Czyyk ukasz

Gzowska Kinga, gr 1.

SPRAWOZDANIE

Wykrywanie aminopeptydazy N (EC 3.4.11.2)
metod wedug Nachlas i wsp. (1960)

Enzymy to substancje biakowe katalizujce rne przemiany biochemiczne.
Charakteryzuj si specyficznoci substratow (tzn. zdolnoci katalizowania przemiany
cile okrelonego substratu lub grupy substratw bardzo do siebie zblionych) i
specyficznoci funkcyjn (tzn. zdolnoci katalizowania jedynie okrelonej przemiany).
Specyficzno enzymw jest cile zwizana z mechanizmem ich dziaania. Substrat jest
przyczany do aktywnego miejsca enzymu, tworzc kompleks aktywny, w ktrym dopiero
nastpuje przemiana substratu w produkt. Zarwno na enzym jak i kompleks aktywny
oddziaywa mog inne substancje powodujce efekty aktywacji, dezaktywacji i hamowania
reakcji enzymatycznych. Rwnie kompleks aktywny moe podlega rnym
przeksztaceniom, zanim nastpi odczenie od enzymu produktu przemiany.

Najczciej do opisu prostej reakcji enzymatycznej uywane jest rwnanie Michaelis-Menten:



Zaleno szybkoci reakcji od stenia substratu przedstawia wykres:

Rys.1.




Km oznacza sta Michaelisa, tzn takie stenie substratu, przy ktrym szybko
katalizowanej reakcji osiga poow szybkoci maksymalnej.
Dla niskich ste substratu szybko reakcji wzrasta liniowo ze steniem substratu, za dla
wysokich ste wystpuje charakterystyczne nasycenie reakcja przebiega z szybkoci
zblion do maksymalnej.
Enzymy mona podzieli na 6 gwnych grup:
1. Oksydoreduktazy
2. Transferazy
3. Hydrolazy
4. Liazy
5. Izomerazy
6. Ligazy (syntetazy)

Hydrolazy to klasa enzymw hydrolizujcych (przenoszcych grupy funkcyjne na czsteczki
wody).

Spoywane biaka s podstawowym rdem aminokwasw. Ulegaj one rozkadowi do
aminokwasw lub maych peptydw, ktre mog by wchaniane przez jelito i
transportowane przez krew.
Rozkad biaek rozpoczyna si w odku, gdzie kwane rodowisko uatwia denaturacj
biaka. Biaka zdenturowane atwiej ulegaj proteolizie ni biaka natywne. Dalej, rozkad
biaka zachodzi w wietle jelita. Trzustka wydziela do wiata jelita rne enzymy
proteolityczne w postaci nieaktywnych zymogenw, ktre s nastpnie przeksztacane w
formy aktywne enzymw. Charakteryzuj si one szerokim spektrum dziaania i wykazuj
rn specyficzno, std produktami ich dziaania s wolne aminokwasy, jak rwnie di- i
tripeptydy. Trawienie wspomagaj rwnie proteazy, takie jak AMINOPEPTYDAZA N,
zlokalizowana w bonie plazmatycznej komrek jelita. Aminopeptydazy rozkadaj biaka od
ich koca aminowego. Aminokwasy, jak rwnie di- i tripeptydy s transportowane za wiata
jelita do komrek ciany jelita, a nastpnie uwalniane do krwiobiegu i wchaniane przez inne
tkanki.



Rys.2. Rozkad biaek i wchanianie produktw trawienia biaek.
Trawienie biaek zachodzi pocztkowo dziki aktywnoci enzymw wydzielanych przez
trzustk. Aminopeptydazy, znajdujce si w nabonku jelita, bior udzia w dalszym trawieniu
biaek. Aminokwasy, di- i tripeptydy ulegaj wchanianiu przez komrki jelita z udziaem
specyficznych przenonikw. Wolne aminokwasy s nastpnie uwalniane do krwi i mog by
wykorzystywane przez inne tkanki.




Aminopeptydaza alaninowa N (EC 3.4.11.2) jest bardzo wanym enzymem
proteolitycznym, uczestniczcym w wielu procesach biologicznych transmembranow
metaloproteaz zalen od jonu cynku Zn2+. Rozcina ona wizania peptydowe w biakach i
peptydach, odcinajc neutralne aminokwasy od strony N koca. APN moe rozszczepia
rne zewntrzkomrkowe peptydy, takie jak peptydy opioidowe, neuropeptydy, peptydy
wazoaktywne, peptydy macierzy pozakomrkowej oraz peptydy stanw zapalnych.
Dowiedziono, e APN jest wczona w regulacj odpowiedzi komrkowej, w ktrej
porednicz peptydy. Poprzez aktywacj / inaktywacj zewntrzkomrkowych peptydw
obdarzonych funkcjami sygnalizacyjnymi sygnalizacyjnych, APN zmienia ich lokalne
stenie, a tym samym modyfikuje transdukcj ich sygnaw. Funkcje biologiczne APN s
rne i zale od specyficznoci substratu i miejsca jego ekspresji.

Aminopetydaza N (EC 3.4.11.2) jest czonkiem rodziny M1, nalecej do klanu MA
metaloproteaz. Tworzy j 967 aminokwasw. W budowie enzymu mona wyrni krtk
domen cytoplazmatyczn na N kocu, cz transmembranow oraz du
zewntrzkomrkow domen zawierajc miejsce aktywne [1,8].



Rys. 3. Struktura krystaliczna aminopeptydazy N z Escherichia coli [9].

Podobnie jak inne proteazy z rodziny M1 metaloproteaz, aminopeptydaza N do swojej
aktywnoci wymaga obecnoci jednego jonu cynku. Kation Zn2+ wizany jest przez dwie
reszty histydyny i glutaminian [10]. Mechanizm dziaania enzymu polega na hydrolizie
neutralnych aminokwasw: alaniny, fenyloalaniny i tyrozyny z Nkoca oligopeptydowego
substratu. Aminopeptydaza N jest zdolna do degradacji biopeptydw jak np. neuropeptydw,
cytokinin, uczestniczc w ten sposb w wielu procesach biologicznych np. angiogenezie
[1,8,10].
Inhibitory naturalne i syntetyczne aminopeptydazy N

Znanych jest szereg naturalnych i syntetycznych inhibitorw aminopeptydazy N [1,8,10]. Do
naturalnych inhibitorw APN/CD13 nale gwnie substancje produkowane przez
mikroorganizmy. Zaliczy tu mona m.in. bestatyn, kurkumin oraz apigenin. Wykazano
take, i wiele czsteczek reprezentujcych zrnicowan budow chemiczn, wykazuje
aktywno inhibicyjn wobec APN/CD13. Wiadomo, i fosfonowe analogi aminokwasw s
rwnie zdolne do inhibicji aminopeptydazy N [3].


Sposb wizania inhibitora z miejscem aktywnym enzymu przedstawiono na schemacie.



Rys. 4. Schemat wizania inhibitora w centrum aktywnym aminopeptydazy N.


Odczynniki do reakcji:
Materiaem do bada jest ryba.
Substratem zastosowanym w reakcji jest L-leucine -Naphthyl-Amide Hydrochloride, ktry
daje barwny produkt, aby wynik mona byo atwo oceni na szkieku.
50ml 0,1M buforu fosforanowego o pH 6,5-7,5
50mg Fast Blue (sl diazetkowa, ktra nadaje barw i utrwala)
2% CuSO
4

4% formaldehyd
Glicerol-el

Mikroflora misa ryb odpowiada mikroflorze wody, w ktrej ryby przebywaj, a wic d to
psychrofile z rodzaju Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacetrium oraz Micrococcus. W
przewodzie pokarmowym ryb wystpuj bakterie z grupy okrnicy oraz beztlenowce
przetrwalnikujce Cl. Botulinum i Cl. Tetani. Najwicej drobnoustrojw znajduje si na
skrze, skrzelach i w przewodzie pokarmowym ryb.
Po zowieniu ryb drobnoustroje rozkadaj ich taknk misn. Rozkad ten zostaje
przyspieszony, gdy w czasie transportu lub zabiegw technologicznych ryba zostanie
zakaona treci przewodu pokarmowego. Miso ryb jest mniej trwae od misa zwierzt
staocieplnych i szybciej ulega zepsuciu. Przyczyny tego zjawiska s nastpujce:
- miso ryb zawiera wicej wody
- enzymy w tkankach ryb przystosowane s do niszych temperatur, jakie panuj w wodzie, a
po przeniesieniu do wyszych temperatur dziaaj o wiele aktywniej
- ryby zakaone s gwnie psychrofitami, ktre rozwijaj si w temperaturach bliskich 0C i
niszych, dlatego miso ryb przechowywane w chodni jest mniej trwae ni miso zwierzt
rzenych.










Przygotowanie preparatu.
Warunkiem uzyskania dobrego preparatu jest uycie czystych i odtuszczonych szkieek
podstawowych i nakrywkowych.

Wykonanie:
1. Przygotowanie buforu fosforanowego: roztwr A: 0,1M KH
2
PO
4
(1,361g/100m) i
roztwr B: 0,1M Na
2
HPO
4
x2H
2
O (1,78g/100ml)
2. Przygotowanie roztworw dla 5 grup: 20ml roztworu A + 30ml roztworu B= bufor o
pH 6,98
3. Rozpuszczenie 0,025g substratu w 0,5ml N,N-dimetyloformanide i dokadne
wymieszanie, aby substrat si rozpuci
4. Rozpuszczenie w 50ml buforu fosforanowego wczeniej przygotowanego substratu i
50ml zielonego Fast Blue. Dokadne wymieszanie i filtracja.

Przeprowadzenie reakcji histochemicznej

1. Inkubacja z medium reacyjnym przez 30minut w temp. pokojowej. W trakcie
inkubacji zaobserwowano zmian barwy na brzow
2. Delikatnie pukanie szkieka w wodzie destylowanej
3. Barwienie przez 5min w 2% niebieskiem CuSO
4

4. Pukanie w wodzie destylowanej
5. Zastosowanie przez 15min 4% formaldehydu, aby reakcja nie przebiegaa zbyt
gwatownie
6. Pukanie w wodzie destylowanej i zostawienie wody na szkieku
7. Szybkie zaklejanie glicerol-elem, aby preparat nie wysech

Wyniki:

SAZYW/21/15
fragment jelita rodkowego. obecne fioletowe zabarwienie, wic enzym wystpuje.
SAZYW/2/47
minie i wtroba, brak fioletowego zabarwienia (enzym nie wystpuje)

Literatura:
1. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa,
2009.
2. http://pl.wikipedia.org/wiki/Sta%C5%82a_Michaelisa
3. http://www.kns.b2me.pl/art-nowe-inhibitory-aminopeptydazy-n,176,0.html
4. http://www.kns.b2me.pl/art-nowe-inhibitory-aminopeptydazy-n,176,1.html
5. http://www.szkolnictwo.pl/test,4,4147,19,Enzymy-
chemiczne_regulatory_reakcji_cz%C4%99%C5%9B%C4%87_II-Sta%C5%82a_Michaelisa-
Menten
6. Korzybski T. Enzymy. Nomenklatura i klasyfikacja. Pastwowe Wydawnictw Naukowe.
Warszawa, 1967
7. Sobczak E. Teoria i wiczenia z mikrobiologii oglnej i technicznej. Wydawnictw SGGW-
AR.
8. Szewczyk W. K., Bilansowanie i kinetyka procesw biochemicznych. Oficyna
Wydawnicza Politechniki Warszawskiej. Warszawa, 2005.