r)gimen de muestreo para la leche L#$A detect una gran proporcin "528% de los
bfalos Due reanudaron la ciclicidad ovrica en el da /10 postparto pero la tasa de deteccin de los
agricultores del estro fue ba!a ba!o el supuesto Due observaron un aumento de la progesterona en la leche
seguido de una ovulacin y un ciclo normal. de acuerdo con estos hallazgos' ,arHaKi et al. @*+A mostr
Due aproximadamente el 608 de los bfalos reanudaron su ciclo ovulatorio dentro de los B0 das despu)s
del parto. Las razones para el estro perdido podran ser debidas a la ovulacin silenciosa o a la
luteinizacin de los folculos anovulatorios durante el perodo posparto temprano @*2&*BA. $in embargo'
las diferencias entre el sistema produccin y la cria de los animales podra tener como resultado la
variacin en la actividad ovarina post partum entre los estudios publicados. Ismani et al. @*5A encontr
Due el 3B8 de los bfalos Lili&7avi mostraron al menos una breve fase ltea 3 a /+ das antes del primer
estro. 9or consiguiente' los datos del presente estudio indican un nmero ms alto de estros perdidos en
bfalos Due reanudaron la actividad luteal entre el da +0 y el da 50 Due los Due reanudaron la actividad
lteal entre el da 5/ y el da /+0. Queda por investigar Due la extensin de la primera ovulacin posparto
se asocia con signos de estro en algunos bfalos. xtensin programas de educacin de los agricultores en
el comportamiento de estro y la deteccin de calor basada en signos secundarios' por e!emplo' secrecin
vulvar e hinchazn vaginal' puede ayudar a aumentar la tasa de deteccin del estro @*3A.
In pobre ,-$ puede tener un impacto
negativo sobre la actividad ovrica en
bfalos ya Due los bfalos anoestrales
tienen menor ,-$ Due los bfalos Due
tienen ciclos estrales @2A. Luestro estudio
muestra Due la ,-$ no est asociada
nicamente con el intervalo desde parto al
primer estro' sino tambi)n con la
produccin de leche' demostrado
previamente @*6'+0A. n el rea de estudio'
las oportunidades de alimentacin para los
bfalos de pastoreo estn limitadas desde
diciembre hasta marzo. La mayora de los
bfalos ya han parido desde octubre hasta diciembre. s probable Due la falta de disponibilidad de forra!e
durante el perodo de post&parto pudiera haber causado una reduccin de la ,$- y la produccin de leche.
.e hecho' una buena gestin de nutricin en vacas -eb es importante para mane!ar el balance negativo
de energa debido a la produccin de leche @+/A. Nayashi et al. @+*A informaron de Due una disminucin
del suministro de nutrientes como resultado de la falta de forra!e conduce al catabolismo de te!ido corporal
y la disminucin de la ,-$. La pobre ,-$ de las vacas no slo aumenta los servicios de intervalo de
primer parto de sino Due tambi)n reduce la tasa de concepcin @6'++A.
Los bfalos Anoestrales tenan una concentracin de progesterona en la leche sistemticamente inferior a
los bfalos cclicos ">/ ng ; ml vsR / ng ; ml%. .e manera similar' en un estudio de /5 perodos de post
parto completo en bfalos (urrah en $ri LanHa' las concentraciones de progesterona de plasma se
mantuvieron ba!as ">0'*1 ng ; ml% durante un perodo Due oscila desde 6* hasta */0 das @+2A. (c-ool et
al. @+1A informaron de >/ ng ; ml de progesterona en plasma anestro de bfalos de pantano.
Los datos de progesterona en la leche basado en tres muestras "da 0' das /0&/*' y das **&*2% nos ayud
a hacer una clara distincin entre bfalas embarazadas y no embarazadas y la identificacin de ciclicidad
ovrica. Ina bfala no embarazada tena un perfil de progesterona ba!a' alta y ba!a en el .a 0' .a /* y el
.a **' respectivamente. ISar et al. @+BA reportaron concentraciones de progesterona de 0'65 P 0'2*' 5'66
P *'61 y 3'02 P *'62 ng ; ml en el da 0' da // y da */' respectivamente' de las bfalas de Anatolia
embarazadas. Luestros resultados estn de acuerdo con I-A7 et al. @+5A mostrando un perfil ba!o de
progesterona ">/ ng ; ml%' alto ": / ng ; ml% y alta ": / ng ; ml% en el .a 0' das /0&/* y .as **&*2'
respectivamente' en las bfalas de agua embarazadas. Nemos demostrado perfil de progesterona ba!a ">/
ng ; ml%' alta ": / ng ; ml% y ba!a ">/ ng ; ml% en el da 0' das /0&/* y los das **&*2' respectivamente' en
los bfalos de agua cclicos Due est de acuerdo con Qureshi et al. @/3A Due determinaron las
concentraciones de progesterona en la leche desgrasada de bfalas lecheras de 0'+0 P 0'63' /'2+ P 0'31'
+'*6 P 0'32 y 0'33 P 0'/1 ng ; ml en la fase de estro' desarrollando cuerpo lteo' desarrollado cuerpo lteo
y regresin del cuerpo lteo' respectivamente. La medicin de progesterona en la leche por L#$A fue 3*&
338 de exactitud para el diagnstico de embarazo en las vacas @+5A. .e hecho' el nivel de progesterona en
leche los das **&*2 se us para interpretar los resultados del embarazo con /008 de precisin en el
diagnstico no gravidez en el ganado y bfalos @+3A. n nuestro laboratorio' el 628 de las vacas
embarazadas fueron detectadas con precisin mediante el uso de L#$A de progesterona en leche y los
/008 de vacas embarazadas se detectaron tanto por la L#$A de progesterona en leche y
radioinmunoensayo @/B'/5A. stos hallazgos sugieren Due un ensayo cuantitativo de progesterona en leche
puede ser usado en el diagnostico temprano del embarazo en bfalos Due se reportaron anteriormente.
-onclusiones
L#$A es un instrumento confiable para determinar progesterona concentracin en la leche cuando se
investiga la ciclicidad ovrica posparto en los bfalos de agua. La deteccin del estro necesita una me!ora
significativa en la capacitacin de agricultores para reconocer signos secundarios del estro y midiendo la
concentracin de progesterona en dos muestras en un intervalo de /0 das si la bfala no est en estro a los
B0 das despu)s del parto. sto podra ayudar a los agricultores a criar bfalos en el perodo de post&parto
temprano. La condicin nutricional durante el perodo post&parto fue importante para el inicio temprano
de estro despu)s del parto en bfalos.