ULTIMOS AVANCES EN LA BIOLIXIVIACIN DE

CONCENTRADOS CALCOPIRITICOS
Dr. JUAN RIVADENEIRA H.
Primer Encuentro en Operacin y Mantencin de Plantas de Lixiviacin.


Muchas Gracias
Introduccin
Mercado del cobre de acuerdo a su va de procesamiento.
Minerales: xidos v/s Sulfuros.
Sulfuros: Molienda- Concentrados- nodos-ER- Ctodos.
xidos: Chancado- Lixiviacin pilas - SX-EW - Ctodos.
Bajos costos en procesos de biolixiviacin de sulfuros.
Regeneracin de insumos H
2
SO
4

Plantas de Ex-EW amortizadas.
Baja intensidad de energa.

Foco actual de lixiviacin en bajas leyes.
Procesos masivos, Botaderos, ROM.
Ambientalmente amigable v/s Fundiciones.
No genera gases sulfurosos
Nuevos minerales
Refractarios o con As
Introduccin
Proceso productivo segn el mineral
Cobre Sulfurado
Molienda
Flotacin
Fundicin
Electro
refinacin
Cobre oxidado
Lixiviacin
Extraccin por
solventes
Electro obtencin
Exploracin
geolgica
Extraccin, Carguo
y Transporte
Chancado
Introduccin
Capacidad de Fusin de Concentrados y Refinacin de Cobre en Chile
Fuente: Cochilco, 2009

Introduccin
0
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020
K
T
o
n

C
u

F
i
n
o

Produccin de Cu en Chile
Capacidad de fundicin
Capacidad de Refinacin
Cobre en concentrados
total Catodos SxEw
Mina Subterranea y a rajo
abierto

Buena ubicacin Geogrfica
de las faenas

Tecnologa de punta en planta

Investigacin y Desarrollo

Gobierno y nueva
norma de fundiciones:
Codelco y Enami son
las que debern realizar
la mayor inversin
Constanza Prez-Cueto
Introduccin
"Estimamos que son ms de US$1.350 millones (de inversin). Las
principales inversiones van a estar en las fundiciones pblicas" dijo
a La Tercera, Marcelo Fernndez, jefe de la oficina de Asuntos
Atmosfricos del Ministerio de Medio Ambiente.

04/07/2012

Directo:
Obteniendo electrones directamente de la
reduccin del mineral.
Adhesin celular al sustrato mineral.


Indirecto:
ion frrico como transportador de electrones
No requiere contacto de la clula al sustrato.

Modelos de Mecanismos de
Lixiviacin
Contacto celular con el sustrato mineral.

Excrecin celular de exopolmeros.

Acomplejamiento de iones frricos a residuos de cido
glucurnico presentes en el exopolmero.
Mecanismo de ataque primario.

Formacin de tiosulfato como intermediario de la oxidacin
del sulfuro.

Formacin de grnulos de sulfuro o grnulos de politionato
en el espacio peri plasmtico o en la pared celular.
Modelos de Mecanismos de
Lixiviacin
Mecanismo del tiosulfato (FeS
2
, MoS
2
, WS
2
).

FeS
2
+ 6Fe
3+
+ H
2
O S
2
O
3
2-
+ 7Fe
2+
+ 6H
+
S
2
O
3
2-
+ 8Fe
3+
+ 5H
2
O 2SO
4
2-
+ 8Fe
2+
+ 10H
+

2Fe
3+
+ 2S
2
O
3
2-
2FeS
2
O
3+
2Fe
2+
+ S
4
O
6
2-


Mecanismo de poli sulfuros (ZnS, CuFeS
2
, FeAsS, etc.)

MS + Fe
3+
+ H
+
M
2+
+ 0.5 H
2
Sn + Fe
2+
0.5 H
2
Sn + Fe
3+
0.125 S
8
0
+ Fe
2+
+ H
+
0.125 S
8
0
+ 1.5 O
2
+ H
2
O SO
4
2-
+ 2H
+

Precipitacin del hierro frrico
4 Fe
3+
+ 12 H
2
O 4 Fe(OH)
3
+ 12 H
+

Mecanismos de Lixiviacin

4 2 6 2 4 3 2 3 4 2 4 2
SO H 6 OH SO KFe 2 O H 12 SO Fe 3 SO K
A)
B)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
T
E
M
P
E
R
A
T
U
R
A
,

C
pH
Fe
3+
Fe
2
O
3
FeO(OH)
Fe(OH)
3
Formacin de Jarosita potsica. A) formula de la reaccin qumica conducente a la formacin de jarositas potsicas. B)
diagrama de temperaturas y pH de estabilidad de compuestos de in frrico, se muestran los parmetros de formacin y
estabilidad de las especies que conforman jarositas y hidrxidos de Hierro ( Geothita y Hematita), en rojo se muestra el
rea en que es posible encontrar el in frrico en solucin y las estrellas muestran las condiciones operacionales utilizadas
en las experiencias de biolixiviacin llevadas a cavo en esta tesis con microorganismos mesfilas, termfilos Moderados y
termfilos extremos ( 39, 50 y 70 C Respectivamente) y en condiciones de iso pH 1,5. Adaptado de G. von Weert and
R.J.M. van Lier, Aqueous Pressure Oxidation of Silver Bearing Cyamide Refractory Concentrates in Acidic Sulfate and
Sulfate Iodide Media, TMS EPD Congress JOM 1994, pp 12.

REACCIONES DE OXIDACIN DE MINERALES
CUPROSOS
H.R.Watling (2006) The bioleaching of sulphide minerals with emphasis on copper sulphides hydrometallurgy 84: 81-108
TRFLP
Mina Subterranea y a rajo
abierto

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Investigacin y Desarrollo

Microorganismos descritos en procesos de
Biolixiviacin de calcopirita
H. Huber, K.O.Stetter. (1998) Hyperthermophiles and their possible potential in biotechnology Journal of Biotechnology 64: 39-52.
pH 1,5
Aerobiosis
CuFeS
2
Fe
2
(SO
4
)
3
Fe SO
4
H
2
O
O
2
pH 7
NAD(P)H

NAD(P)

H
+
H
+
H
+
ADP + Pi

ATP

Fe
2
(SO
4
)
3
FeSO
4
+ CuSO
4
+ S
H
2
SO
4
H
2
SO
4
SO
4
=
K

F
e
3
(
S
O
4
)
2
(
O
H
)
6

Acidithiobacillus ferrooxidans
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
Modelo propuesto de ataque indirecto por Fe
3+
con oxidacin de Fe
2+
bacterial y O2 como aceptor de electrones en
Acidithiobacillus ferrooxidans.
Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la
partcula a biolixiviar. Se incluye ataque de in frrico sobre la partcula de calcopirita y la generacin de un azufre elemental
como subproducto de la reaccin. Modelo propuesto para ataque Indirecto en condiciones Mesoflicas.
pH 1,5
Aerobiosis
S
S
S
S
S
CuFeS
2
K

F
e
3
(
S
O
4
)
2
(
O
H
)
6

Acidithiobacillus ferrooxidans
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
Modelo propuesto de ataque directo con oxidacin de RISCs y O2 como aceptor de electrones en Acidithiobacillus
ferrooxidans.
Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la part cula a
biolixiviar. Se incluye ataque de la bacteria sobre los precipitados de RISCs en la superficie de la partcula de calcopirita, los compuestos
RISCs al ser extremadamente insolubles en medio acuoso requieren que la bacteria ataque de forma directa la superficie del mi neral ( lnea
punteada negra). Modelo propuesto para explicar el ataque Directo en condiciones Mesoflicas, Termoflicas moderadas y Termoflicas
extremas, utilizando oxigeno como aceptor final de los electrones.
pH 1,5
Anaerobiosis
S
S
S
CuFeS
2
S
C
u
F
e
S
2

K Fe
3
(SO
4
)
2
(OH)
6
Acidithiobacillus ferrooxidans
Modelo propuesto de ataque directo con oxidacin de RISCs y Fe
3+
como aceptor de electrones en Acidithiobacillus
ferrooxidans.
Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la part cula a
biolixiviar. Se incluye ataque de la bacteria sobre los precipitados de RISCs en la superficie de la partcula de calcopirita, los compuestos
RISCs al ser extremadamente insolubles en medio acuoso requieren que la bacteria ataque de forma directa la superficie del mi neral ( lnea
punteada negra). A la vez al utilizar Fe
3+
como aceptor final de los electrones la bacteria genera espacios en su pared celular capaces de unir
precipitados de Fe
3+
permitiendo mejorar las capacidades de unirse al sustrato a biolixiviar. Modelo propuesto para explicar el ataque Directo
en condiciones Mesoflicas, Termoflicas moderadas y Termoflicas Extremas con frrico como aceptor final de los electrones.
Sistema de Biolixiviacin de Concentrados en Pilas
Aireacin e irrigacin controlada para conservar el calor y as maximizar la
biolixiviacin.
Especies Biolgicas atacan los sulfuros y liberan los metales bsicos a la
solucin.
El concentrado es recubierto sobre un sustrato de tamao controlado
(Roca estril o mineral de baja ley) y apilado.
La pila se irriga con solucin cida con nutrientes que se recicla.
Se emplea aire a baja presin para suplir oxigeno- soplado desde la base
de la Pila.
SX-EW.
Fierro y Arsnico se remueven va precipitacin.
Los metales preciosos pueden recuperarse si estn presentes.
PROCESO GEOCOAT
clonamiento

GEOCOAT

Cubierta de concentrado (0.5

1.0mm) sobre ripio de soporte

Ripio de soporte +4mm 25

mm

Espacios libres permiten alta

permeabilidad
Flujo de Aire
Flujo de Solucion
clonamiento

Balance trmico
GEOCOAT
La acumulacin de calor en la pila es determinada por el balance entre la tasa de lixiviacin , la tasa de
riego y la tasa de aireacin combinada con las condiciones de borde.
Conduccin
Radiacin Conveccin Evaporacin
Aireacin
Solucines
Condicin de borde
Condicin de Borde
Transporte de solucin y
aire al interior de la pila
La energa es generada por
las reacciones de lixiviacin
Irrigacin
Aireacin y Evaporacin
Las reacciones
generan calor en
la pila
Temperatura C
Evaporacin
condensacin
Accumulacin

de Temperatura
Perdida de calor y calor en soluciones de riego
Temperatura ideal
Aireacin
Riego
Sobre irrigacin enfra Sobre aireacin enfra
Balance trmico
GEOCOAT
P
r
o
f
u
n
d
i
d
a
d

m

20 70
0
8
Inculos microbiolgicos
Obtenidos a partir de Bancos de microorganismos pre
adaptados a los concentrados de Pucobre y entregados por el
Dr Greg Olsen, Little Bear laboratories, Inc ( Geosynfuels,
Golden, CO).

Campaas de bioprospeccin realizadas en el norte de Chile.
Lugares impactados por la industria minera y seleccionados de
acuerdo a su capacidad de biolixiviar concentrados calcopirtico
en pruebas de matraces.
drenajes cidos de minas.
soluciones ricas de percolacin.
tranques de relaves (Chaaral).
rio salado y caleta palitos.
fuentes termales del norte de Chile en particular las
termas de rio Negro y El Tatio.
clonamiento

Zona alta
ZA
Zona
media ZM
Zona baja
ZB
Bio prospeccin de Inculos
Concentrado de Calcopirita
Biolixiviacin en matraz (1L)
Biolixiviacin en tanque
agitado (35L)
Biolixiviacin en Columnas
( Cuarzo y Ripios , 2 y 6 m de altura)
Prelixiviacin cido/frrica en tanque
(50L)
Generacin de
inculo para
Generacin de
inculo para
Anlisis qumicos,
granulomtricos y
Mineralgicos

Anlisis qumicos,
granulomtricos

Anlisis de biodiversidad
y qumicos

Anlisis de
biodiversidad
y qumicos

Anlisis de
biodiversidad
y qumicos

Anlisis comparativos de
diversidad y abundancia
relativa por RFLP, T-RFLP
caracterizacin de
especies dominantes por
clonamiento y
secuenciacin
Anlisis qumicos
comparativos
Composicin mineralgica global
ESPECIES % PESO %S %Cu %Fe %Zn %As
CALCOPIRITA 52,68 18,44 18,23 16,02
COVELINA 0,11 0,04 0,08
ENARGITA 0,05 0,02 0,03 0,01
PIRITA 27,73 14,81 12,92
ESFALERITA 0,05 0,02 0,03
MAGNETITA 2,78 2,01
HEMATITA 1,36 0,95
LIMONITA 0,05 0,03
RUTILO 0,05
GANGA 15,12 (*)
TOTAL 100,00 33,32 18,33 31,93 0,03 0,01

Composicin mineralgica 100% base minerales sulfurados de cobre
ESPECIES % PESO %S %CU %Fe
CALCOPIRITA 99,68 22,87 34,49 30,30
COVELINA 0,22 0,05 0,14
ENARGITA 0,10 0,02 0,05 0,01
TOTAL 100,00 22,94 34,68 30,31

Asociaciones mineralgicas de sulfurados de cobre (por especies)
ESPECIES Libre
Asoc.
Gn. Asoc. Py
Inclu.
Gn.
Inc.
Py/Gn TOTAL
CALCOPIRITA 93,09 2,19 3,84 0,77 0,11 100,00
COVELINA 50,00 50,00 100,00
ENARGITA 100,00 100,00

Asociaciones mineralgicas de sulfurados de cobre (% Cu)
ESPECIES Libre
Asoc.
Gn. Asoc. Py
Inclu.
Gn.
Inc.
Py/Gn TOTAL
CALCOPIRITA 32,11 0,76 1,32 0,27 0,04 34,49
COVELINA 0,07 0,07 0,14
ENARGITA 0,05 0,05
TOTAL 32,23 0,83 1,32 0,27 0,04 34,68

Grado de liberacin de cobre
Libre Asociado Ocluido TOTAL
92,91 6,20 0,89 100,00


Anlisis mineralgicos concentrado
calcopirtico.
TRFLP
Mina Subterranea y a rajo
abierto

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Investigacin y Desarrollo

LEY
Muestra S
%
Cu
%
Fe
%
As
%
Ag
g/T
Au
g/T
Cl-
%
CaCO3
%
Si
%
Concentrado Rougher 29.93 17.75 26.04 0.02 29.40 3.95 0.08 2.88 3.29

Muestras Pre
Lixiviado
Leyes
S CuT FeT Cl- As Ag Au CaCO3 Si
% % % % % g/T g/T % %
Termfilos (Ripios) 29.66 17.75 25.48 0.081 0.016 34.9 4.09 2.96 3.21
Moderados (Ripios) 29.93 17.05 26.04 0.081 0.019 29.4 3.95 2.88 3.29
Mesfilas (Ripios) 30.1 16.95 25.46 0.081 0.019 31.5 3.74 2.84 2.96
Termfilos(Cuartiza) 29.61 16.95 25.82 0.088 0.018 28.4 3.24 2.87 3.06
Moderados (Cuartiza) 30.04 17.15 26.24 0.075 0.019 28.6 4.24 2.88 2.78
Mesfilas (Cuartiza) 30.1 17.25 26.36 0.075 0.020 30.1 4.08 2.94 2.83

B) pre-lixiviados mediante agitacin cida.frrica (10grL/Fe
3+
)

A) Recibido


Caracterizacin qumica de los
concentrados calcopirticos

Vista panormica del deposito de ripios de biolixiviacin dispuesto en Planta Biocobre.
En la actualidad Planta Biocobre dispone de ms de 7 Millones de Toneladas de Ripios de biolixiviacin en 5 niveles o
bancos superpuestos de 10 mts de altura cada uno. Muestras de estos ripios fueron lavadas y seleccionadas
granulomtricamente ( 3 a 12 mm) para ser usadas como matriz soporte en pruebas de biolixiviacin en columnas de
concentrados de flotacin de mineral de calcopirita.
1
2
3
4
5
clonamiento

Muestra
Roca Soporte
Leyes
S CuT FeT Cl- As Ag Au CaCO3 SiO2
% % % % % g/T g/T % %
Ripios 3.34 0.41 11.39 0.102 0.007 3.3 0.14 1.76 25.01
Cuarzo 0.03 0.00 0.00 0.012 0.002 0.0 0.0 0.27 99.58

Anlisis qumicos de la fraccin utilizada de
ripios de lixiviacin (Biocobre) y de las muestras
de Cuarzo utilizados como roca soporte.
Determinacin mediante tecnica de Digestin cida y determinacin de minerales mediante
espectrometra de Absorcin Atmica (AAS)
(a)
(c)
(b)
(d)
Imgenes de muestras de los minerales utilizados en pruebas de biolixiviacin.
Como roca soporte (a,b) y del concentrado calcopirtico (c), utilizado en las pruebas de biolixiviacin en columnas.
Imgenes del mineral de Ripio lavado del desecho lixiviacin de Planta Biocobre (a), de mineral de cuarzo lavado (b), del
concentrado calcopirtico recibido (c). Vista superior del concentrado ya aglomerado sobre roca soporte (d), y cargado en
la columna de biolixiviacin.
termocupla
controlador
Aire
CO
2
2%
Agitacin
300 rpm
3 L /min
Pulpa:
5 % slidos
pH < 1,5
Volumen total 50 L
Volumen operacin 35L
Bafles polipropileno
cinta calefactora
aislante trmico
Reactor
polipropileno
Hlice
Acero inoxidable
burbujeador
Concentrado Aglomerado
12 L /hr/m
2
Anlisis
pH, Eh, Cu T, Fe T, cido
Solucin percolacin
Aire
CO
2
2%
Solucin riego
Concentrado
calcopirtico
Roca
Soporte
Bomba
peristltica
bolitas de
polipropileno
bolitas de
polipropileno
Anlisis Gas
Consumo O
2
Cinta calefactor
Termocupla
Controlador
2 L / min.

Ajuste pH =1,5
Columna polipropileno
1mm
Aislante
clonamiento

REACTORES % INCULO
MESFILO
% INCULO
MODERADO
% INCULO
EXTREMO
MESFILOS 50% 25% 25%
TERMFILOS
MODERADOS
25% 50% 25%
TERMFILOS
EXTREMOS
25% 25% 50%

La inoculacin de las experiencias se realizo en dos etapas:
1.- Inoculacin primaria, en la etapa de aglomeracin en la pulpa de los
concentrados agregada sobre las distintas matrices de roca soporte a una
densidad de siembra de 1,5 X10
7
clulas por gramo de concentrado.

2.- En las soluciones de riego de las columnas a una densidad de inoculacin de
1,5 X10
8
Clulas por ml de solucin. En ambos casos la densidad celular fue
determinada mediante conteo de microorganismos por microscopia de luz en
una cmara de Petroff Houser.


Inoculacin de las experiencias
Protocolo de Inoculacin:

1. Pruebas de lixiviacin Batch:
Reactor de tanque agitado

2. Pruebas en columnas


3. Anlisis moleculares
Resultados


A)
B)
C)
D)
Resultados de las pruebas de biolixiviacin por Agitacin a 38, 49 y 69C. (valores promedio de
pruebas en duplicado).
A) % de disolucin de Cu en la pulpa; B) Concentracin de Fe (gr./l) en la pulpa, C) Variacin en el pH en la pulpa, D) Variacin del
Potencial Electroqumico (Eh respecto al electrodo de platino) en la pulpa. Condiciones operacionales, de 5% slidos de
concentrado calcopiritico 17,5 % Cu, 35 lts totales de operacin, agitacin (300rpm) y efectuadas a temperaturas Mesoflicas,
Termoflicas Moderadas y Termoflicas Extremas ( 38, 49 y 69 C, respectivamente).
Oxidacin de Cu sulfurado (%), a partir de anlisis de slidos en columnas de biolixiviacin.
Datos obtenidos a partir de muestras slidas a 38, 64, 84 y 96 das de operacin mediante digestin cida de minerales
muestreados de pruebas realizadas a temperaturas de operacin de microorganismos Termfilos, Moderados y Mesfilos (70, 50
y 38 C respectivamente) de concentrado calcopirtico de flotacin aglomerado sobre matriz soporte de ripios de lixiviacin lavados o
bien sobre mineral de cuarzo lavado.
A)
B)
Concentracin de Cu (A) y Fe (B) (gr./l) disuelto en las soluciones de biolixiviacin recirculadas por cada columna, medio
mediante AAS.
Concentraciones obtenidas mediante AAS de soluciones de percolacin obtenidas de pruebas de biolixiviacin de concentrado
calcopirtico aglomerado sobre matriz soporte de ripios lavados de lixiviacin o sobre mineral lavado de cuarzo. Experiencias
realizadas a temperaturas de operacin caractersticas de microorganismos Termfilos, Moderados y Mesfilas (70, 50 o 38C
respectivamente).
B)
A) C)
D)
Parmetros Cinticos de las solubilizacin de cobre y fierro en experiencias en columnas, en relacin a la variacin de pH y de Potencial
electroqumico Eh del medio lixiviante.
A) % de disolucin de Cu; B) % de disolucin de Fierro; C) Variacin del pH y D) Variacin de Potencial Electroqumico Eh en la solucin de
biolixiviacin de cada columna. Datos generados partir del anlisis de las soluciones de biolixiviacin de cada una de las columnas mediante AAS ( A
y B) y mediante medicin con electrodo de pH Ag/AgCl (para C) y electrodo de Platino ( para D). Muestras tomadas y o medidas de cada una de las
soluciones percoladas provenientes de las columnas cargadas con concentrados calcopirticos aglomerados en torno a una partcula soporte de
Ripios o de cuarzo y biolixiviadas a temperaturas propias de microorganismos Mesfilos, Termfilos Moderados y Termfilos Ext remos
A)
B)
C)
D)
Resultados

de proyecciones de la cinticas industriales de procesamiento de mineral a partir de los datos de consumos y de disolucin
de Cu por columna.
A) consumo de cido Total por columna; B) Proyeccin del consumo Neto de cido; C) Tasa (en % diario) de solubilizacin de cobre por columna.
D) Proyeccin tasa diaria de consumo de cido por tonelada de concentrado al da. Proyeccin de consumos Netos en plantas de SX-EW a tres
distintas temperaturas de operacin del proceso de biolixiviacin (Termo, Mod y Meso equivalentes a 70, 50 y 38C respectivamente),
concentrados aglomerados sobre matriz de ripios de lixiviacin lavados o sobre mineral lavado de cuarzo. Calculado a partir de valores de consumo
total de cido en pruebas de biolixiviacin menos los equivalentes cidos derivados del crdito estimado de cido generado en la etapa de electro
depositacin del ctodo de cobre. (1,54 kg H2SO4 por kg de ctodo electro depositado).
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Consorcio de Cultivos Mesfilos (25-45C)
- 5 gr. Calcopirita
- 5 gr. Rougher
- 1 gr. Azufre
- 400 ml Medio Basal + 25g/L sulfato ferroso
33C
Cultivo precipitado durante 30 min. Cultivo homogenizado
4 semanas
de cultivo
Se toma solo el sobrenadante Se toma del Homogenizado
50 ml
por tubo
50 ml
por tubo
4000 rpm 90 min
4000 rpm 90 min
El pellet fue lavado
con agua cida ( X3)
El pellet fue lavado
con agua cida ( X3)
El pellet fue lavado con
PBS-Tween 20 ( X3)
El pellet fue lavado con
PBS-Tween 20 ( X3)
Centrifugar en Speed Vac para
secar el pellet, 40 min
Centrifugar 13.000 rpm 3 min
0.5 gr para Kit MoBio
Pellet para
Kit Wizard
OBTENCIN DNA GENMICO
Pellet para
Kit MoBio
Extraccin de DNA
metagenmico
1000 pb
1500 pb
M
a
r
c
a
d
o
r

M
e
s

f
i
l
o
s

(
M
o
B
i
o
)


T
e
r
m

f
i
l
o
s

M
o
d
e
r
a
d
o
s

(
M
o
B
i
o
)


T
e
r
m

f
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l
o
s

E
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t
r
e
m
o
s

(
M
o
B
i
o
)


T
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r
m

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l
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E
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(
W
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z
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d
)


T
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m

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E
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s

(
B
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)


A
c
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d
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t
h
i
o
b
a
c
i
l
l
u
s

f
e
r
r
o
o
x
i
d
a
n
s

M
a
r
c
a
d
o
r

500 pb
Una vez estandarizada las
condiciones de PCR se procedi a
amplificar el gen 16S rDNA para los
distintos consorcios bacterianos
mesfilos, termfilos moderado y
termfilos extremo.
Electroforesis en gel de agarosa 1%.




1 2 3 4 5 6 7
1000 pb
1500 pb
M
a
r
c
a
d
o
r

(
1
0
0

p
b
)

M
e
s

f
i
l
o
s

(
M
o
B
i
o
)


T
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r
m

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l
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M
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d
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s

(
M
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B
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)


T
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l
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E
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(
M
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B
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)


T
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(
B
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)


T
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E
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m
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(
W
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z
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r
d
)


A
c
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d
i
t
h
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o
b
a
c
i
l
l
u
s

f
e
r
r
o
o
x
i
d
a
n
s

(
M
o
B
i
o
)

Reaccin en cadena de la polimerasa
PCR
500 pb
Acidithiobacillus ferrooxidans aportado por C. Jerez
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M M M M TM TM TM TM
Hae III
MspI AluI HhaI
Leader (bp)
50 100
Visualizacin de los Patrones de los patrones de RFLP
de productos de PCR del 16s rDNA de mesfilos (M) y
termfilos moderados (TM) extrados de pruebas de
tanque agitado y digeridos con cuatro enzimas
distintas
Gel de acrilamida teido con plata. Lneas (1) leader 50bp, 2) HaeIII mesfilo, 3) HaeIII t. moderado, 4) MspI mesfilo,
5) MspI t. moderado, 6) AluI mesfilo, 7) AluI t. moderado, 8) HhaI mesfilo, 9) HhaI t. moderado, 10) leader 50bp, 11)
leader 100bp. En crculos rojos se muestran las bandas que parecieran ser compartidas entre los distintos
tratamientos (mesfilas y termfilos moderados).
Estudio de las comunidades biolixiviantes
Clonamiento y secuenciacin.
Muestra de algunos de los patrones de RFLP digeridos
con HaeIII de muestras de los 16S rDNA clonadas.
Los patrones de RFLP obtenidos fueron utilizados para determinar el factor de cobertura de la biblioteca
de clones creada. Patrn leader de 50 pb en primera y ltima banda , imgenes muestran el nmero de placa de
petri chequeada y nmero del clon de la respectiva placa , se incorpora letra que adjudica el patrn de corte a un
ribotipo especfico de acuerdo a la placa chequeada.

TABLA VI:
Caracterizacin de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud
con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.

INOCULOS T_RFLP in silico
Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Identidad
E
N Acceso Hae III HhaI AluI
Inoculo Meso 2-.28 Sulfobacillus disulfidooxidans 99,5
0
U34974 152 225 232
Inoculo Meso 2-.42 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5
0
DQ909079 308 262 289
Inoculo Meso 2-.43 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 93,1
0
AB089844 137 71 239
Inoculo Meso 2-.8 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5
0
CP001132 170 206 275
Inoculo Meso 2-.82 Uncultured Sulfobacillus 95,7
0
EF612379 217 149 318
Inoculo Meso 2-.92 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5
0
CP001219 251 203 232
Inoculo Meso 5-.17 Acidithiobacillus ferrooxidans 96,1
0
DQ529309 169 204 276
Inoculo Meso 5-.2 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,2
0
CP001219 251 203 232
Inoculo Meso 5-.44 Acidithiobacillus ferrooxidans 95,8
0
DQ676505 251 203 232
Inoculo T. Ext 9-.39 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 99,4
0
AB089845 130 140 178
Inoculo T. Ext 11-.17 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 99,8
0
AB089844 130 140 177
Anlisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciacin de los 16SrDNA amplificados
a partir de muestras de DNA genmico de pulpas de experiencias de lixiviacin en matraces, 5% p/v concentrado
calcopirtico.
TABLA VI:
Caracterizacin de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud
con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.

TANQUE AGITADO T_RFLP in silico
Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Id
E
N Acceso Hae III HhaI AluI
Batch Meso 30A Acidithiobacillus caldus 98,2
0
DQ470072 215 563 231
Batch Meso 33A Leptospirillum ferriphilum 96,4
0
DQ 534052 190 376 218
Batch Meso 34A Thermophilic bacterium 97
0
EF199989 216 563 230
Batch Meso 35A Uncultured Leptospirillum 88,7
2,43E-120
FJ890907 143 328 171
Batch Mod 15B Leptospirillum ferriphilum 93,7
0
DQ 534052 145 329 172
Batch Mod 40B Sulfobacillus thermosulfidooxidans 95,4
0
EU499919 130 140 177
Batch Mod 50B Curvibacter lanceolatus 95,6
0
GU368379 220 207 368
Batch Mod 19B Cupriavidus metallidurans 98,1
0
CP000352 203 70 157
Batch T.Ext 46C Cupriavidus metallidurans 98,5
0
CP000353 203 70 157
Batch T.Ext 56C Leptospirillum ferriphilum 96,7
0
NR_028818 127 137 202
Batch T.Ext 58C Leptospirillum ferriphilum 96,9
0
DQ534052 190 563 230
Batch T.Ext 59C Leptospirillum ferriphilum 98,1
0
AF356830 197 328 224
Batch T.Ext 68C Acidithiobacillus caldus 97,7
0
EU499920 216 503 230
Anlisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciacin de los 16SrDNA
amplificados a partir de muestras de DNA genmico de pulpas de experiencias de lixiviacin en tanques agitados 5% p/v
concentrado calcopirtico.

TABLA VI:
Caracterizacin de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud con las
secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.
COLUMNAS CONCENTRADO CALCOPIRITICO T_RFLP in silico
Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Identidad
E
N Acceso Hae III HhaI AluI
Ripio Meso 1-.29 Acidithiobacillus ferrooxidans 97,5
0
FN400770 251 203 232
Ripio Meso 1-.33 Acidithiobacillus ferrooxidans 100
0
DQ676505 251 203 232
Ripio Meso 1-.38 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,9
0
AM502931 251 203 232
Ripio Meso 4-.24 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5
0
CP001132 170 206 275
Ripio Meso 4-.39 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,9
0
CP001219 251 203 232
Ripio Mod 14-.16 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,4
0
CP001132 170 206 275
Ripio Mod 14-.23 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,4
0
DQ909079 308 262 289
Ripio Mod 14-.65 Acidithiobacillus ferrooxidans 98,8
0
CP001219 251 203 232
Ripio Mod m75 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,8
0
DQ676505 251 203 232
Ripio Mod m77 Acidithiobacillus albertensis 99,3
0
NR_028982 251 203 274
Ripio Mod m78 Acidithiobacillus ferrooxidans 100
0
AM502931 232 186 212
Cuarzo Mod 3-.40 Acidithiobacillus thiooxidans 97,2
0
EU084706 226 181 207
Cuarzo Mod 3-.41 Acidithiobacillus thiooxidans 99,8
0
EU084705 226 180 207
Cuarzo Mod 8-.11 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,6
0
CP001219 251 203 232
Cuarzo Mod 8-.41 Acidithiobacillus albertensis 99,9
0
NR_028982 251 203 232
Ripio T. Ext 12-.49 Acidithiobacillus ferrooxidans 97,7
0
AM502931 251 203 232
Ripio T. Ext 12-.64 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,6
0
CP001132 170 206 275
Anlisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciacin de los 16SrDNA
amplificados a partir de muestras de DNA genmico de slidos de experiencias de lixiviacin en Columnas 20 % p/p
concentrado calcopirtico.
2.- Amplificacin
por PCR de genes
16S rRNA
3.- Digestin con enzimas de
restriccin
1.- Toma de muestras y extraccin de DNA
4.- secuenciacin y deteccin de
fragmentos marcados
5.- Ploteo de resultados
6.-Asignacin de acuerdo a TRFLP in
Silico.


T-RFLP
Anlisis de los fragmentos por electroforesis capilar
Estudio de las comunidades biolixiviantes
(e)
(b)
(g)
(d)
(a) (c)
(f)
(i) (h)
A. ferrooxidans 251 nt..
A. tiooxidans 226 nt. A. ferrooxidans 203 nt.
A. ferrooxidans 232 nt.
A. albertensis 274 nt.
S. disulfooxidans 230 nt.
L. ferriphillum 376 nt.
C. matalidurans 157. nt
A. ferrooxidans sp 170.
L. ferriphillum 190 nt.
Representacin de los perfiles de T-RFLP de las secuencias de 16S rDNA extradas de los consorcios crecidos en las
pruebas de biolixiviacin en columnas aglomeradas en torno a Ripios de biolixiviacin como roca soporte.
Abundancia relativa (%) de T-RFLP de 16S rDNA obtenidos utilizando las endonucleasas HaeIII (a,d,g), Hha I (b,e,h) y Alu I ( c,f,i).
Perfiles de T-RFLP obtenidos de experiencias en condiciones de operacin Mesoflicas (a,b,c) , Termoflicas Moderadas (d,e,f) y
Termoflicas Extremas ( g,h,i). Flechas rojas corresponden a asignacin de Grupo segn TRFLP in silico con cada endonucleasa
estudiara y fueron obtenidos mediante secuenciacin de 16S rDNA clonales.

(a)
(c)
(e) (f)
(d)
(b)
A. ferrooxidans 251 nt.
A. ferrooxidans 170 nt..
A. tiooxidans 226 nt.
A. caldus 215 nt.
L. Ferriphillum 145 nt.
S. termosulfooxidans 130 nt.
C. metalidurans 203 nt.
L. Ferriphillum 190 nt.
L. ferriphillum 190 nt.
A. tiooxidans 232 nt.
Representacin de los perfiles de T-RFLP de las secuencias de 16S rDNA extradas de los consorcios
crecidos en las pruebas de biolixiviacin.
Abundancia relativa (%) de T-RFLP de 16S rDNA obtenidas de Tanques agitados (a,c,e) y de columnas aglomeradas en
torno a Ripios de biolixiviacin como roca soporte (b,d,f). Perfiles de T-RFLP obtenidos utilizando endonucleasa Hae III.
Perfiles de T-RFLP obtenidos a partir de experiencias en condiciones de operacin Mesoflicas (a,b) , Termoflicas
Moderadas (c,d,) y Termoflicas Extremas ( e,f). Flechas rojas corresponden a asignacin segn TRFLP in silico para HaeIII
obtenidos mediante secuenciacin de 16S rDNA clonales.
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Imgenes (SEM) Muestras de cuarzo recubierto a 90 das de operacin.
Micrografa electrnica de barrido (SEM) de la superficie de cuarzo recubierto en concentrado calcopirtico al final del peri odo
de biolixiviacin en columna (90 das). Imgenes obtenidas de los biofilms a distinta magnificacin ( de acuerdo a escala en
cada imagen) generados en condiciones Mesoflicas 38 ( a,d), Termoflicas Moderadas 50 (b,e) y Termoflicas Extremas 69
C (c,f).
Las recuperaciones de Cobre estn relacionadas con la
temperatura de operacin de los reactores sean estos de tanque
agitado o de concentrados aglomerados sobre distintas matrices
minerales.

En las pruebas de biolixiviacin en columna a temperaturas
hipertermoflicas las recuperaciones de cobre se correlacionan con
potenciales electroqumicos moderados en relacin a los
alcanzados en condiciones mesoflicas y termoflicas moderadas.

Las diferentes temperaturas de operacin pueden alterar
significativamente tanto la riqueza de especies como su
abundancia pero no causan una fuerte alteracin en la estructura
de las comunidades bacterianas presentes, sobretodo al tratarse
de experiencias en columnas.


Recapitulando
Independientemente de las temperaturas de operacin las
comunidades que provienen de experiencias en columnas tienden
a mantenerse estables, pero las comunidades provenientes de
experiencias en tanques agitados y matraces presentan fuertes
cambios en su composicin dependiendo de la temperatura de
operacin.

Las comunidades estaban mayormente dominadas por bacterias
del genero Acidithibacillus y Sulfobacillus no importando la
temperatura de operacin aplicada.

Los compuestos de iones frricos precipitados sobre las partculas
de mineral en condiciones hipertermoflicas y termoflicas
moderadas actan como estructurador de los biofilms efecto que
no se aprecia al trabajar en condiciones mesoflicas.


Recapitulando
H
2
O
pH 7
NAD(P)H

NAD(P)

H
+
H
+
H
+
ADP + Pi

ATP

FeSO
4
+ CuSO
4
+ S
+ H
2
SO
4
H
2
SO
4
SO
4
=
Fe SO
4
H
+
C
u
F
e
S
2

Fe
3+
SO
4
Fe
2
(SO
4
)
3
pH 1,5
Temperatura 70C
pH 7
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
O
2
Acidithiobacillus ferrooxidans

Muchas Gracias.