Pruebas de Genotoxicidad. Utilizando Allium cepa.

Fiskesjo. 1994.
Anlisis de Aguas.
Anlisis de agua potable.
Aguas residuales, lodos.
Agua de origen industrial.

Temperatura para el crecimiento de los bulbos de 20C. Sin exposicin a la luz del sol.
El tiempo del muestreo es de 48 horas. (Corte de la punta de raz, y preparacin de
lminas.)
Para cada concentracin de muestra se utilizan de 3-5 rplicas.
Variables de respuesta: Rompimiento de cromosomas, c-mitosis. (aneuploida: cambios
en el nmero de cromosomas. )

Medio de Crecimiento.

Componente Concentracin (mM)
Ca(NO3)2 1,0
KNO3 2,0
MgSO4.7H2O 1,0
KH2PO4 1,0
Fe-EDTA.3H2O 0,2
Elementos Traza Concentracin (M).
MnSO4 3,64
CuCl2 0,48
NaMoO4 0,0078
ZnSO4 0,0042
H3BO3 3,7
pH: 7.0.

Agua de dilucin para el control negativo.

PH 7.0; Contenido de Ca y Mg de 50-70 mg/L.

Solventes.

Agregados para mejorar la prueba de genotoxicidad ya que ayudan a diluir las sustancias
qumicas no solubles en el agua.

Ejemplo: Metanol 1%. (0,25M)

Bulbos.

1,5 cm de dimetro.
Prevencin del secado de las races con agua potable.
Materiales.
Tubos de 10cm de largo, con 1,5 cm de dimetro.
Gradilla, Cuchillo, pinzas, secante, Pipetas de 5mL, Laminas, Laminillas, (Cover Glass cement) ,
Lmparas de alcohol.
Orcena en Acetico. (2% de orecena en 45% de cido actico)
Para fijar las lminas prepararon 9 partes de cido actico al 45% y una parte de cido clorhdrico
1M. la conservacin de las lminas la llevan a cabo en 3 partes de alcohol y 1 parte de acido
actico concentrado.
Papel de Filtro Whatman . Embudo. Erlenmeyer de 1.5L. Botella oscura con capacidad de 200mL.

Preparacin de Orceina.
1. 5g de Orceina.
2. 150mL de cido actico concentrado.
3. 150mL de agua destilada.
4. Calentar el cido actico.
5. Aadir Orceina.
6. Calentar (no ebullicin)
7. Almacenar de 2-3 das. Cubrir la botella con papel aluminio, mezclar la botella varias veces
al da.
8. Aadir agua destilada.
9. Filtrar la solucin. Almacenar en una botella oscura a temperatura ambiente.

Bao Mara.
Congelador.
Microscopio de Luz.

Almacenamiento de las cebollas.
Los bulbos de las cebollas se almacenan en condiciones secas a una temperatura de 10C a 20C.
PARA PRUEBAS DE CRECIMIENTO 10 CEBOLLAS POR CONCENTRACIN. PARA OBSERVAR EFECTOS
MICROSCOPICOS SE UTILIZA DE 3-5 CEBOLLAS PARA CADA CONCENTRACIN.

Lectura de la mitosis: 48 horas. Usando un cuchillo de la punta de la raz las escamas externas
amarillo parduzcas. Manteniendo los primordios intactos. Despus de eso preparar las rplicas
segn el experimento. Secar los bulbos, y poner en contacto los primordios con el lquido. Reponer
agua cada 24 horas o cuando el nivel del lquido baje.
Calentar agua a 50C.
Preparar 9:1 cido actico/cido clorhdrico. Aadir 2-3mL a los tubos de prueba y colocar los
tubos en el bao de agua. Despus de 48 horas transferir de dos a tres races de 1-2 cm a una
solucin fijadora caliente. Y mantener por 5 minutos. Limpiar las races con papel.
Resultados.
ndice Mittico. (control 40-50 clulas en mitosis por cada 1000 clulas)
Toxico de Referencia: Cloruro de Cadmio. Colchicina (c-mitosis)
Cepa Utilizada: Allium cepa. Ocho pares de cromosomas,


Grant. 1982.
Sumergir los bulbos en el lquido a un cuarto de la profundidad de acuerdo a la longitud del bulbo.
Para facilitar aireacin.
Fijacin.
cido actico en alcohol al 95% (1:3) 30 minutos a 24 horas. Almacenamiento en refrigerador en
alcohola al 70%.
Reactivo de Schiff. Especfico para DNA, se obtiene cromosomas de color magneta.
1. Hidrlisis en acido clorhdrico 1N a 60C por 5 minutos.
2. Coloracin con el reactivo de Feulgen por dos horas.
3. Tcnica de Feulgen.
Obtencin de las races.
Colocar las races en 0,2% de colchicina. Por una hora a temperatura ambiente. (inhibidor
de la mitosis que destruye las fibras del huso mittico)Aumento del estado de metafase.
Ausencia de anafase. Ventaja : en metafase los cromosomas son distinguibles.
Fijar con solucin de Carnoy a 60 por 5 minutos.
Enjuagar con agua destilada.
Hidrlisis con cido clorhdrico 1N a 60C por 12 minutos.
Lavar con agua destilada.
Colorear con Tincin de Fuelgen 1-2 horas en el refrigerador.
Lavar con agua destilada.
Cubrir con Euparal.