Fecha de Prcticas: 31 de Mayo y 01 de Junio de 2014.
PRECAUCIN: Usar los elementos de Bioseguridad en todo momento. Nmero de Grupos: Se conformaran 4 grupos, 2 con 6 integrantes y 2 con 5 integrantes. Los 4 grupos trabajarn de la siguiente manera:
GRUPO N 1 GRUPO N 2 *Tipo de Muestra: Sangre total (Deben sangrar a 4 integrantes del grupo). *Para la extraccin deben trabajar con el KIT comercial. *MPM 50bp. *Tipo de Muestra: Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis. *Para la extraccin deben trabajar con la tcnica manual. *MPM 100bp. GRUPO N 3 GRUPO N 4 *Tipo de Muestra: Candida spp. y Escherichia coli. *Para la extraccin deben trabajar con la tcnica manual. *MPM 50bp. *Tipo de Muestra: Staphylococcus epidermidis y Escherichia coli. *Para la extraccin deben trabajar con la tcnica manual. *MPM 100bp.
NOTA: Antes de comenzar cada procedimiento verificar que todo el material este completo e informar.
EXTARCCIN Y PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS
OBJETIVOS 1. Conocer algunos mtodos de extraccin de cidos nucleicos. 2. Realizar la extraccin de ADN por los mtodos de choque trmico y Kit comercial. 3. Determinar las propiedades de los cidos nucleicos que son evidenciadas en la prctica.
HABILIDADES A DESARROLLAR
Al finalizar la prctica el estudiante debe ser capaz de conocer y explicar brevemente el fundamento de cada uno de los mtodos de extraccin o purificacin de cidos Nuclecos y su aplicacin en la investigacin en microbiologa.
METODOLOGA
Para llevar a cabo la prctica se tendrn en cuenta las siguientes recomendaciones.
1. El docente realizara una breve explicacin de los diferentes mtodos de extraccin de cidos nuclecos que actualmente se utilizan en la biologa molecular y la microbiologa. 2. Los estudiantes se organizaran en cuatro grupos y luego recibirn un cultivo puro de un microorganismo especfico. 3. Se socializaran paso a paso los fundamentos del mtodo a desarrollar. Este ser considerado el primer momento de evaluacin de la prctica del docente. 4. Se realizara el procedimiento de extraccin de ADN de bacterias/hongo, por lavado con Tris y lisis por calentamiento. 5. Se realizara el procedimiento de extraccin de ADN de sangre, utilizando un Kit comercial.
TCNICA DE EXTRACCIN KIT MO BIO MATERIALES Y REACTIVOS: 4 tubos vacutainer tapa lila 4 agujas vacutainer 1 camisas para vacutainer Algodn Alcohol Toallas absorbentes Frasco de viales de 1.5ml estriles Solucin G1 Solucin G2 RNasa A Solucin G3 Isopropanol al 100% Etanol al 70% Solucin G4
EQUIPOS Y ACCESORIOS Centrfuga Vortex Bao serolgico Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l Timer PROCEDIMIENTO 1. Tomar un vial de 1.5ml y aadir 300ul de sangre total o de capa de glbulos blancos ms 900ul de Solucin G1. 2. Invertir dos veces e incuba por 5 minutos a temperatura ambiente. 3. invertir dos veces durante la incubacin. 4. Centrifugar durante 30 segundos a 13.000 rpm. Remover sobrenadante con punta de pipeta y descartar sin molestar pellet blanco. 5. Pasar por vortex para resuspender completamente pellet. 6. Observe la Solucin G2. Si se encuentra precipitada, colocar al calor de 55 - 65 C durante 5 minutos para disolver. Aadir 300ul de Solucin G2. 7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para lisar las clulas (en caso de observar grupos de clulas, incubar a 37 C hasta que se disuelva). 8. Aadir 1.5l de RNasa A, invertir 5 veces y pasar por vortex a baja velocidad durante 5 segundos. 9. Adicionar 100ul de Solucin G3. 10. Inmediatamente pasar por vortex a mxima potencia durante 15 segundos. 11. Centrifugar por 3 minutos a 13.000 rpm. 12. Transferir sobrenadante a un tubo de coleccin limpio. 13. Agregar 300ul de Isopropanol al 100%. 14. Invertir 15 veces e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos. 15. Centrifugar 1 minuto a 13.000 rpm. 16. Vierta cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar pellet y escurrir sobre una toalla de papel o material absorbente. 17. Adicionar 300ul de Etanol al 70%. 18. Invertir el tubo 5 veces para lavar el pellet. 19. Centrifugar 30 segundos a 13.000 rpm. 20. Vierta cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar pellet y escurrir sobre una toalla de papel o material absorbente. 21. Centrifugar por 30 segundos y eliminar el sobrenadante residual con punta de pipeta estrecha sin perturbar el pellet. 22. Adicionar 100ul de la Solucin G4. 23. Calentar en un bao serolgico a 65 C o bloque de calor, tocando el tubo de vez en cuando, hasta que se resuspenda el pellet (debera tomar de 30- 40 minutos). 24. El DNA genmico est en el tubo ya est listo para utilizar para cualquier aplicacin.
TCNICA DE EXTRACCIN MANUAL REACTIVOS: Tris-HCl (0.5 M; pH: 8.0) Buffer TE (Tris HCl 10mM, pH:8.0 + EDTA 1mM) EQUIPOS Y MATERILES Bloque de calentamiento en seco Congelador Centrfuga Vortex Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l Toallas absorbentes Frasco de viales de 1.5ml estriles Gradilla plstica
PROCEDIMIENTO 1. Resuspender una gran cantidad de colonias bacterianas (>30) en 0.5 ml de Tris-HCl (0.5 M; pH: 8.0), agregar 0.5 ml Tris-HCl para completar un volumen de 1 ml y agitar en vortex durante 30 segundos. Nota: Encender el Bloque de calentamiento 2. Centrifugar a 13000 rpm x 5 minutos y descartar el sobrenadante aspirando con micropipeta. 3. Resuspender el pellet resultante en 0.5 ml de buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH: 8.0 + EDTA 1mM). 4. Calentar a 100 C por 30 minutos en bloque de calentamiento. Nota: Cuidar que los tubos permanezcan cerrados durante el calentamiento. 5. Congelar durante 20 minutos y descongelar en bloque de calentamiento. 6. Centrifugar a 13000 rpm x 15 minutos. 7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo cuidando de no tomar parte del pellet. 8. Medir la calidad y concentracin del ADN.
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ELECTROFORESIS DE CIDOS NUCLECO OBJETIVOS 1. Adquirir los fundamentos tericos y prcticos para llevar a cabo la amplificacin de fragmentos de ADN mediante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). 2. Separar y analizar los fragmentos de ADN mediante electroforesis.
HABILIDADES A DESARRROLLAR El estudiante debe ser capaz de reconocer los pasos de la PCR, ciclos y reactivos necesarios. Disear un protocolo de PCR y realizar clculos y concentraciones ptimas de cada reactivo y de las muestras utilizadas en diferentes mbitos de la biologa molecular. DISEO DE LA PCR REACTIVOS: Master Mix Buffer dNTPs MgCl2 Primer Upstream Primer Downstream Taq Polimerasa ADN Agua libre de nucleasas EQUIPOS Y MATERIALES Termociclador Vortex Tubos para PCR (Viales de 0.2ml) Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l Toallas desechables Gradilla plstica
GRUPO N 1 y GRUPO N 3
Utilizar la Master Mix Reactivos Concentracin Inicial Concentracin Final GoTaq Green Master Mix 2X 2X 1X Primer Upstream 5M 0.2M Primer Downstream 5M 0.2M ADN Volumen: 5l
Volumen de Reaccin: 25l NOTA: Completar el volumen faltante de la reaccin de PCR con agua libre de nucleasas, hasta llegar a 25l.
GRUPO N2 y GRUPO N4
Utilizar los siguientes reactivos:
Reactivos Concentracin Inicial Concentracin Final *Buffer 5X 1X dNTPs 100mM 10mM MgCl 2 25mM 3mM Primer Upstream 5M 0.2M Primer Downstream 5M 0.2M Taq Polimerasa 5U/l 2.5U/l ADN Volumen: 5l
Volumen de Reaccin: 25l NOTA: Completar el volumen faltante de la reaccin de PCR con agua libre de nucleasas, hasta llegar a 25l. *El buffer del grupo N 2 es: 5X Green GotTaq Flexi Buffer y el buffer del grupo N 4 es: 5X Colorless GoTaq Flexi Buffer.
PREPARACIN GEL DE AGAROSA
REACTIVOS
Agarosa TAE 50X SAYB SAFE 10000 Agua destilada
EQUIPOS Y MATERIALES
Cmara de electroforesis Fuente de poder para la cmara de electroforesis Balanza Analtica Plancha con calentamiento Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l Soporte o molde para gel Peines Erlenmeyer de 250ml Esptula Probeta graduada Papel kraft Guantes para calor Brocha para limpiar la balanza
DESARROLLO/ PROCEDIMIENTO
Procedimiento para la preparacin de geles de agarosa para realizar corrido electroforticos de las distintas muestras a investigar.
Cerciorarse que la balanza este calibrada. Lugo encender balanza y llevarla a cero, pesar el papel kraft o recipiente y nuevamente llevar a cero, despus pesar la agarosa dependiendo del volumen del soporte de la cmara de electroforesis: 0.2gramos de agarosa para 20ml o 0.4gramos para 40ml y depositarla la agarosa en un erlenmeyer.
Medir en una probeta graduada los volmenes necesario para preparar el TAE a una concentracin 1X, dependiendo el volumen del soporte de la cmara de electroforesis: 0.4ml de TAE 50X ms 19.6ml de agua destilada para un gel de 20ml o 0.8ml de TAE 50X ms 39.2ml de agua destilada para un gel de 40ml y agregar al erlenmeyer que contiene la agarosa.
Gel para una cmara de 20ml. Todo va al 1%.
MATERIAL CANTIDAD Agarosa 0.2gr Agua destilada 19.6ml TAE 50X 0.4ml = 400l
Gel para una cmara de 40ml. Todo va al 1%.
MATERIAL CANTIDAD Agarosa 0.4gr Agua destilada 39.2ml TAE 50X 0.8ml = 800l
Colocar la preparacin en un una plancha de calentamiento con agitacin por unos minutos hasta que se disuelva totalmente la agarosa, trasparente y sin grumos. Trascurrido el tiempo con los guantes para calor retirar el erlenmeyer de la plancha de calentamiento con agitacin. Dejar reposar de 3 a 5 minutos. Durante este tiempo prepara la cmara (Ajustar el soporte del gel, nivelar y colocar los peines en el soporte). Adicionar a la mezcla la cantidad de SAYB SAFE 10000 requerida, dependiendo del volumen de la preparacin. (2l SYBR SAFE para un volumen de 20ml o 4l para un volumen de 40ml). Agregar la mezcla al soporte por los bordes y suavemente, con el fin de no producir burbujas, dejar gelificar aproximadamente por 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Retirar los peines y los imanes suavemente para no romper el gel. Dejar el gel en el soporte y dentro de la cmara.
MONTAJE DE ELECTROFORESIS REACTIVOS
TAE 50X Agua destilada Buffer de Carga (Grupo N4) DNA
EQUIPOS Y MATERIALES
Cmara de electroforesis Fuente de poder para la cmara de electroforesis Fotodocumentador Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l Probeta graduada Papel parafilm
PROCEDIMIENTO
Preparar el buffer de llenado para la cmara, tomando una probeta graduada y medir 294ml de agua destilada y agregar 6ml de TAE 50X.
MATERIALES CANTIDAD Agua destilada 294ml TAE 50X 6ml
Agregar el buffer a la cmara de electroforesis hasta cubrir por completo el gel. Luego el grupo N 4 tomar el papel parafilm y sobre este colocar 1l del buffer de carga + 5l de ADN de la muestra (segn nmero de muestras a utilizar), mezclar bien con punta de micropipeta y colocar en el pozo correspondiente (tener en cuenta cambiar el volumen de la micropipeta al momento de la siembra 1l + 5l = 6l). NOTA: En el primer pozo adicionar el MPM. Los dems grupos agregar 5l de la muestra de ADN de manera directa a cada pozo. Despus tapar la cmara de electroforesis y conectar a la fuente de poder teniendo en cuenta la carga del ADN. Hacer corrido a 70 voltios por 45 minutos. Anlisis las bandas en fotodocumentador.
NOTA: Luego de utilizado el gel debe ser descartado en la bolsa roja.
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