Potechnka dzka

Wydza Chemczny
INSTRUKCJA do WICZENIA
Podstawy hodowli komrk !wir!"#y#h$
%&asi# o' a(imal #lls #)lt)r*
Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y$
rali!owa(,o w rama#h Zada(ia (r --.
/o0osa1(i la+oratori)m 0(2 Polimry i
(a(omatria3y w mdy#y(i$
Instrukc| opracowaa:
dr n med. Ac|a K. Oe|nk
dz, 2009
u. Zwrk 36, 90-924 dz Pro4kt rali!owa(y w rama#h Priorytt) I5 6 /!ia3a(i 72- 6 Podd!ia3a(i
72-2-2
www. fe.p.odz.p pn. Przygotowanie i realizacja nowych kierunkw studiw
te. 042 278 45 31 w odpowiedzi na wspczesne potrzeby rynku pracy
042 638 38 26 i wymagania gospodarki opartej na wiedzy
SPIS TRE8CI
-2 CE9 WICZENIA %Aim o' st)dis*................................................................3
:2 WPR;WA/ZENIE %I(trod)#tio(*.................................................................3
<2 PRZE&IE= WICZENIA %Pro#d)r*..........................................................15
3.1. A0arat)ra 0omiarowa............................................................................. 15
3.2. Wyko(a(i >wi#!(ia.............................................................................. 16
72 ;PRAC;WANIE SPRAW;Z/ANIA %R0ort*..............................................19
4.1. Cl >wi#!(ia............................................................................................ 19
4.2. ?todyka.................................................................................................. 19
4.3. Wy(iki........................................................................................................ 19
4.4. ;0ra#owa(i wy(ikw............................................................................ 19
@2 9ITERATURA %R'r(#s*......................................................................... 19
A2 PBTANIA SPRAW/ZAJCCE %Pro+lms*......................................................20
D2 EEEKTB KSZTAFCENIA %9ar(i(, o)t#oms*..........................................20
7.1. Co st)d(t 0owi(i( wid!i>...............................................................20
7.2. Co st)d(t 0owi(i( )mi>...................................................................20
G2 TE9EE;NB A9AR?;WE %Emr,(#y ()m+rs*......................................20
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 2
-2 CE9 WICZENIA %Aim o' st)dis*
Ceem cwczena pn. ,Podstawy hodowli komrk !wir!"#y#h"
reazowanego w ramach Zadana 11 |est zapoznane studentw z technkq
zakadana hodow komrkowych z zawesny komrek zamrozonych w
cekym azoce - n komrkowych, prowadzenem hodow oraz
pasazowanem komrek. Rwnoczesne student zapozna s z nnym
rodza|am hodow komrkowych, sprztem aboratory|nym warunkam
pracy w warunkach |aowych.
:2 WPR;WA/ZENIE %I(trod)#tio(*
Hodowe (kutury) komrkowe ma|q za zadane utrzymac zywe komrk,
a ceem w |akm sq tworzone |est poznawane boog komrek, badane
mechanzmw ch rzncowana, badane ch genomw, a takze
wykorzystane komrek |ako modeu zywego organzmu. W aboratorach
komrk z hodow stosu|e s do badan toksykoogcznych,
dermatoogcznych czy medycznych, np. w ceu sprawdzena wpywu
nowych zwqzkw chemcznych (potenc|anych ekw) na komrk. W
przemyse botechnoogcznym stosu|e s |e do produkc| substanc|
stosowanych |ako ek w medycyne, np.: przecwca, baek
enzymatycznych, skompkowanych zwqzkw organcznych (ktrych
synteza chemczna byaby drozsza) ub wektorw wrusowych do terap
genowe|.
Naezy |ednak pamtac, z zachowane komrek w hodow choc
zbzone |est |ednak nne nz ch zachowane w organzme. |est to skutkem
wyzoowana ch z tr|wymarowe| struktury tkanek, a co za tym dze
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 3
unemozwene kontaktw wascwych da przestrzenne| struktury tkank
wy|scowe|.
Wyrznamy kka rodza|w hodow komrkowych w zaeznosc od
pochodzena skadu komrek zaozyceskch.
W hodowach pomorcznych, ktre pochodzq z zawesny rznorodnych
komrek wykazu|q one tendenc|e do organzowana s w sposb
przypomna|qcy sytuac| in vivo. Monokutury, hodowe |ednego typu
komrek, rosnq w |edne| warstwe, a komrk ne otrzymu|q wszystkch
sygnaw bodzcw wysyanych przez zozone srodowsko tkank ub
narzqdu. Monokutury sq bardzo stotnym narzdzem suzqcym do badan
podstawowych funkc| komrkowych danego typu komrek, natomast
pokutury mogq wskazywac kerunek rozwo|u rzncowana s komrek
w tkance. Mozna wec powedzec, z pokutury sq modeem epe|
ukazu|qcym in vitro zaeznosc z|oogczne zachodzqce w tkankach nz
monokutury. Naezy |ednak wzqc pod uwag fakt, z w hodowach In vtro
bardzo czsto dochodz do seekc| komrek. W wynku tego przezywa|q 1
ub 2 typy komrek, a wwczas wee nterakc| komrkowych uega
zmanom ub cakowce zanka. Datego wykorzystu|qc w badanach
rznego typu hodowe komrkowe naezy pamtac, z hodowe in vitro sq
tyko modeam systemw in vivo, a ne dokadnym ch odwzorowanem.
Bardzo czsto w czase zakadana hodow badanach nad komrkam
wykorzystu|e s ustaone ne komrkowe. Hodowe okresonych n
komrkowych suzq gwne do przeprowadzana badan screenngowych
dotyczqcych toksycznosc badanych produktw wzgdem zywych
organzmw pozwaa|q na zastqpene w tego typu testach zwerzqt.
Prowadzene hodow komrkowych/tkanek wykorzystywane ch w
badanach pozwaa na scsq kontro srodowska (pH, temperatur,
csnene osmotyczne, csnene tenu dwutenku wga), mozwosc
utrzymana warunkw z|oogcznych na staym pozome, bezposredne
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 4
oddzaywane na zywe komrk (np. wprowadzane rznorodnych
substanc| w okresonym, staym stzenu w otoczene komrek), badane
funkc| reaktywnosc okresone| grupy komrek, bezposredne badane
nterakc| pomdzy komrkam wchodzqcym w skad tkanek ub
narzqdw, powtarzanosc wynkw (mne|sze| w przypadku pokutur, a
bardzo wysoke| w przypadku n komrkowych) oraz zdecydowane
nzszym kosztam prowadzena badan nz w przypadku korzystana ze
zwerzqt aboratory|nych, a takze ne narazane zwerzqt na mozwe, a
nepotrzebne cerpene zyczne psychczne.
Pommo tych cznych newqtpwych zaet kazdy badacz pownen
zdawac sobe spraw, z stosowane hodow komrkowych ma swo|e
ogranczena o ktrych ne mozna zapomnec.
W czase zakadana prowadzena hodow komrkowych naezy
przestrzegac scse regu pracy w warunkach |aowych, uzyskane hodowe
komrkowe to tyko modee upraszcza|qce warunk naturane zyca
komrek w organzme, gdze otoczone weoma nnym komrkam
wchodzq z nm w nterakc|e. W przypadku hodow perwotnych moze
dochodzc do po|awena s nestabnosc komrek w hodow, a same
komrk wykazu|q krtk okres przezywana (ang. fe span). Natomast
hodowe n cqgych choc wykazu|q s neogranczonym wzrostem
bardzo czsto tracq swo|e charakterystyczne cechy wynka|qce ze
zrzncowana komrek.
W badanach aboratory|nych zwaszcza bomedycznych stosu|e s
rznego rodza|u modee komrkowe. Hodowl 0irwot( to hodowe,
ktre wywodzq se z komrek wyzoowanych bezposredno z tkanek ub
narzqdw. Tego rodza|u hodowe wyda|q s na|korzystne|sze |es
potrzebne |est zachowane zaeznosc tkanka/organ karotypu normane|
komrk. Wadq hodow perwotnych |est stosunkowo krtk czas
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 5
przezywana komrek w hodow. Odzwerceda to sytuac|e in vivo
naturane starzene s organzmu tkanek. Innym rodza|em hodow
komrkowych sq hodowe przy ktrych zakadanu wykorzystu|e s
)stalo( di0loidal( li(i komrkow, ktre mozna utrzymac przy
zycu przez kka mescy, a czasem at, ecz po okresone| czbe pasazy
komrk starze|q s obumera|q. Lczba podzaw zaezy od rodza|u
narzqdu z ktrego wywodz s na komrkowa, typu hodowanych
komrek oraz weku organzmu z ktrego poberano tkank do zakadana
n komrkowe|. CiI,3 li(i komrkow sq to komrk
charakteryzu|qce s neokresonym czasem zyca. Komrk pochodzqce z
cqgych n komrkowych na|czsce| sq popodane sq pochodzena
nowotworowego, co zapewna m mozwosc neokresone| czy podzaw.
Cqgq n komrkowq mozna takze uzyskac z komrek prawdowych w
wynku ch transformac|, czy zmany materau genetycznego.
Hodowe ustaonych n komrkowych cqgych n komrkowych
okresamy manem hodowli wtr(y#h. Rwnoczesne komrk z hodow
perwotnych po perwszym pasazu sta|q s hodowam wtrnym
ustaonych n komrkowych.
W ceu zaozena hodow komrkowe| zarwno komrk wyzoowane
bezposredno z tkanek/narzqdw, |ak komrk n ustaonych ub cqgych
naezy umescc w odpowednch naczynach warunkach tak aby uzyskac
optymane warunk da prawdowego wzrostu hodowanych komrek, czy
ch namnazana. Mozna to robc zakada|qc hodowe |ednowarstwowe ub
hodowe zaweszone w pyne.
Aby uzyskac hodowl 4d(owarstwow (stac|onarne) naezy
zawesn uzyskanych komrek rozdzec do pastykowych sterynych
naczyn hodowanych (ryc. 1) nkubowac w odpowednch warunkach da
danego typu komrek (na|czsce| w temperaturze 37C, atmosferze 5%
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 6
CO
2
przy 95% wgotnosc). Komrk przyke|a|q s do powerzchn
naczyna, dzeq s rosnq w postac po|edyncze| warstwy (ang.
monoayer). Proces ten trwa od 24 do 120 godzn w zaeznosc od typu
komrek. Warunkem nezbdnym do rozwo|u prawdowe| hodow
|ednowarstwowe| |est zdonosc komrek do przyegana do podoza. W ten
sposb mozemy hodowac tyko komrk adherentne, czy wykazu|qce
zdonosc do adhez| (przyegana). W przypadku hodowli komrk
!awis!o(y#h w 03y(i komrk do prawdowego wzrostu ne muszq
wykazywac adherenc|. Prawdowy rozw| zapewnony |est przez
utrzymane ruchu pozywk hodowane|. Komrk nkubu|e s w spec|anych
naczynach z wbudowanym meszadem magnetycznym wosekam
porusza|qcym zawesn komrkowq (ryc. 1). Do hodow stosu|e s
spec|ane pozywk tzw. pyny spnerowe, ktre ne zawera|q |onw
magnezu wapna (sprzy|a|q przyke|anu komrek do podoza).
Naczyna do hodow |ednowarstwowych
Buteka z meszadem do hodow
komrek zaweszonych w pyne (Spnner
ask)
Ryc. 1 aczynia hodowlane.
Wkszosc komrek zwerzcych wymaga do wzrostu w hodow in vitro
przyke|ena s do podoza staego, czy sq to komrk adherentne.
Natomast komrkam neadherentnym sq ne wywodzqcym s z
komrek krw.
Wszystke komrk charakteryzu|q s okresonym cykem wzrostu. W
przypadku komrek adherentnych cyk ten obrazowany |est przez tzw.
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 7
kr!yw w!rostow, w ktrych przedstawa s zaezny od czasu hodow
wzrost osc komrek. Lczene komrek rozpoczyna s od momentu
zaozena hodow prowadz przez co na|mne| dzesc koe|nych dn.
Wzrost komrek adherentnych w hodow in vitro przechodz trzy
charakterystyczne fazy, tzw. faz: la,, lo, oraz sta#4o(ar(I2
Perwsza faza (la,) nastpu|e po przenesenu zawesny komrek do
nowego naczyna hodowanego. W faze te| komrk adaptu|q s do nowych
warunkw srodowska, odbudowu|q gkokaks, znszczony w wynku
trypsynzac| przyczepa|q s do dna naczyna hodowanego. Iosc komrek
w hodow ne zwksza s, ponewaz ne zachodzq |eszcze podzay
komrkowe. Dopero po przyke|enu s do dna naczyna, komrk wchodzq w
faz G
1
cyku podzaowego. Faza ag trwa od kku do kkunastu godzn w
zaeznosc od rodza|u n komrkowe|.
Nastpna faza - lo,, charakteryzu|e s ntensywnym podzaam
komrkowym, dzk czemu czba komrek w hodow moze zwkszyc s
nawet kka razy. Komrk zna|du|q s w ogarytmczne| faze wzrostu, dzeq
s ntensywne, az do cakowtego pokryca dna naczyna hodowanego, po
czym ch podzay usta|q w wynku kontaktowego zahamowana wzrostu.
Czynnkem mtu|qcym wzrost komrek moze byc takze zuzyce skadnkw
odzywczych podoza oraz nagromadzene toksycznych produktw
przemany mater.
W faze sta#4o(ar(4 czba komrek w hodow ne zwksza s.
Pokrywa|q one cae dno naczyna hodowanego (hodowa konuentna).
Nastpu|e szybke zuzyce skadnkw odzywczych podoza oraz
nagromadzene toksycznych produktw przemany mater. Hodowa
zaczne obumerac, |eze ne dostarczy s komrkom me|sca do
wzrostu oraz swezego podoza hodowanego.
Pasa 1owa(i hodowli
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 8
Podczas pasazu komrk odke|one od dna naczyna hodowanego,
rozcencza s w odpowednm stosunku w swezym podozu przenos do
nowych naczyn hodowanych. Pasazowane zapewna cqgosc wzrostu
n komrkowe| oraz pozwaa na namnozene pu komrek
nezbdnych do badan. Czstosc pasazowana gstosc wy|scowa
hodow |est zaezna od rodza|u n komrkowe|. Brak reguarnego
pasazowana moze wywoac obumarce komrek, a tym samym utrat
hodowane| n.
Zamra 1a(iJ ro!mra1a(i i 0r!#howywa(i hodowli komrkowy#h
Mozwosc zamrazana komrek w cekym azoce pozwaa na
przechowywane ch przez wee at w danym aboratorum. Dzk
bankow tkanek zapewnony |est stay dostp do materau boogcznego,
w raze |ego utraty w wynku, np.: zakazena grzybczego, baktery|nego
ub uszkodzena sprztu. Ponadto, w przypadku n komrkowych o
okresone| czbe podzaw, zamrozona pua komrek o nskm pasazu,
gwarantu|e wykonywane badan na komrkach o wysoke| se
proferacy|ne| zawsze tym samym pasazu.
Mozwosc zamrazana komrek przyczyna s takze do stworzene
komercy|nych bankw n komrkowych. Na|bardze| znanym
na|wkszym koekc|am na swece sq: Europe|ska Koekc|a Ln
Komrkowych - ECACC, (ang. European Coecton of Anma Ce Cuture)
Amerykanska Koekc|a Hodow Komrkowych - ATCC (ang. Amercan
Type Cuture Coecton). Bank te zawera|q wee n komrkowych
pochodzqcych z tkanek ponad 45 gatunkw zwerzqt, w tym wee n
wyprowadzonych z prawdowych oraz nowotworowych tkanek udzkch.
Wszystke dostpne w koekc|ach ne przechodzq testy |akoscowe oraz
procedury dentykacy|ne. Zapewna to wysokq |akosc oraz czystosc
komercy|ne dostpnych n komrkowych. Ponadto, do kazde|
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 9
zakupone| hodow doqczony |est szczegowy ops dane| n
komrkowe| (pochodzene, morfooga, karotyp, pasaz, wymagana
wzrostowe, wrazwosc na wrusy).
W trakce zamrazana, komrk mogq zostac uszkodzone przez
krysztak odu, ktre powsta|q podczas obnzana temperatury.
Rozrywa|q one wewntrzne struktury komrkowe, co znaczne obnza
zywotnosc zamrazane| hodow. Z tego wzgdu, podoze do zamrazana
komrek, oprcz medum odpowednego da dane| n komrkowe|,
pownno zawerac substanc|e dzaa|qce ochronne na komrk, tzw.
kroprotektanty. Na|czsce| uzywanym sq: DMSO (dwumetyosufotenek)
gcero, stanowqce zwyke do 10% ob|tosc podoza. W skad pozywk
wchodz tez surowca (20% ub wce|), ktra chron komrk podczas
zamrazana.
Zamrazane komrk pownny mec prawdowq morfoog. Hodowa
pownna byc wona od zakazen charakteryzowac s wysokq zywotnoscq
(> 90%). Zamrazane naezy wykonywac przed osqgncem stanu
konuenc| (tzw. hodowa semkonuentna), ponewaz komrk zna|du|q s
wtedy w ogarytmczne| faze wzrostu. Optymana gstosc zamrazane|
zawesny komrek pownna wynosc 10
6
-10
7
komrek/m.
Podczas zamrazana, komrk naezy schadzac bardzo powo,
obnza|qc temperatur z szybkoscq 1C na mnut, az do osqgnca
temperatury mnus 70C. Nastpne, naezy przenesc ampuk do par
azotu (temperatura -80C) na 12 godzn, po czym umescc |q w
rezerwuarze z cekym azotem (dewary) w -196C (ryc. 2).
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 10
Ryc ! Pojemniki do przechowywania komrek"prbek w ciekym azocie.
Hodow mozna przechowywac przez wee at bez utraty |e|
zywotnosc. Przez krtszy okres (do kku mescy) komrk mozna
przechowywac w temperaturze -80C, pamta|qc, ze w tych warunkach
zywotnosc hodow uega znacznemu obnzenu.
Po wy|cu ampuk z rezerwuaru z cekym azotem, naezy odczekac
okoo 2 mnut (odparowane azotu z powerzchn ampuk), a nastpne
rozmrozc |q bardzo szybko, wstawa|qc do azn wodne| o temperaturze
37C. Take warunk mnmazu|q ryzyko uszkodzena komrek w trakce
rozmrazana oraz sq optymane da zachowana wysoke| zywotnosc
hodow.
War)(ki 0rowad!(ia hodowli komrk in vitro
Komrkom wyzoowanym z |e| tkankowego otoczena ub pochodzqcym
z zamrozonych n komrkowych umeszczonym w hodow naezy
zapewnc srodowsko, ktre bdze zastpowao warunk panu|qce in
vivo. Hodowa komrek in vitro wymaga przede wszystkm zachowana
sterynych warunkw, srodowska wzrostu o optymane| temperaturze
wgotnosc, |ak rwnez dostarczena komrkom nezbdnych do zyca oraz
proferac| skadnkw odzywczych.
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 11
Zastosowane komory z amnarnym przepywem powetrza zapewna
zachowane sterynych warunkw podczas pracy z komrkam. Powetrze,
ktre wchodz do komory, przechodz przez spec|ane try w ten sposb
zosta|e oczyszczone z bakter oraz zarodnkw grzybw, co zapobega
wkszosc nfekc|.
Srodowsko wzrostu o optymane| temperaturze wgotnosc, |ak
rwnez odpowedne stzene CO
2
zapewna|q nkubatory przeznaczone do
hodow komrek. Optymana temperatura wzrostu zaezy od rodza|u n
komrkowe|. Wkszosc n komrkowych wyseekc|onowanych z
organzmw staocepnych, w tym komrk pochodzena udzkego,
wymaga do wzrostu temperatury 37C. Przekroczene te| wartosc zarwno
w kerunku nzszych, |ak wyzszych temperatur moze mec mne| ub
bardze| nekorzystny wpyw na komrk utrzymywane w hodow (komrk
ssacze sq w stane przezyc kka dn w temperaturze 4C, natomast w
temperaturze 39,5C przezy|q zaedwe
kka godzn).
Optymana wgotnosc srodowska wzrostu w przypadku komrek
udzkch nowotworw pownna byc utrzymywana na pozome 95%,
natomast zachowane wascwego stzena CO
2
(5 - 10%) w nkubatorze
przeznaczonym do hodow komrek |est nezwyke stotne da zapewnena
odpowednego pH pozywk hodowane|. Wkszosc komrek wymaga pH
pozywk w grancach 7,2 - 7,4, co pocqga za sobq konecznosc
zastosowana systemu buforu|qcego. Obecne na|czsce| stosowany |est
tzw. system ,naturany", gdze pH utrzymywane |est dzk rwnowadze
pomdzy gazowym CO
2
dostarczanym do nkubatora z zewnqtrz, a |onam
CO
3
2-
HCO
3
-
pochodzqcym z so wodorowganowe| dodawane| do
pozywk. System ten, w przecwenstwe do systemw chemczne| reguac|
pH, ne wymaga wysokch nakadw nansowych |est netoksyczny w
stosunku do komrek. Ze wzgdu na fakt, z pH pozywk |est |ednym z
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 12
krytycznych parametrw, komercy|ne dostpne meda hodowane
zawera|q w swym skadze rwnez wskaznk pH. |ednym z na|czsce|
stosowanych wskaznkw |est czerwen fenoowa, ktra nada|e pozywce
okresonq barw w zaeznosc od |e| pH (barwa: purpurowa - pH 7,8;
czerwona - pH 7,4; pomaranczowa -pH 7,0; zta - pH 6,5) (ryc. 3).
Ryc. # $miana barwy po%ywki hodowlanej w zale%no&ci od jej p' (barwa: purpurowa -
pH 7,8; czerwona - pH 7,4; pomaranczowa -pH 7,0; zta - pH 6,5)
Pozywk hodowane stosowane da okresonych n komrkowych rznq
s medzy sobq proporc|am poszczegnych komponentw czsto
wymaga|q dodatkowego uzupenena o specyczne skadnk (np.
wtamny ub amnokwasy). Mmo to, ogny skad pozywek hodowanych
|est nastpu|qcy: wgowodany, amnokwasy, peptydy, proteny, kwasy
tuszczowe, pdy, soe neorganczne, wtamny oraz surowca.
Wglowodany - stanowq gwne zrdo energ w medach
hodowanych. Na|czsce| stosowane sq gukoza gaaktoza, |ednak
nektre rodza|e komrek wykazu|q epszy wzrost na pozywkach
zawera|qcych matoz ub fruktoz. W przypadku standardowych pozywek
uzywanych do hodow komrek nowotworowych in vitro, stzene cukru
mesc s w grancach od 1 do 4.5 g/.
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 13
Aminokwasy, peptydy i biaka - sq wykorzystywane przez komrk
|ako podstawowy matera buducowy. Baka spena|q np. funkc|e
transportowe ub tez suzq komrkom |ako czynnk wzrostu.
Kwasy tuszczowe i lipidy - dostarczane sq do pozywk gwne z
surowcq. Choestero sterody sq nekedy nezbdne do utrzymana
wzrostu oraz proferac| okresonych typw komrek hodowanych na
podozach bez dodatku surowcy.
Sole nieorganiczne - |ony tych so pomaga|q utrzymac odpowedne
csnene osmotyczne, a takze borq udza w reguac| potenc|au
bonowego komrek dzk dostarczanu katonw potasowych, sodowych
wapnowych oraz stanowq ko faktory enzymw. Soe neorganczne sq
rwnez nezbdne da prawdowego oddzaywana komrek z matrks
zewnqtrzkomrkowq. Do pozywek hodowanych dodawane sq rwnez soe
tzw. perwastkw sadowych, takch |ak cynk, medz czy seen, ktry
odgrywa stotna ro w procese usuwana wonych rodnkw tenowych.
Witaminy - sq prekursoram bqdz kofaktoram enzymw komrkowych.
Wee wtamn, szczegne z grupy B, ma stotne znaczene da wzrostu
proferac| komrek utrzymywanych w hodow in vitro. Na|czsce|
dodawane do pozywek wtamny to:
ryboawna, tamna botyna.
Surowica - wkszosc pozywek stosowanych do hodow komrek
nowotworowych wzbogacana |est 5 - 10% (v/v) dodatkem bydce|
surowcy podowe| (FBS), ktra stanow zozonq meszann weu mkro-
makroboczqsteczek. Surowca zawera czynnk hormony stymuu|qce
wzrost komrek, czynnk adhezy|ne, baka nosnkowe weu hormonw,
soe mnerane, pdy, baka oraz wgowodany. Neutrazu|e ona efekty
toksyczne np. meta czkch, a takze zapobega zmanom srodowska,
takm |ak np. zmana pH.
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 14
Czstosc wymany pozywk zaezy od osc komrek ch metabozmu,
zazwycza| przy wymane podoza wymena s poow medum.
<2 PRZE&IE= WICZENIA %Pro#d)r*
W perwszym etape rozmrozc komrk zawesc w odpowedne|
pozywce przenesc do naczyn hodowanych. Wykonac pasazowane
hodow komrkowe| (komrek L929 - myse brobasty) - hodowa
przygotowana 4 dn przed cwczenem. Przeprowadzc obserwac|e
mkroskopowe komrek na rznych etapach procesu (komrk w
zawesne, komrk swezo umeszczone w naczynu hodowanym, komrk
przed pasazowanem).
<2- A0arat)ra 0omiarowa
S0r!"t.
Po|emnk do przechowywana w cekym azoce (dewar);
azna wodna;
Komora z amnarnym przepywem powetrza;
Inkubator z dopywem CO
2
;
Ppetor automatyczny;
?atria3y i od#!y((iki.
Lna komrkowa - komrk L929 - Sgma z ECACC;
Naczyna hodowane - NUNC;
Probwk - NUNC;
Butek steryne;
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 15
Podoze hodowane Dubecco's Moded Eage Medum (DMEM) -
Invtrogen;
Surowca podowa ceca (Feta bovne serum - FBS) - Invtrogen;
Antybotyk - Invtrogen;
2mM L-gutamna - Invtrogen;
0,25 % roztwr trypsyny z dodatkem 0,53 mM EDTA -
Invtrogen;
Akoho do odkazana - zopropano;
Roztwr so z|oogczne| (PBS) (w/o Mg, Ca) - Invtrogen;
<2: Wyko(a(i >wi#!(ia
Przed przyst)pieniem do wykonywania *wicze+ z komrkami,
1. Zaz fartuch aboratory|ny;
2. Wqcz szaf amnarnq przygotu| me|sce do pracy (czyszczene
powerzchn 70% akohoem);
3. Umy| rce mydem pynem odkaza|qcym;
4. W czase pracy w komorze amnarne| zakada| rkawczk ateksowe;
PA?IKTAJ
ws!ystki 0ra# doty#!I# komrk wyko()4 w komor!
lami(ar(4
Ro!mra1a(i komrk
Przed przyst)pieniem do rozmra%ania hodowli- przygotuj,
1. Ampuk z zamrozonq hodowq komrkowq;
2. Steryne ppety;
3. Ppetor automatyczny;
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 16
4. Podoze hodowane competed DMEM (cDMEM) - 100m;
(odmerz do 100m szkane| butek: 89m podoza DMEM, 1m 2mM L-
gutamny, 100 meszanny antybotykw 10m surowcy podowe|
FBS);
5. azn wodnq (temperatura 37C);
6. Akoho - zopropano do przecerana probwk;
Pro#d)ra ro!mra1a(ia hodowli komrkow4.
1. Wy|qc probwk z zamrozonq hodowq z rezerwuaru z cekym
azotem (PAMIETA| o zaozenu okuarw ochronnych rkawc);
2. Odczekac okoo 2 mnut az probwka ,przestane parowac";
3. Umescc po|emnk z zamrozonym komrkam w azn wodne|
(ne wono zamoczyc nakrtk ampuk) - trzymac probwk za
pomocq psety;
4. Bezposredno po rozmrozenu (brak krysztaw odu w ampuce),
przenesc probwk do komory amnarne|;
5. Zdezynfekowac korek probwk akohoem;
6. Odkrcc za pomocq ppety steryne| przenesc zawesn
komrek do naczyna hodowanego (powerzchna 25cm
2
);
7. Uzupenc pynem odzywczym do ob|tosc 5 m;
8. Umescc naczyne hodowane w nkubatorze w temperaturze 37C
z 5% przepywem CO
2
wgotnoscq 95%;
9. Po 24 godznach hodow scqgnqc cae podoze z naczyna
hodowanego;
10. Uzupenc hodow swezym podozem - 5 m;
11. Umescc naczyne hodowane w nkubatorze w temperaturze
37C z 5% przepywem CO
2
wgotnoscq 95%;
Pasa 1owa(i hodowli komrk adhr(t(y#h
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 17
Przed przyst)pieniem do pracy przygotuj,
1. Wyrosntq hodow komrek L929 - zna|du|e s w nkubatorze
hodowanym;
2. Naczyna hodowane (pastykowe butek o powerzchn 25 cm
2
);
3. Steryne ppety;
4. Ppetor automatyczny;
5. Zbuforowany roztwr so z|oogczne| (PBS) (bez |onw
wapna magnezu);
6. 0,25 % roztwr trypsyny z dodatkem 0,53 mM EDTA;
7. Podoze hodowane cDMEM;
8. Po|emnk porceanowy na odpady;
Pro#d)ra 0asa1owa(ia hodowli komrkow4
1. Ogrzac roztwr trypsyny, podoze hodowane oraz PBS do temperatury
poko|owe|;
2. Po obe|rzenu hodow komrkowe| pod mkroskopem swetnym,
za pomocq steryne| ppety usunqc zuzyte podoze;
3. Hodow przepukac 3 m roztworu PBS bez |onw wapna magnezu;
4. Usunqc PBS, a do naczyna hodowanego dodac 1 m roztworu
trypsyny z EDTA;
5. Opukac hodow, a nastpne usunqc roztwr enzymu -
pozostawa|qc w naczynu - 300 enzymu;
6. Hodow naezy wstawc do cepark nkubowac w temperaturze
37C do czasu odke|ena s komrek od dna naczyna (okoo 1-3
mnuty);
7. Po odke|enu komrk zawesc w 4 m pozywk hodowane|;
8. Przenesc 2 m zawesny komrek do nowe| butek;
9. Uzupenc w obu butekach pyn hodowany do ob|tosc 5 m;
10. Umescc naczyna hodowane w nkubatorze hodowac w
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 18
37C z 5% przepywem CO
2
.;
72 ;PRAC;WANIE SPRAW;Z/ANIA %R0ort*
72-2 Cl >wi#!(ia
Tekst
72:2 ?todyka
Charakterystyka obektu badan, ops stosowane| metodyk oraz
warunk prowadzena hodow.
72<2 Wy(iki
Ze wzgdu na specyk cwczena, wynk opera|q s o wykonane
zd|c zaozonych hodow, a nastpne poczenu gstosc komrek
Zarwno zd|ca |ak czene komrek odbywac s bdze na nastpnych
za|cach.
7272 ;0ra#owa(i wy(ikw
W opracowanu pownna znaezc s dokumentac|a (w forme zd|c)
wykonane| hodow. Ze wzgdu na ne wykonywane pomarw brak |est
matematycznego opracowana wynkw.
@2 9ITERATURA %R'r(#s*
|1| Stokosowa S., (red.), Hodowa komrek tkanek: praca zborowa,
PWN, Warszawa 2004.
|2| Freshney R.I., Cuture of Anma Ces, Wey-Lss, 2005.
|3| Harrson M.A., Rae I.F., Genera technques of ce cuture, Cambrdge
Unversty Press, 1997.
|4| Fundamenta technques n ce cuture. A aboratory handbook,
SIGMA, 2002.
A2 PBTANIA SPRAW/ZAJCCE %Pro+lms*
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 19
1. W |ak sposb mozna odkec komrk od podoza?
2. Co to sq komrkowe ne cqge?
3. Co pownna daczego zawerac standardowa pozywka hodowana?
4. Opsz |ak wykonu|e s rozmrazane pasazowane komrek.
D2 EEEKTB KSZTAFCENIA %9ar(i(, o)t#oms*
D2-2 Co st)d(t 0owi(i( wid!i>
znac rodza|e hodow komrkowych;
omwc warunk da hodow komrek adherentnych;
D2:2 Co st)d(t 0owi(i( )mi>
Rozmrozc komrk do hodow;
Zaozyc hodow komrkowq
Pasazowac (przenosc komrk do nowych naczyn
hodowanych);
Ocenc stan hodow w mkroskope;
G2 TE9EE;NB A9AR?;WE %Emr,(#y ()m+rs*
a. Pogotowe ratunkowe: 999
b. Straz pozarna: 998
c. Poc|a: 997
d. Straz me|ska: 986
e. Pogotowe cepowncze: 993
f. Pogotowe energetyczne: 991
g. Pogotowe gazowe: 992
h. Pogotowe wodocqgowe: 994
. Numer aarmowy z teefonu komrkowego: 112
Laboratorum pn Elm(ty +iolo,ii i mdy#y(y reazowane w ramach
Zadana nr 11 20