ELECTROFORESIS Y VISUALIZACIN DEL ADN

Resumen
La electroforesis es una tcnica til para la separacin de molculas en una mezcla, mediante
la aplicacin de un campo elctrico; basndose en una relacin de desplazamiento carga:masa
nica en cada molcula disuelta.
(5).
Esta tcnica tiene mltiples funciones cuantitativas y de
identificacin necesarias en estudios experimentales y complementarias en diferentes tcnicas
de la biologa general. En esta prctica se realiz una electroforesis con ADN bacteriano de
Echerichia coli en un medio de agarosa al 0.8%.


Introduccin
La electroforesis es una tcnica que ayuda
en el estudio del movimiento de las
biomolculas con una carga neta a travs
de un campo elctrico. Su migracin
depende de la forma, tamao, carga y
composicin qumica; es decir, en una
mezcla cada molcula presenta una carga y
tamao nicos, por lo tanto la movilidad y
la velocidad de migracin en el campo
elctrico para cada molcula es tambin
nica y separable en bandas
(6).
La electroforesis es una tcnica que se
utiliza para analizar y determinar el peso
molecular de diferentes tipos de
biomolculas, siendo ms comn su uso en
protenas y cidos nucledos
(6).
Existen
diferentes tipos de electroforesis cuya
diferencia radica en los distintos tipos de
desplazamiento; en la electroforesis de
frente mvil, las partculas se mueven de
forma libre en el medio en que se
encuentran dispersas y en la electroforesis
de zonal, la muestra esta obligada a
desplazarse sobre un mecanismo o
soporte solido que puede ser restrictivo
(geles de almidn y poliacrilamida) o no
restrictivo (papel, acetato celulosa y
agarosa)
(4).
Los geles de celulosa de soporte
solido, son usados para molculas de bajo
peso molecular como los aminocidos y los
carbohidratos; en cambio los geles de
poliacrilamida y agarosa de matriz porosa,
se utilizan para molculas de mayor peso
molecular (DNA, RNA y protenas)
(6).
La electroforesis en gel de agarosa es un
mtodo bastante utilizado para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN,
que han sido extrados anteriormente. La
agarosa es un polmero lineal, extrado de
algas marinas y no toxico. Los geles de
agarosa se preparan fundiendo agarosa en
presencia del buffer adecuado hasta que se
logre una solucin transparente. La
solucin fundida es puesta en un molde
donde gelifica. El gel forma una matriz cuya
densidad est determinada por la
concentracin de agarosa. Cuando se
aplica un campo elctrico a travs del gel,
el ADN migra hacia el nodo. Entre los
factores que afectan la velocidad en la
tasa de migracin del ADN en los geles de
agarosa se incluyen: el tamao del
fragmento a migrar (ADN), la
concentracin de agarosa, la conformacin
de ADN, el voltaje aplicado y el
amortiguador utilizado
. (1)
El buffer de corrida es utilizado para baar
el gel de agarosa Y puede ser reciclado y
utilizado varias veces para este
procedimiento. Los ms comnmente
usados son TBE (Tris-Borato-EDTA) y TAE
(Tris-Acetato-EDTA); aunque es ms
frecuente el uso de TAE, este presenta
capacidad de buffer ms baja que el TBE. El
TBE puede ser usado para electroforesis de
DNA de bajo peso molecular y en los
sistemas en los cuales es usado no requiere
de sistemas adicionales de
recircularizacin. El buffer de carga (pH 7),
son adicionados a las muestras antes de
servir en el gel con el propsito de
incrementar la densidad de la muestra;
asegurando que el ADN precipite al fondo
de los pozos y adicionando color a la
muestra mediante colorantes indicadores o
agentes intercalantes (BPB o FF, entre
otros) que permiten el seguimiento de la
electroforesis; dada la co-migracin de los
colorantes indicadores con fragmentos de
DNA de tamao especfico
(7).
EZ -Vision es un agente intercalante de
reaccin fluorescente no mutagnico, no
toxico, ni peligroso en su manipulacin,
transporte y eliminacin; a comparacin
del ms usado Bromuro de etidio.
Principalmente forma un apretado
complejo con el ADN de la muestra y co-
migra con l durante la electroforesis;
proporcionando la visualizacin
instantnea de sus bandas tras la
iluminacin UV de geles de agarosa.
(8)








Materiales y Mtodos

Para la prctica se requiri de los
siguientes Instrumentos, materiales
moleculares y reactivos qumicos:

Instrumentos: Micropipeta, termociclador,
microtubos, cmara electrofortica,
fotodocumentador, horno microondas y
pelculas de ParaFilm.

Material molecular:
ADN genmico de Echerichia coli, plsmido
recombinante, plsmido no recombinante
y una PCR.

Reactivos: Buffer TBE (carga y corrida)
0.5X, Agarosa (0.8%) y EZ-Vision
.

1. Se fundieron 30 mL (0.24 gr) de
Agarosa al 0.8%, anteriormente
gelificada. Se emplearon 6 ciclos de
calor, cada uno de 8 segundos
aproximadamente; utilizando la
energa calrica de un horno
microondas. Se verific que la
Agarosa tuviera una contextura
liquida, clara y muy homognea.

2. Se verti la solucin de agarosa en
la caja molde electrofortica,
verificando que no existiera
ninguna burbuja y se coloc el
peine con las cabezas de los
tornillos hacia el frente, cerrndolo
hermticamente en las
extremidades.


3. Se espero unos segundos y se
introdujo la Agarosa a una nevera
para gelificar la solucin.
Transcurrido 10 minutos se
observ que faltaba un poco y se
espero otros 5 minutos ms.

4. Al enfriar y gelificar
completamente la Agarosa; se sac
el peine y los cauchos del gel, se
ensamblo el molde en la cmara y
se sumergi el gel en una solucin
de buffer de corrida 0.5X TBE;
cubriendo 3 milmetros por encima
a los posos credos por los peines.


5. Se utiliz una micropipeta de 10x
para premezclar el buffer de carga
0.5X (TBE) + el EZ-Vision =
equivalentes a 1.4 L que se
colocaron en una pelcula de
ParaFilm formando una gota o
punto. Se repiti 4 veces ms este
procedimiento.

6. Al terminar de premezclar y
colocar las cinco gotas; a cada una
se le adicion su correspondiente
muestra.

#
gota
Muestra
1 1L del marcador de peso
molecular
2 3L de ADN genmico de E.coli
3 3L de PCR
4 3L de Plsmido no recombinante
5 3L de Plsmido recombinante


7. Se Tom con la punta de la
micropipeta (10X), la primera
muestra (gota # 1), para empozarla
en el fondo del primer poso;
procurando no romper el gel y se
descarg suavemente la muestra.
Se repiti este procedimiento con
las 4 muestras faltantes, siguiendo
una lnea horizontal y una seguida
de otra.

8. Se encendi la fuente de poder y
se corri el gel a 120V/cm * 30
minutos hasta que los indicadores
migraron la distancia apropiada

9. Se visualiz el ADN bajo la lmpara
UV y se tomo una foto de la
imagen.

10. Se descarg el Software
Gelanalyzer(R) para analizar los
datos de la imagen








Planteamientos de conclusiones

Las molculas de ADN de doble cadena migran de manera inversamente proporcional al
logaritmo en base 10 (log 10) de sus tamaos moleculares y dado que el ADN esta cargado
negativamente debido a sus grupos fosfatos de la molcula la migracin en la cmara de
electroforesis ocurre del polo negativo hacia el polo positivo
.(1)
Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes
concentraciones de agarosa. Existiendo una relacin lineal entre el logaritmo de la movilidad
electrofortica del ADN y la concentracin del gel de agarosa; es decir, a mayor concentracin
menor rango de separacin (2)
Las molculas circulares y las lineales presentan diferencias en su migracin a travs de la
matriz agarosa; es as como las formas circulares plegadas migran mas rpido que las formas
circulares con rompimientos de enlace fosfodiester en una de las cadenas y que las formas
lineales (1).
La migracin de ADN se ve afectado por la composicin como la fuerza inica del amortiguador
empleado.de manera que se debe establecer un balance de iones que genere una fuerza inica
suficiente para lograr la conductancia elctrica, sin excederse y ocasionar un calentamiento
excesivo con fusin de la agarosa y desnaturalizacin de ADN.(1)
El colorante se intercala entre las bases del ADN de manera que el colorante unido unido al
mismo presenta una mayor fluorescencia que el colorante solo en solucin. A 254nm la
radiacin UV es absorbida por el ADN y TRANSMITIDA AL COLORANTE, pero a 302 y 366 nm es
absorbida nicamente por el colorante unido al ADN. En ambos casos, la energa es re-emitida
a 590 nm en la regin rojo-naranja del espectro visible. (1)
El voltaje bajo la migracin de las molculas lineales de ADN es proporcional al voltaje
aplicado. Por lo tanto el rango de separacin efectiva en los geles de agarosa decrece cuando
se eleva el voltaje aplicado. (1)


Bibliografas
1. Puerta B. Concepcin y Urea P. Claudia. Prcticas de biologa molecular. Ed Pontificia
Universidad Javeriana. Colombia 2005.pg 24-28

2. Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3 ed. Ed Cold
Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. Pgs. 23-44.


3. DAVID L. NELSON; MICHAEL M. COX. Lehninger Principios de bioqumica. Cuarta
Edicin. Ed Omega. 2006. Pg. 86-87

4. Christopher K. Mathews Kensal E. van Holde Kevin G. Ahern. Bioqumica. Tercera
edicin. Ed PEARSON EDUCACION S.A. Madrid. Espaa 2002.pg 1040.


5. Lodish, Berk. Matsudaira, Kaiser y otros. Biologa celular y molecular. Ed. Mdica
Panamericana. 5 ed. Capitulo 3.6. Buenos Aires. Argentina 2005. Pg. 87

6. Segal Kischinevzky,Claudia Andrea. Manual de Practicas Biologa Molecular de la
Celula L. Ed UNAM. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Ciencias.
Colombia 2005. Pg. 51-56


7. Serna Oriana. ELECTROFORESIS Y VISUALIZACIN DEL ADN. Laboratorio de biologa
molecular (20071). UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER. 2013

8. EZ-VisionA Fluorescent Dye for the Instant Visualization of DNA
Bands in Agarose Gels Supplied in 6X Loading Buffer. 1-800-829-2805
web http://www.amresco-inc.com/media.acux/eef4bdfc-0b74-4f46-8e9c-fb48bebdc6d3