Medios de cultivo, Condiciones de cultivo y Crecimiento bacteriano.

15 de noviembre de 2011

1 Microbiologa, Clase 3

Condicin de Cultivo.
El primer concepto es condicin de cultivo, corresponde a los parmetros fsicos y qumicos que
influyen en el crecimiento bacteriano. Estas condiciones pueden ser por ejemplo la temperatura la
presin pH.
Condiciones fsicas
Temperatura
Las bacterias viven en diversos rangos de temperatura:
Psicrfilas: bacterias que se desarrollan en el rango de 0C hasta 30C, siendo su ptimo
15C. Algunos ejemplos son las bacterias marinas y bacterias del suelo.
Mesfilas: estas crecen entre 25C y 50C, con un ptimo de 37C. La mayora de ellas son
bacterias corporales, viven en nuestra piel o en nuestros rganos internos.
Termfilas: bacterias que se desarrollan entre 45C y 95C, su temperatura ptima es
65C; se pueden encontrar en aguas termales o en geiseres.
Con el tiempo esta escala se fue quedando chica, ya que se fueron descubriendo microorganismos
que viven bajo 0C o sobre los 95C, y se crearon los siguientes trminos: psicrotolerante,
termotolerante, hiperpsicrfilos e hipertermfilos.
Psicrotolerantes: son bacterias termfilas que pueden tolerar temperaturas propias de las
psicrfilas. El que pueda tolerar estas temperaturas significa que no crece en este rango,
tienen un metabolismo muy bsico, no hay reproduccin de la bacteria, solamente est en
estado de latencia, esperando que las condiciones de temperatura vuelvan a ser
favorables.
Termotolerantes: bacterias mesfilas que pueden tolerar temperaturas de las termfilas.
Hiperpsicrfilos: bacterias que crecen en el rango de -1C a -50C. Son bacterias polares,
ese es su hbitat natural.
Hipertermfilas: bacterias que crecen en volcanes, entre 96C hasta los 150C.
Para darle la temperatura que las bacterias necesitan en microbiologa se usan las cmaras de
cultivo, que se puede ajustar a la temperatura que requieran las bacterias, por ejemplo, una
bacteria del genero Rhizobium es una bacteria de suelo que crece a 23C (psicrfila), otro ejemplo
es una del genero Pseudomona, que crece a 37C (mesfilas), estas temperaturas se pueden
mantener constantes gracias a estas cmaras.


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Requerimientos de oxgeno
De acuerdo a los requerimientos de oxigeno las podemos clasificar en aerobias obligadas,
anaerobias estrictas, anaerobias facultativas y microaeroflicas.
Las aerobias obligadas necesitan de oxgeno para poder vivir, las anaerobias estrictas no necesitan
de oxgeno, porque les es txico, las anaerobias facultativas pueden vivir en presencia o ausencia
de oxgeno, y las microaeroflicas requieren en la atmosfera un 5 a 10% de CO
2
(sobre el que ya
existe).
Las bacterias aerobias obligadas, como necesitan oxgeno, se cultivan en placas o tubos al interior
de cmaras de cultivo, que adems de otrgales la temperatura adecuada, alberga la cantidad de
oxigeno que estas bacterias necesitan para poder crecer.
Las bacterias anaerobias estrictas no necesitan oxgeno, por lo tanto hay que deshacerse del
oxgeno que est presente all. Antiguamente se utilizaban jarras de vidrio, cuya caracterstica
principal era que en la parte superior tenan una boquilla a la que se poda conectar una manguera
con la cual se poda extraer el oxgeno del interior y se poda agregar una mezcla de gases para
hacer una atmosfera anaerobia, adems se poda medir con un barmetro la presin de estos
gases al interior de la jarra. Actualmente se utilizan unas jarras que se llaman jarras de
anaerobiosis, son similares a los termos (distintos tamaos, hechas de plstico) y funcionan de la
siguiente manera: primero de depositan las placas de cultivo al interior de esta, luego se agrega un
sachet que contiene una sustancia que al aadirle un poco de agua va a liberar H
2,
y este
hidrgeno va a reaccionar con el O
2
del interior de la jarra y va a formar agua, as la atmsfera al
interior de la jarra queda libre de oxgeno.
Para las microaerofilas una tcnica casera es colocar las placas o tubos al interior de un frasco
junto con una vela, que consume parte del oxgeno que est adentro del frasco (no todo), y
adems producto de la combustin se libera CO
2
cuya cantidad se asume es el 5 a 10% superior
requerido. Podra decirse que esta tcnica es muy poco cientfica, pero si quiere hacerlo ms
cientfico hay que recurrir a estas jarras de anaerobiosis y aadir 5% de CO
2
.
pH
La mayora de las bacterias crece en pH cercano al 6 hasta 8,5, pero tambin hay bacterias
excepcionales que crecen a pH 1, 2 y 3, estas bacterias son del genero Thiobacillus y estas oxidan
el azufre a sulfato, posteriormente este sulfato reacciona con el agua del ambiente y forma cido
sulfrico. En contraposicin encontramos bacterias que crecen a pH bsico, vale decir de 12 a 13,
estas bacterias crecen en suelos ricos en CaCO
3
.
Concentracin de sal
Se usa en cultivo de bacterias marinas.

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3 Microbiologa, Clase 3

Medios de Cultivo
Tipos de nutricin
Para disear un medio de cultivo se debe tener en cuenta los tipos de nutricin de las bacterias
que se van a cultivar, estos tipos de nutricin hacen referencia a tres parmetros claves: la fuente
de energa que puede ocupar un microorganismo, el dador de hidrgenos y la fuente de carbono.
De acuerdo a la fuente de energa se pueden separar en dos grupos:
Fottrofas, que utilizan como fuente de energa la luz solar.
Quimiotrofas, que utilizan compuestos qumicos (orgnicos o inorgnicos) como fuente de
energa.
Por su parte de acuerdo al dador de hidrogeno tambin se pueden clasificar en dos grupos:
Litotrofas, que ocupan como donadores de hidrogeno compuestos inorgnicos (NH
3
, NH
4
,

etc.).
Organotrofos, que ocupan como donadores de hidrogeno compuestos orgnicos (Hidratos
de carbono, protenas, lpidos, etc.).
De acuerdo a la fuente de carbono, se pueden agrupar en 2 grupos:
Auttrofas, su fuente de carbono es el CO
2
(fuente inorgnica) y a partir de este sintetizar
compuestos orgnicos (como glucosa).
Hetertrofos, que necesitan de compuestos orgnicos preformados.
Se pueden formar nombres como el siguiente: quimioorganohetertrofo, quimiolitoauttrofo,
quimiolitohetertrofo, fotoorganohetertrofo.
Los humanos, si nos clasificramos bajo estos patrones seriamos quimioorganohetertrofos al
igual que Escherichia coli.
El medio de cultivo se define como un preparado lquido o slido que contiene todos los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos, adems de estar estril posee
un pH adecuado y estar protegido de la contaminacin.
Nutrientes
Los nutrientes necesarios en un medio de cultivo son: fuente de hidrgeno, un aceptor de
hidrgeno, una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno, sales minerales y factores de
crecimiento.



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La fuente de hidrgeno constituye la fuente de energa, en las bacterias organotrofas
generalmente es un azcar, en cambio en las litotrofas es un compuesto qumico reducido
(amonio, amonaco, entre otros). El aceptor de hidrgeno va a variar de acuerdo al tipo de
metabolismo que tenga la bacteria, las bacterias que llevan a cabo respiracin aerobia utilizan
como aceptor de H, el Oxgeno; las que realizan respiracin anaerobia utilizan compuesto distinto
al oxgeno como el NO
3
, el SO
4
, el CO
2
, etc. Las que llevan a cabo los procesos metablicos de
fermentacin utilizan compuestos orgnicos como el piruvato, alcoholes, NAD, FAD, entre otros.
La fuente de carbono; los auttrofos utilizan el CO
2
del ambiente, los hetertrofos utilizan el
carbono de compuestos orgnicos preformados.
La fuente de nitrgeno; la gran mayora de las bacterias puede utilizar compuestos inorgnicos
como orgnicos. Hay bacterias que utilizan nitrato de potasio, sulfato de amonio, cloruro de
amonio e incluso nitrito, hay otras bacterias que utilizan compuestos orgnicos como los
aminocidos, bases nitrogenadas y las peptonas. Tambin hay bacterias que fijan el nitrgeno
gaseoso del ambiente y luego lo transforma en aminocidos. Esto lo hacen bacterias de vida libre
o simbiticas.
Sales minerales, estas se pueden separar de acuerdo a su utilizacin por los microorganismos
en 2 grandes conglomerados, como son los macroelementos (P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe, etc.), estos
macroelementos se utilizan con distintas finalidades, por ejemplo P se utiliza como parte de los
cidos nucleicos, fosfolpidos, coenzimas, etc. El K, se utiliza en la bomba Na-K. Lo importante es
que son utilizadas en grandes cantidades a diferencia de las otras sales minerales denominadas
microelementos, que se utilizan en pequeas cantidades y cuya funcin principal es servir como
cofactores enzimticos (Cr, Co, Cu, Mb, Ni, Se, entre otros). Hay una serie de enzimas que
necesitan de estos elementos para poder funcionar, como por ejemplo las deshidrogenasas
inorgnicas requieren de Nquel.
Los factores de crecimiento se definen como compuestos orgnicos requeridos como precursor
o constituyente del material celular que un organismo no puede sintetizar, y lo debe tomar del
medio ambiente o ser suministrado en el medio de cultivo. Estos compuestos orgnicos que el
microorganismo no puede sintetizar corresponden a vitaminas esenciales, aminocidos esenciales,
bases pricas y pirimdicas.
De acuerdo a su capacidad para sintetizar estos factores de crecimiento las bacterias estn
agrupadas en dos grandes categoras:
Bacterias auxotroficas, que requieren de factores de crecimiento.
Bacterias prototroficas, que no requieren factores de crecimiento, porque son capaces de
sintetizar sus propios factores de crecimiento.


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Crecimiento bacteriano
Crecer se asocia con aumentar de peso o tamao, si bien las bacterias aumentan en peso y en
tamao es muy difcil poder discernir cuanto aumenta en peso una bacteria o en tamao. No se
puede medir cuanto creci o cuanto pes (una bacteria pesa 10
-13
gramos, como para que tengan
una idea y existen balanzas que permiten pesar una bacteria con esa precisin), pero desde el
punto de vista microbiolgico crecimiento bacteriano significa aumento del nmero de bacterias.
Este aumento en la poblacin se da en forma logartmica o exponencial, se representa por la
formula 2
n
, donde n representa el nmero de divisiones que ha tenido esta poblacin bacteriana.
Las bacterias se reproducen por fisin binaria.
El nmero total de bacterias en un cultivo es igual al nmero inicial de bacterias x 2
n
, donde n es
igual al nmero de divisiones.
N+ = N
i
x 2
n

Para calcular la n se utiliza:
log N+ = log N
I +
n log2
n



Con esto se puede calcular el nmero de divisiones que se han realizado. Esta frmula deriva de la
tasa de divisin, que se define como el nmero de divisiones por un tiempo en forma particular, es
decir, cuantas divisiones han ocurrido en una hora. El inverso de esta se denomina tiempo de
generacin, y corresponde al tiempo de generacin de una divisin, es decir, el tiempo que se
necesita para que ocurra una divisin. Por ejemplo el tiempo de generacin de E. coli en
laboratorio es de 20 minutos, cada 20 minutos la bacteria se replica.
Tasa de divisin (v):

Tiempo de generacin (g):

Recuento de Bacterias
Existen mtodos para contar el nmero de bacterias o en su defecto medir la masa de las
bacterias, estos parmetros sirven para determinar si creci la poblacin bacteriana.


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Recuento del nmero de bacterias totales
El nmero de bacterias puede ser un recuento total de bacterias, incluyendo vivas y muertas o
simplemente contar las que estn vivas. Para contar la totalidad de las bacterias existe un
contador celular, que consiste en un capilar muy fino que est unido a un registrador que emite un
haz luminoso, por lo tanto aqu hay sensores de detectan automticamente cuando pasa una
bacteria ya que interrumpe el haz luminoso, cuenta las vivas y muertas y tampoco discrimina entre
bacterias y partculas de polvo por lo que no es muy preciso.
Otro mtodo es a travs de la epifluorescencia, se necesita un microscopio que emita luz
ultravioleta y un colorante con el cual teir las bacterias (naranja de acridina), se llevan al
microscopio y se observan. Este colorante tie de un color verde las que estn vivas y de otro color
las que estn muertas (rosado, salmn o rojo).
Recuento del nmero de bacterias vivas
Otro mtodo bastante usado en microbiologa es el recuento en placa, con el mtodo de las
diluciones, para esto se necesita un matraz que contenga la muestra de bacterias, una batera de
tubos que pueden contener agua destilada o suero fisiolgico en volumen de 9 ml y pipetas para
hacer las diluciones. Se toma a partir de la solucin madre (en el matraz) 1 ml y se deposita en el
primer tubo, se agita bien y con una nueva pipeta se saca 1 ml de solucin de este tubo y se lleva
al tubo nmero 2, se repite el procedimiento con los siguientes tubos haciendo diluciones
seriadas. Estas diluciones seriadas tienen como objetivo ir disminuyendo el nmero de bacterias,
es decir en el ltimo tubo va a aparecer una mnima cantidad de bacterias. Una vez que estn
hechas estas diluciones seriadas se siembran en placas Petri con un medio de cultivo adecuado,
luego se toma 1 ml de la tincin respectiva y se aplica sobre estos cultivos. El paso siguiente es
introducir estas placas en una cmara de cultivo para que tengan una temperatura adecuada y
para que aparezcan sobre el medio de cultivo estos puntos visibles de crecimiento, que reciben el
nombre de colonias bacterianas y cada colonia se asume que se ha originado a partir de una sola
bacteria. El ltimo paso es contar las colonias bacterianas que surgieron en las placas, pero hay
una restriccin solamente se cuentan aquellas placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Estas
colonias luego se multiplican por el factor de dilucin, es decir de donde proviene esta solucin,
para calcular las Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
Masa bacteriana
La masa bacteriana tambin se puede usar como medida de crecimiento y se puede medir
obteniendo el peso seco o el peso fresco.
Peso fresco se obtiene por filtracin, se filtran las bacterias en solucin, y se pesan. Se debe
conocer el peso del filtro. Para obtener el peso seco, este filtro se debe secar en una estufa hasta
peso constante, y se vuelve a pesar. Estos pesos se miden en gramos de bacterias por ml (g/ml).
Segn textos es ms acertado determinar el crecimiento mediante la medicin de la masa
bacteriana que el nmero de bacterias.
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Cultivo esttico
Un cultivo esttico se define como aquel cultivo bacteriano al cual, durante su crecimiento, no se
le retiran los desechos pero tampoco se le aaden nutrientes frescos.
Curva de crecimiento
En este cultivo bacteriano esttico se distinguen distintas etapas, una fase de latencia, otra de
crecimiento exponencial, una fase estacionaria y finalmente la de etapa muerte. En cada una de
estas etapas le ocurre algo al medio de cultivo y a la poblacin bacteriana.
1. En la etapa de latencia la bacteria se nutre por absorcin, esta absorcin implica la
liberacin de exoenzimas por lo tanto la bacteria se tienen que adaptar al medio de cultivo
sintetizando las enzimas que va a utilizar para los nutrientes que estn presentes en el
medio de cultivo, adems tiene que sintetizar orgnulos como lo son ribosomas, flagelos,
que van a servir para su nutricin entre otras cosas. Al medio de cultivo en esta fase no le
ocurre nada y la velocidad de crecimiento de las bacterias es 0, no hay crecimiento.
2. La siguiente etapa es la de crecimiento exponencial, aqu la bacteria crece en forma
logartmica, comienza a dividirse, por lo tanto, toda su batera metablica est
plenamente activa. Aqu se empiezan a consumir los nutrientes del medio de cultivo y
adems se empieza a llenar con desechos metablicos. La velocidad de crecimiento en
esta etapa es la mxima.
3. Etapa estacionaria, aqu las bacterias no crecen, sobreviven en base a sus reservas, luego
a orgnulos que no utiliza. El medio de cultivo se llena an ms de desechos metablicos.
V = 0.
4. Etapa de muerte: mueren las bacterias y los desechos metablicos se siguen acumulando
en el medio de cultivo a causa de los cadveres de las bacterias. El crecimiento aqu es
negativo.
Cultivo continuo
Existe otro tipo de cultivo, el cultivo continuo, en este tipo se agregan ingredientes frescos cada
cierto tiempo y se van retirando los desechos metablicos o parte de estos, por lo tanto esta
poblacin bacteriana siempre est en crecimiento logartmico. Esta tcnica sirve desde el punto de
vista industrial. Se puede realizar en dos aparatos: un quimiostato, en cuyo interior est la
poblacin bacteriana y cada cierto tiempo se abre una llave que permite la entrada de nutrientes
frescos, pero tambin a travs de la entrada de nutrientes hay una salida del medio de cultivo, con
parte de la poblacin bacteriana, y de esta manera se mantiene una poblacin constante;
actualmente se usa un turbidostato, este se basa en la turbidez del cultivo, cada vez que el cultivo
presenta una turbidez esto sirve como seal para un circuito que manda un pulso elctrico a un
contenedor, el que deja pasar nutrientes al medio de cultivo. Esto es totalmente automtico.