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Oferta tecnolgica:

Modificacin selectiva de
biomolculas por mtodos
qumicos clsicos o
electroqumicos





















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Oferta tecnolgica:

Modificacin selectiva de biomolculas por mtodos
qumicos clsicos o electroqumicos




RESUMEN

El grupo Electroqumica aplicada y electrocatlisis ha desarrollado una
novedosa tecnologa que permite modificar selectivamente cualquier
biomolcula (enzimas, protenas redox, lipoprotenas, anticuerpos, etc.), tanto
por mtodos electroqumicos (por ejemplo, nitracin, cloracin, bromacin, y
iodacin en residuos de aminocidos de tirosina, u oxidacin de metionina),
como por mtodos qumicos clsicos. Entre las principales ventajas del uso del
mtodo electroqumico, destaca por ser muy selectivo y especfico, las
condiciones de reaccin son muy suaves, proporciona modificaciones
totalmente controlables, se mantiene la actividad y la estructura respecto a la
protena nativa y son mnimos o no aparecen subproductos. Tiene aplicaciones
en la inmovilizacin de biomolculas, como biosensores, biomarcadores, en la
sntesis de nuevos anticuerpos monoclonales y nuevos modelos de protenas
para el estudio de ciertas enfermedades patofisiolgicas (neurodegenerativas y
cardiovasculares), as como en modificaciones post-traslacionales en estudios
de Protemica.




DESCRIPCIN TCNICA

El grupo Electroqumica aplicada y electrocatlisis del Departamento de
Qumica Fsica de la Universidad de Alicante posee una gran experiencia y
habilidad en la modificacin selectiva de cualquier tipo de biomolcula
(enzimas, protenas redox, lipoprotenas, anticuerpos, etc.), tanto por mtodos
electroqumicos, como por mtodos qumicos clsicos.

Entre los actuales mtodos para modificar protenas, cabe destacar:

Ingeniera de protenas.
Modificacin qumica de los residuos de metionina, tirosina y lisina.
Tratamiento con aldehdos.





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Aplicacin de radiacin electromagntica.
Fotooxidacin.
Oxidacin electroqumica (directa o indirecta):
o Nitracin.
o Cloracin.
o Oxidacin de metionina.
o Iodacin.
o Bromacin.

La Ingeniera de protenas es una metodologa que permite la produccin de
protenas modificadas en cantidades sustanciales. As, es posible reemplazar,
por ejemplo, residuos especficos de tirosina en una cadena polipeptdica por,
quizs, unidades de fenilalanina; pero no es posible usarla para crear residuos
de nitrotirosina en la cadena.

Respecto a la modificacin qumica (con tetranitrometano, por ejemplo), sta
permite la formacin de unidades de nitrotirosina; sin embargo, el reactivo es
desagradable y txico, adems, no es particularmente selectivo si hay ms de
un residuo de tirosina que puede ser nitrado y, una vez que la reaccin ha
tenido lugar, es necesario separar el reactivo que no ha reaccionado (esto
puede ser difcil, especialmente cuando hay implicadas delicadas especies
bioactivas), eliminar los subproductos, y finalmente separar y purificar los
productos.

Con el objetivo de superar todos estos obstculos, el grupo de investigacin ha
desarrollado una novedosa metodologa de sntesis electroorgnica que
permite la modificacin selectiva de biomolculas. Entre sus principales
ventajas, se caracteriza por mantener a la protena en condiciones ms suaves
de reaccin, ya que la energa procede de la aplicacin de un potencial a un
electrodo y no de la reactividad de un agresivo agente qumico; adems, no
hay subproductos derivados de la presencia de reactivos qumicos, por lo que
no resulta necesario efectuar ninguna separacin adicional. Finalmente, la
reaccin se puede parar inmediatamente mediante el cese de la corriente, sin
necesidad de aadir sustancias que neutralicen los reactivos iniciales.
Consecuentemente, la modificacin electrosinttica de protenas y otras
especies bioactivas es un nuevo mtodo para la produccin de nuevas
funcionalidades en residuos de aminocidos especficos (tirosina, metionina,
triptfano, lisina, etc.) mediante nitracin, cloracin, oxidacin de grupos
sulfuro, iodacin o bromacin de varias protenas modelo, tales como lisozima,
mioglobina, citocromo c, anticuerpos, as como lipoprotenas de baja densidad
(LDL), consiguiendo gran especificidad, selectividad y control de la oxidacin.
No obstante, el grupo tambin tiene capacidad para llevar a cabo
modificaciones qumicas convencionales (nitracin, cloracin y oxidacin





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utilizando, por ejemplo, peroxinitrito o tetranitrometano, cido hipocloroso,
cido hipobromoso, perxido de hidrgeno, triioduro, etc.) en protenas o
lpidos.

Tcnicamente, es posible llevar a cabo la modificacin electroqumica selectiva
utilizando electrodos carbonceos, como por ejemplo un electrodo de diamante
dopado con boro (BDD), ya que es uno de los materiales que permite una
retencin de la actividad y la estructura de la protena igual o similar a la
protena nativa, sin contribuciones no deseadas atribuidas a las interacciones
electrodo-protena que s aportan otros electrodos, por ejemplo, el de platino.
Adems, la estabilidad fsica, qumica y electroqumica de los electrodos
carbonceos y en concreto el BDD los hacen especialmente interesantes en el
tratamiento de aguas residuales, electroanlisis y, por supuesto, en la qumica
de protenas y DNA.

La modificacin electroqumica de protenas tiene lugar en una celda
electroqumica segn el siguiente esquema:




Water-
cooling
W
e
, BDD
4 cm
2
R
e
Ag/ AgCl/ Cl
-
(3 M)

C
e
, stainless steel
disodiumtetraborate
0.050 M, pH 9.0
Adjusted with
boric ac.
1 mg.mL
-1
HEWL
disodiumtetraborate
0.050 M, pH 9.0
adjusted with boric acid.
Sodium nitrite 0.050 M

Se han encontrado protenas nitradas en residuos de tirosina en un amplio
rango de enfermedades: cardiovasculares, diabetes, ateroesclerosis, rechazo a
rganos transplantados, neurodegenerativas (Alzheimer, Parkinson,
Creutzfeldt-J akob, esclerosis mltiple), etc.






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Particularmente, la oxidacin de algunas protenas, tales como las lipoprotenas
de baja densidad (LDL), juega un papel crucial en el desarrollo de
enfermedades vasculares: arterosclerosis, infarto de miocardio y apopleja. El
nivel de oxidacin de las LDL puede ser un biomarcador de la presencia,
severidad y desarrollo de la enfermedad. Los agentes oxidantes ms comunes
son el peroxinitrito (ONOO
-
) y el cido hipocloroso (HOCl). Ambos son
producidos por las clulas endoteliales, neutrfilos y macrfagos. El cido
hipocloroso se forma a partir de perxido de hidrgeno y cloro en una reaccin
catalizada por la enzima mieloperoxidasa. El peroxinitrito, que se forma por una
reaccin rpida entre el ion superxido (O
2
-
) y el xido ntrico (NO), es
liposoluble y similar en reactividad al cido hipocloroso. Es un potente agente
de nitracin y de oxidacin de biomolculas, entre las que destacan las
protenas y los lpidos. Las dianas de estos efectos son los residuos de
cistena, metionina y triptfano en protenas, dando lugar, adems, a funciones
carbonil y ruptura inespecfica. Sin embargo, la principal diana son los residuos
de tirosina, hidroxilndose, dimerizando o ms frecuentemente, nitrndose. El
producto final es la 3-nitrotirosina, tanto libre como formando parte de
protenas. Esto hace que se pueda considerar como un biomarcador de la
produccin de peroxinitrito.

Las LDL pueden pasar por diferentes estados de oxidacin, teniendo diversos
efectos en la ateroesclerosis. Estudiando los mecanismos de oxidacin de las
LDL se pueden plantear estrategias en el tratamiento de la enfermedad.
Dilucidar el mecanismo de oxidacin in vivo es muy difcil, pues diversos
intermediarios de la reaccin que promueven la oxidacin de las LDL, como el
oxido nitroso, tienen vidas medias muy breves y son difciles de detectar. El uso
de una metodologa electrosinttica es una estrategia alternativa para
conseguir especificidad, selectividad y control en la oxidacin de las LDL,
determinando el papel de las posibles dianas (lpidos y protenas) pudiendo
finalmente relacionar el estado de gravedad de la enfermedad y el grado de
oxidacin de las LDL.

Por otro lado, los sensores electroqumicos destacan por ser una tecnologa
importante para detectar biomolculas en fluidos biolgicos, como por ejemplo
colesterol en LDL. El desarrollo de un bioelectrodo con este fin implica la
inmovilizacin de la colesterol oxidasa (ChOx), bien sea sobre un electrodo
modificado mediante monocapas autodepositadas (SAMs), o bien sobre
electrodos modificados con polmeros conductores. En cualquier caso, el
primer paso en el desarrollo de un bioelectrodo es la electronitracin de la
colesterol oxidasa. Por tanto, resulta fundamental un mtodo de modificacin
selectiva que no suponga una prdida de actividad enzimtica y que, al mismo
tiempo, permita una unin especfica con el SAM o los polmeros conductores





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unidos previamente al electrodo. En definitiva, la metodologa desarrollada por
el grupo de investigacin hace factible este desarrollo tecnolgico.

Adems, el grupo tiene los conocimientos tcnicos y la infraestructura
necesaria (Servicios Tcnicos de Investigacin de la Universidad de Alicante)
para llevar a cabo estudios de Espectroscopa UV-Vis, Espectrometra de
Masas (MALDI-TOF y ESI-FTICR), Resonancia Magntica Nuclear de Alto
Campo, Fluorescencia y Dicrosmo Circular entre otros, para conocer con
exactitud los cambios conformacionales, el grado de modificacin, la
selectividad y la especificidad, y correlacionar as las consecuencias
estructurales y funcionales derivadas del tratamiento electroqumico o qumico
como primer paso para entender cmo se produce el progreso de las
enfermedades con disfunciones patofisiolgicas.






Espectrmetro de RMN de 500 MHz (BRUKER AVANCE DRX500) de los Servicios
Tcnicos de Investigacin de la Universidad de Alicante

















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PRINCIPALES VENTAJAS DE LA TECNOLOGA


INCONVENIENTES DE OTRAS TCNICAS
INGENIERA DE PROTENAS MODIFICACIN QUMICA
Requiere instalaciones caras
Metodologa muy sofisticada
Restringido a determinados
aminocidos naturales

Falta de especificidad
Reacciones secundarias
Condiciones qumicas
agresivas
Toxicidad de los reactivos
La separacin y purificacin
puede ser compleja
Requiere eliminar el exceso de
reactivo inicial


VENTAJAS DE LA MODIFICACIN ELECTROQUMICA DE
BIOMOLCULAS
Proporciona selectividad
Especificidad
Condiciones muy suaves de reaccin
Reducciones/oxidaciones totalmente controlables
Retiene la actividad y la estructura respecto a la protena nativa
No aparecen subproductos
No son necesarios pasos extras de separacin y/o purificacin
Cese de la reaccin por el simple corte de la corriente elctrica



ASPECTOS INNOVADORES

La aplicacin de tcnicas electroqumicas (nitracin, cloracin, bromacin,
iodacin, oxidacin de metionina, etc.) para la modificacin selectiva de
biomolculas, tiene consecuencias estructurales y funcionales sobre dichas
protenas. De este modo, es posible obtener novedosas aplicaciones tales
como la obtencin de sensores bioelectroqumicos, inmovilizacin de protenas,
biomarcadores, obtencin de nuevos anticuerpos monoclonales con
innumerables usos, modificaciones selectivas post-traslacionales en el campo
de la Protemica, etc.

Adems, el grupo de investigacin posee un gran dominio en el uso de tcnicas
analticas tales como la Espectrometra de Masas (MALDI-TOF y ESI-FTICR) o





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la Resonancia Magntica Nuclear de Alto Campo entre otras, pudiendo de esta
forma relacionar el progreso de muchas enfermedades patofisiolgicas con las
modificaciones de residuos de aminocidos llevadas a cabo.



ESTADO ACTUAL DE LA TECNOLOGA

Tras varios aos de formacin en prestigiosos centros de investigacin
(Universidad de Coventry -Centre for Molecular and Biomedical Sciences-,y la
Universidad de Birmingham -School of Bioscience-,) en el manejo de diversas
tcnicas analticas (Espectrometra de Masas, Resonancia Magntica Nuclear
de Alto Campo, Dicrosmo Circular, Espectroscopa UV-Vis y fluorescencia,
etc.), el grupo posee los conocimientos tcnicos y la infraestructura necesaria
para llevar a cabo cualquier tipo de estudios que impliquen la modificacin
electroqumica o mediante qumica convencional aplicados a la elucidacin de
estructuras proteicas y sus consecuencias sobre la funcionalidad biolgica,
entre otras aplicaciones.




DERECHOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL

La tecnologa se encuentra protegida bajo el know-how del grupo de
investigacin.



APLICACIONES

La modificacin selectiva de cualquier tipo de biomolcula (enzimas, protenas
redox, lipoprotenas, anticuerpos, etc.), tanto por mtodos electroqumicos,
como por mtodos qumicos clsicos, tiene diversas aplicaciones, entre las que
destacan:

Inmovilizacin de biomolculas (enzimas, protenas, anticuerpos,
etc.): por ejemplo, es posible aprovechar la nitracin selectiva de
tirosinas seguida de la reduccin del grupo nitro- a amino-, para
conseguir un lugar especfico de inmovilizacin a pH 5 (a diferencia de
utilizar lisina para la inmovilizacin, ya que sta tiene un pKa>8).






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Sensores bioelectroqumicos o biosensores: la modificacin de
anticuerpos permite un amplio abanico de aplicaciones potenciales en
inmunoensayos.

Biomarcadores: es posible obtener pptidos o protenas marcadas
radiactivamente de un modo muy selectivo (por ejemplo, tirosina con
125
I), para hacer un adecuado seguimiento.

Modificacin de anticuerpos monoclonales segn la demanda del
cliente: para aumentar su inmovilizacin en diferentes soportes,
marcaje, medir su actividad, formas de reutilizacin de los anticuerpos
para abaratar costes, etc.

Metabolmica: sntesis de nuevos modelos de protenas implicadas
en enfermedades que impliquen disfunciones patofisiolgicas para
entender mejor cmo se produce el progreso de la enfermedad, por
ejemplo: neurodegenerativas (Alzheimer, Parkinson, Creutzfeldt-J akob,
esclerosis mltiple), diabetes, arterosclerosis, rechazo de rganos
transplantados, etc.

Protemica: modificaciones post-traslacionales selectivas de
protenas, as como la aplicacin de diversas tcnicas de
reconocimiento: SDS-Page, HPLC Y LPLC, Espectrometra de Masas,
Resonancia Magntica Nuclear (estudios conformacionales), Dicrosmo
Circular, Espectroscopa UV-Vis y fluorescencia.



COLABORACIN BUSCADA

El grupo de investigacin est interesado en:

Contactar con empresas u otras entidades interesadas en el desarrollo
especfico de nuevos biosensores para diversos usos (clnico, forense,
control de calidad agronmico o enolgico, etc.), biomarcadores,
inmovilizacin de biomolculas, modificacin de anticuerpos
monoclonales, sntesis de nuevos modelos proteicos

Establecer proyectos de I+D+i con organismos de investigacin
(pblicos o privados), con el objetivo de abrir nuevas lneas de
investigacin en el campo de la Bioelectroqumica.






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Impartir cursos de formacin respecto al uso de las novedosas tcnicas
electroqumicas de modificacin selectiva aplicadas a distintas
biomolculas.



PERFIL DEL GRUPO DE INVESTIGACIN

El grupo Electroqumica aplicada y electrocatlisis de la Universidad de
Alicante se cre hace ms de 20 aos. Cuenta con una planta piloto totalmente
equipada con la infraestructura necesaria para el escalado de los procesos a
nivel industrial.
Entre los artculos publicados recientemente y en proceso de publicacin
respecto a la tecnologa, cabe destacar:

Mass spectrometry in demonstrating the site-specific nitration of hen egg
white lysozyme by an improved electrochemical method.
Specific electrochemical iodination of horse heart myoglobin at tyrosine
103 as determined by Fourier transform ion cyclotron resonance mass
spectrometry.
Novel applications of a boron doped diamond (BDD) electrode for the
electrochemical modification of proteins: nitration of lysozyme.
Development of a fully automatic microwave assisted chemical oxygen
demand (COD) measurement device.
Electrochemical oxidation of phenol at boron-doped diamond electrode.
Application to electro-organic synthesis and wastewater treatment.
Electrochemical Oxidation of Tetracyclones and Tetraphenylthiophene-S-
oxide.
Electrochemical treatment of industrial wastewater containing phenols.
Electrodeposition of PbO
2
on glassy carbon electrodes: influence of
ultrasound power.
New developments in solvent reduced Wittig rolefination reactions with
stabilised phosphoranes.
On the performance of Fe and Fe,F doped Ti-Pt/PbO
2
electrodes in the
electrooxidation of the blue reactive 19 dye in simulated textile
wastewater.





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Optimisation of 20 kHz sonoreactor geometry on the basis of numerical
simulation of local ultrasonic intensity and qualitative comparison with
experimental results.
Characterization of a 20 kHz sonoreactor: Analysis of chemical effects by
classical and electrochemical methods.
Sonoelectrochemical Effects in Electroorganic Systems.
Sonovoltammetric Studies on Copper in Buffered Alkaline Solutions.
The Photochemistry of thiophene-S-oxides.
The Sonoelectrooxidation of Thiophene S-oxides.
Thermal reaction of Tetracyclone (2,3,4,5-
Tetraphenylcyclopentadienone) and its Derivatives with Molecular
Oxygen.

Entre las principales lneas de investigacin del grupo se encuentran:
Aplicacin de la energa solar fotovoltaica en procesos electroqumicos.
Diseo de nuevos reactores electroqumicos e Ingeniera de los
procesos.
Sntesis, caracterizacin y comportamiento electroqumico de
nanopartculas.
Sntesis electroqumica (productos orgnicos e inorgnicos).
Sistemas de generacin y acumulacin de energa elctrica.
Sonoelectroqumica, Bioelectroqumica y Electrocatlisis.
Tratamiento de aguas residuales por mtodos electroqumicos.
Modificacin qumica y electroqumica de biomolculas. Desarrollo de
biosensores bioelectroqumicos.

Fruto de todos estos aos de experiencia, el grupo ha colaborado con distintas
empresas nacionales e internacionales. La mayora de ellas han firmado
acuerdos de confidencialidad, pero se puede hacer referencia a Almu S.A.,
Vita-Invest, Prodesfarma, Intersuero, Salinas Bras de Port, Tcnicas Reunidas,
Ercros, Iberdrola, Bateig Laboral, Zambon, etc.






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DATOS DE CONTACTO
Vctor Manuel Prez Lozano
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Telfono: +34 96 590 3467
Fax: +34 96 590 3803
E-Mail: otri@ua.es
URL: http://sgitt-otri.ua.es/es/empresa/ofertas-tecnologicas.html

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