Politechnika lska

Wydzia Chemiczny

Katededra Fizykochemii i Technologii Polimerw

Autoreferat rozprawy doktorskiej pt.:

N-inactivation analysis of chosen potassium

channels of biological membranes
Analiza zjawiska N-inaktywacji w wybranych
kanaach potasowych bon biologicznych

mgr in. Krzysztof Maysiak

Pod kierunkiem:
Prof. dr hab. in. Zbigniewa J. Grzywny

Gliwice, 2009

Spis treci

Wprowadzenie

Cel Pracy

Klasa modeli jednowymiarowych

1.1

Model Paraboliczny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2

Model hiperboliczny

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3

Model subdyfuzyjny

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11

Symulacja N-inaktywacji z wykorzystaniem rwnania Langevina

12

2.1

Dynamika Langevina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

14

2.2

Wyznaczanie redniego czasu inaktywacji . . . . . . . . . . . . . . . .

15

2.3

Porwnanie z eksperymentem i przewidywania modelu

16

. . . . . . . .

Model w trzech wymiarach przestrzennych oparty o rwnanie Smoluchowskiego

18

Podsumowanie i wnioski

21

Dorobek Naukowy

23

Literatura

25

Wprowadzenie
W toku ewolucyjnego rozwoju organizmw ywych doszo do wyksztaenia wielu specycznych mechanizmw kontrolujcych aktywno biaek. Polegaj one zwykle na
wizaniu specycznego substratu (efektora) do centrum allosterycznego biaka. Prowadzi to, w efekcie, do zajcia okrelonych zmian konformacyjnych, przekadajcych
si na spadek/wzrost jego aktywnoci. W wikszoci wypadkw, efektor dociera do
biaka z otoczenia, zwykle w wyniku uruchomienia odpowiednich cieek sygnaowych. Rzadziej natomiast, jest on pozostaje trwale zwizany z biakiem, np. przez
gitki acuch polipeptydowy, ograniczajcy dostpn przestrze i zwikszajcy lokalne stenie efektora w pobliu biaka. Sytuacja taka spotykana jest w przypadku

Rysunek 1: Kana potasowy w rnych stanach przewodzenia, z zaznaczon rnic

potencjau membranowego. Dla zwikszenia czytelnoci rysunku, kana pokazano w
przekroju, z dwoma, z czterech N-kocw.

SF

oznacza ltr selektywny,

 inak-

tywujc kulk. Gwiazdki oznaczaj miejsca wizania kulki na powierzchni domeny

T1-S1.

niektrych kanaw potasowych  biaek powszechnie wystpujcych w bonie komrkowej, odpowiedzialnych za selektywny, pasywny transport jonw potasowych, zgodnie z gradientem ich potencjau elektrochemicznego. Trwale zwizany substrat jest
polipeptydem zbudowanym z 20 reszt aminokwasowych i uczestniczy on w procesie

tzw. N-inaktywacji, zachodzcej wedug modelu ball and chain. Model ten, przedstawiony schematycznie na Rys.(1) zakada, e kady z czterech N-kocw biaka
kanau (kana jest tetramerem), zbudowany jest z dwch, funkcjonalnie rnych czci  kulki, zbudowanej z okoo 20 aminokwasw, z dobrze zdeniowan, sztywn
struktur drugorzdow, poczonej z biakiem kanau gitkim acuchem, skadajcym si z okoo 60 aminokwasw. Przejcie ze stanu zamknitego kanau do stanu
otwartego odbywa si, jak zaznaczono na Rys. (1), pod wpywem zmiany potencjau
trans-membranowego. Kana pozostajcy w stanie otwartym, moe nastpnie przej
w nieprzewodzcy stan N-inaktywowany, przez przyczenie si jednej z aminokwasowych kulek do centrum allosterycznego kanau. Blokada przepywu jonw przez
kana odbywa si w dwch etapach. W pierwszym, inaktywujca kulka zblia si do
powierzchni centrum i ulega adsorpcji, co prowadzi, w drugim etapie, do rozprostowania jej struktury i mechanicznej blokady wiata kanau. Jak wynika z eksperymentw [1], pierwszy etap N-inaktywacji (transport i dokowanie) jest etapem limitujcym
szybko caego procesu. Naley zaznaczy, e zarysowany powyej model ball and

Rysunek 2: Formy kanau stosowane w pomiarach elektrozjologicznych.

chain jest jedynie jakociowym opisem N-inaktywacji, opartym gwnie na pracach

dowiadczalnych [1, 2, 3, 4]. Elektrozjologiczne badanie zjawiska N-inaktywacji prze-

prowadza si obecnie na dwch formach kanaw, pokazanych na Rys.(2). Tryb ShB

odpowiada formie kanau identycznej z t, wystpujc w organizmach ywych. W
trybie ShB6-46, pomiarw dokonuje si na kanaach z enzymatycznie odcitymi Nkocami i z inaktywujcymi peptydami dostarczanymi z zewntrz. Tryb ShB6-46,
chocia nie wystpuje w przyrodzie, pozwala na atw, chemiczn modykacj inaktywujcych kulek.

Cel Pracy
Celem niniejszej pracy doktorskiej jest zaproponowanie klasy modeli, opisujcych wpyw wybranych cech biaka kanaowego, inaktywujcej kulki i otaczajcego
rodowiska, na kinetyk zjawiska N-inaktywacji, a tym samym, nadanie ilociowego
charakteru modelowi ball and chain. Wsplnym, podstawowym zaoeniem modeli,
jest zaoenie o wykonywaniu bdzenia przypadkowego przez inaktywujc kulk
przed dokowaniem w centrum allosterycznym. Wynika ono z zykochemicznych wasnoci, zarwno samej kulki, jak i otoczenia w ktrym si ona znajduje. Proponowane
przez nas modele maj na celu przewidzie kinetyk N-inaktywacji w rnych warunkach zewntrznych, w tym take trudno dostpnych z eksperymentalnego punktu
widzenia. Zaczynajc od prostych, jednowymiarowych modeli opisywanego zjawiska,
odtwarzajcych wybrane charakterystyki procesu, przeszlimy do konstrukcji bardziej
skomplikowanych modeli, budowanych w trzech wymiarach przestrzennych, oddajcych caociow rol elektrostatyki w badanym procesie. Proponowane modele podlega maj werykacji dowiadczalnej, w miar dostpnoci danych eksperymentalnych.
Ich przewidywania maj posuy nie tylko do zykochemicznej interpretacji dokonanych ju pomiarw elektrozjologicznych, ale powinny by take inspiracj w projektowaniu nowych eksperymentw badajcych N-inaktywacj kanaw potasowych.

Klasa modeli jednowymiarowych

Jak zaznaczono w Celu Pracy, rozwaania nad mechanizmem N-inaktywacji, rozpoczto od wprowadzenia klasy modeli jednowymiarowych, opisujcych zachowanie
si inaktywujcej kulki przez dokowaniem na powierzchni centrum allosterycznego.
Ze wzgldu na symetri zjawiska, po dokonaniu pewnych uproszcze, problem Ninaktywacji mona modelowa jednowymiarowo. Klasa modeli jednowymiarowych odnosi si zawsze do obserwacji duej grupy kanaw, ktrej zachowanie zostaje urednione po zespole. Std moliwo dokonywania opisu na poziomie rozkadw gstoci prawdopodobiestwa (ste), przy uyciu odpowiednich rniczkowych rwna
transportu. Budowa modelu polega wic na odpowiednim postawieniu zagadnienia
dla danego rniczkowego rwnania transportu. Cechami wsplnymi postawionych
zagadnie s:

przedzia zmiennoci x , gdzie L jest dugoci acucha czcego inaktywujc

kulk z kanaem

charakter warunkw brzegowych; warunek brzegowy stawiany w x=0 ma charakter absorbujcy (miejsce w ktrym kulka wie si z kanaem w czasie inaktywacji); warunek brzegowy w x=L ma charakter odbijajcy (ograniczenie
dostpnej przestrzeni przez dugo acucha)

Wielkoci otrzymywan z postawionych zagadnie jest gsto rozkadu prawdopodobiestwa pooe inaktywujcej kulki p(x,t), na podstawie ktrej deniuje si
prawdopodobiestwo przetrwania kanau w stanie otwartym SP(t):

SP (t) =

Z L

p(x, t)dx

(1)

Wielko SP(t) jest tosama ze znormalizowanym rednim prdem przepywajcym

przez inaktywujcy si kana i jako taka moe by bezporednio porwnywana z po-

miarami elektrozjologicznymi.

1.1

Model Paraboliczny

Standardowe podejcie z uyciem drugiego prawa Ficka moe suy do zobrazowania idei dyfuzyjnego modelowania kulki i acucha. Matematyczne sformuowanie
modelu przedstawia si nastpujco [5]

p(x,t)

= D

2 p(x,t)

x2

, x (0, L); t <+

(2)

p(x, t)|t=0 = (x x0 )
p(x, t)|x=0 = 0,

p(x,t) 

x
x=L

=0

gdzie D oznacza wspczynnik dyfuzji inaktywujcej kulki, x0 jej pocztkow pozycj,

a L dugo acucha (kana potasowy). Naoone warunki brzegowe  absorbujcy w

x=0

i odbijajcy w

x=L

odzwierciedlaj zyczny obraz N-inaktywacji  bdzenie

kulki w ograniczonej przestrzeni i jej dokowanie w miejscu aktywnym.

Rysunek 3: Porwnanie teoretycznego rozkadu czasw pierszego przejcia z wynikiem

7
eksperymentalnym dla parametrw L = 320 , D=1.210

Tak postawiony problem da si atwo rozwiza numerycznie (schemat Crank-Nicolson)

i analitycznie (rozdzielanie zmiennych), co zostao szczegowo omwione w rozprawie
doktorskiej. Dokonujc porwnania krzywych SP(t), z danymi eksperymentalnymi, co
ilustruje Rys.(3), dla znanej dugoci acucha

L = 320 , wspczynnik dyfuzji, zna-

leziony metod nieliniowej regresji wynosi D=1.210

2
[cm /s]. Warto ta, powinna

odpowiada wspczynnikowi dyfuzji inaktywujcej kulki, biorc pod uwag jej mas
i promie. Stanowi to dodatkowe potwierdzenie susznoci zaproponowanego modelu.

1.2

Model hiperboliczny

Rwnanie hiperboliczne (uywane take do opisu propagujcej, tumionej fali) jest

uoglnieniem rwnania parabolicznego na krtkie czasy. Wyprowadzenie tego rwnania z zachowawczego bdzenia przypadkowego zostao pokazane w [6]. Rwnanie
to, w przeciwiestwie do rwnania parabolicznego, wprowadza skoczon prdko
propagacji zmian w gstoci prawdopodobiestwa. Dla duszych okresw czasu, oba
rwnania daj w zasadzie podobne rezultaty. Zagadnienie oparte o rwnanie hiperboliczne przybiera nastpujc form:

2 p(x,t)

t2

2 p(x,t)

x2

p(x,t)
t

p(x,t) 

t
t=0

p(x, t = 0) = (x x0 ),


2 p(x,t)

=
t
x=0

p(x,t) 

=0
x



2 v p(x,t)

x

x (0, L), t <+

= 0,

x=0

=0
(3)

p(0, t)

x=L

gdzie D oznacza sta dyfuzji a

czas korelacji, ktry moe by interpretowany w

ramach teorii bdzenia przypadkowego jako redni czas po ktrym bdzca czstka
zmienia kierunek swojego ruchu (co wie si z inercj czstki). W granicy

t ,

efekty hiperboliczne przestaj by istotne i ukad (3) redukuje si do (2). Warunek

absorbujcy dla rwnania hiperbolicznego przyjmuje niestandardow form, ktrej
wyprowadzenie, z bdzenia przypadkowego, mona znale w pracy doktorskiej i w

[7], wraz z analitycznymi rozwizaniami ukadu (3) w formie zawierajcej hiperboliczne funkcje Bessela. Ksztat funkcji SP(t) wyznaczony na podstawie ukadu (3)
jest silnie zaleny od wartoci czasu korelacji

co obrazuje Rys.(4). Porwnujc

przewidywania modelu hiperbolicznego z danymi eksperymentalnymi, krzywa SP(t),

przybliaa najlepiej krzyw eksperymentaln dla D=1.210

2
[cm /s] i

= 1106

[s].

Rysunek 4: Prawdopodobiestwa przetrwania kanau w stanie otwartym w zalenoci

od czasu korelacji

dla znormalizowanego wspczynnika dyfuzji D = 1.

Jak wynika z Rys.(4), krzywa SP(t), dla wzrastajcego czasu korelacji, wykazuje
coraz wolniejszy spadek, co wynika ze zmniejszajcej si prdkoci propagacji. Dla
wysokich wartoci

mona zaobserwowa falow natur rwnania hiperbolicznego -

wierzchoek na Rys.(4), dla

=0.1

i t = 0.5, powstaje z fali prawdopodobiestwa

odbitej od warunku w x=L.

10

1.3

Model subdyfuzyjny

Cytoplazma kadej ywej komrki jest pynem zawierajcym elementy strukturalne

na rnych skalach dugoci. W zakresie [m] mona zaobserwowa organelle komrkowe (mitochondria, aparaty Golgiego, itp.). Reticulum endoplazmatyczne pojawia
si jako element strukturalny w skali dugoci ok. 100 nm. Zmniejszajc dalej skal,
zauway mona czsteczki biaek, tuszczy i cukrw, stanowicych ok. 40% objtoci
cytoplazmy, ktre odpowiedzialne s za efekty toku w nanometrowej skali dugoci.
Ujcie wpyww efektu toku na proces dyfuzji zachodzcy w medium komrkowym,
moe zosta dokonane przez zastosowanie formalizmu subdyfuzji [8, 9].
Rwnanie subdyfuzji moe zosta wyprowadzone na gruncie teorii bdzenia przypadkowego, z gstoci prawdopodobiestwa czasw oczekiwania skalujcych si jak

w(t) t(1+)

[10]. Subdyfuzja opisuje wic gsto prawdopodobiestwa znalezie-

nia bdzcej przypadkowo czstki, ktra moe, ze wzgldu na zatoczone otoczenie,

utkn w miejscu z czasem charakterystycznym okrelanym przez nieskoczon warto pierwszego lub drugiego momentu statystycznego. Charakterystyczn cech subdyfuzji jest potgowe skalowanie redniego kwadratu odchylenia pooenia bdzcej
czstki, tj.

hx2 (t)i t , gdzie jest parametrem z zakresu (0,1) , ktry determinuje

si reimu subdyfuzyjnego. Dla niskich wartoci

= 1,

podczas gdy dla

gdzie

efekty subdyfuzyjne dominuj,

odtwarzana jest dyfuzja Fickowska.

p(x,t)

=0 Dt1 K

2 p(x,t)

x2

; x (0, L); t <+

(4)

p(x, t)|t=0 = (x x0 )

p(x, t)|x=0 = 0,

p(x,t) 

x
x=L

=0

1
jest uoglnion sta dyfuzji a 0 Dt
to operator rniczkowania Riemanna-

Liouville'a rzdu

1 .

Problem postawiony w ukadzie (4) moe zosta rozwizany

przez rozdzielenie zmiennych, co pokazano szczegowo w rozprawie doktorskiej. Zaleno SP(t) dla od wykadnika

przedstawiono na wykresie Rys.(5).

11

Rysunek 5: Pradwopodobiestwa przetrwania SP(t) dla rnych wartoci

lizowanych, staych D=1, L=1.

i znorma-

zmienia si tak, jak oznaczono w legendzie.

Jak wynika z Rys.(5), dla krtkich czasw, subdyfuzyjne SP(t) wygasa szybciej, co
moe zosta wsparte analiz zachowania redniego kwadratu odchylenia, dyskutowanego wczeniej. Dla dugich czasw, krzywe SP(t) z silniejszym reimem subdyfuzyjnym wygasaj wolniej. Naley take zauway, e wartoci uoglnionej staej dyfuzji
zale od

Poniewa brak jest danych eksperymentalnych dotyczcych wpywu za-

toczenia rodowiska na kinetyk inaktywacji, wyniki modelu subdyfuzyjnego mog

stanowi inspiracj do prowadzenia bada w tym kierunku.

Symulacja N-inaktywacji z wykorzystaniem rwnania Langevina

Modele konstruowane w jednym wymiarze przestrzennym nie speniaj dobrze swojej roli w badaniu tych aspektw inaktywacji, w ktrych brak symetrii uniemoliwia
redukcj oryginalnego, trjwymiarowego problemu. Dobrym przykadem moe by

12

tutaj rozkad pola elektrostatycznego, pochodzcego od adunkw rozmieszczonych

w kanale i w bonie komrkowej, w ktrym porusza si inaktywujca kulka. Pole to nie
posiada szczeglnej, okrelonej symetrii, co pokazano w rozprawie doktorskiej. Dlatego
te badanie roli elektrostatyki w procesie inaktywacji prowadzono w trzech wymiarach
przestrzennych. W celu wyznaczenia rozkadu elektrostatycznego pola potencjalnego
wok kanau posuono si danymi krystalogracznymi biaka 2r9r, dostpnymi w
rozdzielczoci 2.4 w Protein Data Bank (www.pdb.org ), zapisanymi w standardzie
pdb. Po uzupenieniu brakujcych atomw programem SwissPDB Viewer, kompletny
plik pdb przetworzono usug pdb2pqr [11], w celu przypisania odpowiednich promieni atomowych i adunkw czstkowych, przy uyciu pl AMBER i CHARMM. Na
tej podstawie, w dalszych etapach pracy wyznaczono rozkad pola potencjalnego przy
uyciu programu APBS [12], z penym, nieliniowym rwnaniem Poissona-Boltzmanna,
przyjmujc sta dielektryczn dla biaka 2, a dla cytoplazmy 78. Zadawane ste-

+
nia soli (M A ) w cytoplazmie pozostaway w zgodnoci z [3] i wynosiy csl ={0.01,
3
0.03, 0.15, 0.5, 1} [mol/dm ], w skutek czego uzyskano ca klas potencjaw, dla
rnych przyjtych ste, co pozwolio dodatkowo na ocen roli siy jonowej w procesie N-inaktywacji. Uwzgldnienie oddziaywa z bon komrkow sprowadzao si
do modelowania jej elektrostatycznego oddziaywania z inaktywujcymi peptydami
przy uyciu rozkadu potencjau elektrostatycznego dla rwnomiernie naadowanej
paskiej powierzchni. rednia gsto adunku na powierzchni membrany, oznaczona
jako

, zostaa wyznaczona bazujc na zawartoci fosfatydyloseryny, ktra stanowi ok.

10-20 % membrany w komrce eukariotycznej i ktrej czsteczka posiada wypadkowy

adunek -1. Przy przyjtej redniej powierzchni czsteczki fosfatydyloseryny jako rw-

2
nej 72 , rednia gsto adunku waha si w granicach

(-0.02,

2
-0.045) [C/m ]

dla zawartoci odpowiednio 10 i 20% fosfatydyloseryny. Korzystajc dodatkowo z [13]

przyjlimy redni warto

=-0.03 [C/m2 ], co przekada si rednio na jeden adunek

2
elementarny na 534 . Fragmenty przestrzeni wykluczonej z bdzenia przypadko-

13

wego z powodw zawad sterycznych, powodowanych obecnoci biaka bd bony

komrkowej, wyznaczono bazujc na generowanej przez APBS mapie przenikalnoci
elektrycznej

2.1

(~r).

Dynamika Langevina

W omawianej symulacji, ruch inaktywujcych kulek podlega stochastycznemu rwnaniu Langevina

~ (~r)q
U
d~r(t)
=
+
dt
m
gdzie

~r

kB T
(t)
m

(5)

jest zalenym od czasu pooeniem inaktywujcej kulki o masie

wspczynnikiem tumienia, zwizanym z lepkoci rodowiska, a

m.

U (~r) opisuje rozkad

pola elektrostatycznego generowanego przez adunki biaka i bony komrkowej.

jest

-skorelowanym

(t)

Gaussowskim biaym szumem, z zerow redni i jednostkow

wariancj. Znajc wspczynnik dyfuzji

jako

jest

D, mona wyznaczy wspczynnik tumienia

= kB T /mD Wspczynnik dyfuzji mona z kolei wyznaczy przy uyciu relacji

Stokesa-Einsteina
peratur a

D = kB T /(6a),

gdzie

3
jest lepkoci wody (10

kB

jest sta Boltzmanna,

oznacza tem-

[P a s]). Dla rednicy a inaktywujcej kulki w

roztworze wodnym, rwnej 8 [14] wspczynnik dyfuzji

D = 2.7 106 [cm2 /s]. Rw-

nanie (5) zostao zdyskretyzowane przy uyciu stochastycznego schematu RungegoKutty. Przestrzeni, w ktrej odbywao si bdzenie przypadkowe, bya pkula o
promieniu L=320(dugo polipeptydowego acucha), pokazana na Rys.(6).

14

Rysunek 6:

a) Pkula reprezentujca domen przestrzenn symulacji. Promie p-

kuli wynosi 320; podjednostka

biaka kanau jonowego jest czciowo ulokowana

w bonie komrkowejb) Ummiejscowienie centrw allosterycznych, zaznaczonych biaym kolorem.

Centrum allosteryczne potasowego kanau jonowego, byo modelowane z wykorzystaniem reaktywnego warunku brzegowego. W jzyku gstoci prawdopodobiestwa,
warunek ten, znany jako warunek Robina, przyjmuje nastpujc posta

~ AS ~n = KR cAS
J|

gdzie

cAS

jest steniem inaktywujcych peptydw w miejscu aktywnym,

torem prostopadym do powierzchni biaka a

(6)

~n

jest wek-

J~ jest strumieniem inaktywujcych cz-

stek. W symulacji z uyciem rwnania Langevina wykorzystano stochastyczn odmian warunku Robina, omwion dokadnie w rozprawie doktorskiej.

2.2

Wyznaczanie redniego czasu inaktywacji

W pojedynczej symulacji obserwowano zachowanie grupy 500-1000 kanaw. Kady

kana pozostawa zanurzony w domenie przestrzennej przedstawionej na Rys.(6), z
odpowiednio dobran liczb inaktywujcych czstek. W czasie trwania symulacji, w

15

dyskretnych chwilach czasu, mierzono ilo kanaw otwartych (niezinaktywowanych).

Na tej podstawie wyznaczano SP(t)  prawdopodobiestwo przetrwania kanau w
stanie otwartym, jako stosunek pocztkowej liczby kanaw do kanaw otwartych
w dane chwili czasu

t.

Przedmiotem porwnania z eksperymentem by redni czas

inaktywacji wyznaczany na podstawie rozkadu SP(t), oznaczony jako

2.3

SP

Porwnanie z eksperymentem i przewidywania modelu

Symulacje wykonywane byy dla dwch form kanaw, zilustrowanych na Rys.(2). Z

przeprowadzonych symulacji wynika, e zmiana adunku inaktywujcej kulki wpywa
inaczej na redni czas inaktywacji dla rozwaanych form kanau, wbrew niektrym
doniesieniom literaturowym, dostpnym na ten temat. Rys.(7) ilustruje ten efekt dla
kanau ShB6-46, Rys.(8) dla kanau ShB. Z porwnania wykresw wynika, e
zwikszanie adunku inaktywujcej kulki w kanale ShB, nie prowadzi, dla duych
adunkw, do skracania redniego czasu inaktywacji. Wynika to gwnie z ogranicze iloci inaktywujcych kulek i dziaania ujemnie naadowanej bony komrkowej
przechwytujcej inaktywujce peptydy silnym oddziaywaniem elektrostatycznym

Rysunek 7: Porwnanie eksperymentalnych i teoretycznych rednich czasw inaktywacji dla kanau ShB6-46. Mniejszy wykres pokazuje krzywe wygasania prdu
pyncego przez grup kanaw, inaktywowanego kulkami o rnych adunkach (o x
wyskalowania jest w sekundach).

16

Rysunek 8: redni czas inaktywacji kanau ShB w funkcji adunku inaktywujcych

kulek, z wczonymi, wybranymi rdami pola elektrostatycznego.

Dodatkow metod walidacji modelu, byo przewidzenie redniego czasu inaktywacji dla rnych si jonowych otaczajcego roztworu. Dla kadej siy jonowej, rozkad
potencjau elektrostatycznego by obliczany oddzielnie (rne siy jonowe implikuj
rn dugo Debye'a). Zgodno przewidywa z danymi eksperymentalnymi potwierdza poprawno modelu.

Rysunek 9: redni czas inaktywacji kanau ShB6-46 w funkcji siy jonowej otaczajcego roztworu. Proste zaznaczone na wykresie odtworzono na podstawie danych
eksperymentalnych z [4] (Rys.1, p.982)

17

Model w trzech wymiarach przestrzennych oparty

o rwnanie Smoluchowskiego

Alternatywnego opisu bdzcych przypadkowo, inaktywujcych kulek mona rwnie dokona na poziomie ich gstoci prawdopodobiestwa (stenia). Opisujc du
grup kanaw, mona uredni ich obraz, w ktrym zamiast ledzi trajektorie poszczeglnych czstek, mona skupi si na ewolucji ich rozkadu ste. Uwzgldniajc obecno elektrostatycznego pola potencjalnego, strumie inaktywujcych czstek
przyjmuje nastpujc posta

gdzie

kT /m

~ r, t) e q U
~ (~r)
~j(~r, t) = kT p(~
m
m

(7)

D, 1/m

okrela ruchliwo b-

jest staym wspczynnikiem dyfuzji

dzcych czstek, a

eq

jest ich adunkiem.

Uywajc rwnania cigoci strumienia, z odpowiednimi warunkami pocztkowymi i brzegowymi, postawiono ponisze zagadnienie, opisujce dynamik gstoci
prawdopodobiestwa (stenia)

p(~r, t).

p(~r, t)
~ ~j(~r, t); ~r S ; t <+
=
t
"
#
U (~r)e q
p(~r, 0) = A exp
kT
~j(~r, t) + kR (t)p(~r, t) = 0 dla ~r A
"

p(~r, t) = A exp
~j(~r, t) = 0

for

U (~r)e q
kT

~r IN ,

(8)

(9)
(10)

#
for

~r IN ,

dla ShB

dla ShB6-46

(11)
(12)

Naley zauway, e uycie warunku brzegowego (11) lub (12) zaley od rozwaanego
przypadku. Dla kanau ShB, z powodu obecnoci acucha, odpowiedni jest warunek
odbijajcy (inaktywujce kulki mog oddali si od kanau tylko na odlego L).

18

Warunek pocztkowy jest wtedy normalizowany przez sta

"

U (~r)e q
A = 1/4
dS
exp
kT
S
Z

zdeniowan jako [15]

!1
(13)

jako, e na jeden kana przypadaj dokadnie cztery inaktywujce kulki. Dla kanau

ShB6-46, staa normalizujca warunek pocztkowy rwna si

A = cB , co z warun-

kiem brzegowym (11) odzwierciedla kontakt kanau z roztworem o danym steniu

cB .
Warunek brzegowy (10) jest warunkiem Robina, zakadajcym przepyw inaktywujcych peptydw proporcjonalny do ich lokalnego stenia. Zaleno staej Robina k(t) od czasu wynika z faktu, e w miar zachodzenia N-inaktywacji, rednia
aktywno centrum allosterycznego spada a do zera w momencie, gdy wszystkie kanay zostan zinaktywowane. Dokadna forma zalenoci staej Robina

k(t) od czasu,

deniujca si absorpcyjnego charakteru centrum allosterycznego, urednionego po

populacji kanaw, zostaa omwiona w rozprawie doktorskiej.
Potencja pola elektrostatycznego
rwnie ksztat powierzchni

U (~r),

IN , A ,

uywany w rwnaniach (8)-(11)/(12), jak

zosta okrelony w ten sam sposb jak dla

symulacji z uyciem rwnania Langevina.

Zagadnienie (8)-(11)/(12), zostao rozwizane numerycznie, przy uyciu schematu
korzystajcego z metod objtoci skoczonych. Na podstawie rozwizania numerycznego, wyznaczono zmian redniego czasu inaktywacji w zalenoci od adunku inaktywujcego peptydu dla kanau ShB6-46, przedstawion na Rys.(10). Poszczeglne
krzywe odpowiadaj rnym wartociom lokalnego potencjau elektrostatycznego w
miejscu dokowania, ktry zaley od wzajemnej orientacji biaka kanau i bony komrkowej (warto parametru

okrelajca t orientacj bya przedmiotem dopaso-

wania). Z porwnania Rys.(10) i Rys.(7) wynika, e przewidywania rednich czasw

inaktywacji, na podstawie modelu z rwnaniem Smoluchowskiego, s w peni zgodne

19

z wynikami symulacji z uyciem rwnania Langevina dla

=7,

co potwierdza rw-

nowano obu opisw badanego zjawiska.

Rysunek 10: rednie czasy inaktywacji dla kanau ShB6-46, w funkcji adunku
inaktywujcego peptydu i lokalnego potencjau elektrostatycznego. Dla

U (A )=-23

mV, uzyskano zgodno z eksperymentem.

Silny wpyw pola elektrostatycznego na zachowanie si inaktywujcych peptydw,

jest jasno obrazowany przez Rys.(11). W zakresie badanych adunkw, pole elektrostatyczne jest w stanie zwikszy, nawet stukrotnie, lokalne stenie inaktywujcych
peptydw, w stosunku do stenia bulk.

Rysunek 11: rednie stenie inaktywujcego peptydu w funkcji jego adunku, urednione po powierzchni centrum allosterycznego

20

A .

Stenie bulk = 100

M .

Podsumowanie i wnioski

Celem referowanej rozprawy doktorskiej byo dostarczenie wyczerpujcego opisu zjawiska N-inaktywacji kanau potasowego Kv 1.2 i zaproponowanie klasy modeli o charakterze dyfuzyjnym, pozwalajcych w atwy sposb powiza charakterystyki procesu z zykochemicznymi cechami kanau i jego otocznia. Na realizacj celu pracy
zoya si konstrukcja klasy modeli w jednym, bd w trzech wymiarach przestrzennych. Modele jednowymiarowe, oparte o dyfuzj paraboliczn, hiperboliczn, czy subdyfuzj, ukierunkowane byy na odtworzenie wpywu zmian pojedynczej, okrelonej
charakterystyki (ruchliwo peptydw i stopie korelacji w ich ruchu, efekty zatoczenia rodowiska) na szybko N-inaktywacji.
Modele zbudowane w trzech wymiarach przestrzennych, byy ukierunkowane na
badanie roli elektrostatyki i wpywu siy jonowej na kinetyk N-inaktywacji. Konstrukcja symulacji opartej o rwnanie Langevina, zakadaa szczegowe uwzgldnienie zykochemicznych cechy ukadu, w tym ksztatu biaka i bony komrkowej,
rozkadu adunkw elektrostatycznych i efektw ekranowania w elektrolicie.
Wyej wymienione modele zostay, z sukcesem, uyte do przewidywania wynikw
pomiaru redniego natenia prdu przepywajcego przez grup kanaw jonowych,
przy znanych parametrach zachodzcego procesu. Pokazano rwnie, e moliwe jest
szacowanie wpywu poszczeglnych czynnikw zewntrznych na kinetyk inaktywacji kanau jonowego (Rys.(8)), a tym samym powizanie pomiarw z konkretnymi
zykochemicznymi cechami badanego ukadu.
W podsumowaniu naley stwierdzi, e podstawowe cele okrelone we wstpnej fazie bada, zostay w peni zrealizowane. Porwnania wynikw proponowanych modeli
z pomiarami elektrozjologicznymi dowodz, e koncepcja dyfuzyjnego modelowania
zjawiska N-inaktywacji kanau jonowego, pozwala z sukcesem powiza kinetyk Ninaktywacji kanau z jego cechami strukturalnymi, oraz z charakterystyk rodowiska,
w ktrym kana pozostaje wystpuje

21

Pomimo, e N-inaktywacja wydaje si by najlepiej poznanym mechanizmem modulacji przepywu prdu w kanaach potasowych [14], wci wiele jej kwestii, zarwno eksperymentalnych jak i teoretycznych, pozostaje niejasnych. Jako przykad
poda mona zmiany konformacyjne prowadzce do rozprostowania inaktywujcego
peptydu po dokowaniu w centrum allosterycznym. Z perspektywy Autora, podjta
tematyka jest fascynujcym przykadem jak 180-letnia koncepcja ruchw Browna,
moe posuy do opisu pozornie tak odlegego zjawiska jak N-inaktywacja.

22

Dorobek naukowy
Publikacje
1. On the ball and chain model by simple and hyperbolic diusion - an analytical approach,
K.Maysiak, P.Borys, Z.J.Grzywna, Acta Physica Polonica B, 5, (2007)
2. On the possible methods for the mathematical description of the ball and chain model of ion
channel inactivation, K.Maysiak, Z.J. Grzywna, Cellular and Molecular Biology Letters, 13,
535 - 552 (2008)
3. O rnych moliwosciach opisu procesu N-inaktywacji kanau jonowego, Z. J. Grzywna, K.
Maysiak, Monograa Bony Biologiczne, pod red. J. Gabrielskiej i P. Misiaka, Wrocaw (2008)
4. Electrostatic interactions during Kv1.2 N-type inactivation: random-walk simulation, K.Maysiak,
Z.J. Grzywna, European Biophysics Journal,

Online rst

(2009)

5. Smoluchowski type model of N-inactivation of potassium voltage gated ion channels, K.Maysiak,
Z.J. Grzywna, submitted to Physical Review

Wystpienia Konferencyjne
1. On the occular dominance stripes pattern formation, K. Maysiak, K. Jelonek, Z. J. Grzywna,

XVIII Marian Smoluchowski Symposium on Statistical Physics,

Krakw, 3-6 IX,

(2005)

XIX Marian
Smoluchowski Symposium on Statistical Physics, Krakw, 13-17 V, (2006)

2. On the ball and chain model by simple diusion, K. Maysiak, Z. J. Grzywna,

3. Theoretical Studies On Mutation Induced Changes In Inactivation Kinetics Of Nav 1.5 Adult
And Neonatal Isoforms, K. Maysiak, R. Onkal, Z.J. Grzywna, M. B. A. Djamgoz,

tional Workshop on Ionic Channels, Szczyrk, 27 V  1 VI, (2007)

Interna-

4. On the possibilities of the mathematical description of the ball and chain model of ion channel inactivation, K. Maysiak, Z.J. Grzywna,

II Warsaw School of Statistical Physics,

Kazimierz Dolny, 27 VI4 VII, (2007)

5. On the rst passage time distributions for K channels of the cancer cells, Z. J. Grzywna,
K.Malysiak, M. Rubi,

6th European Biophysics Congress, 1418 VII, London, (2007)

6. Theoretical studies on the inactivation kinetics of a sodium voltage gated channel, K. Maysiak, R. Onkal, Z. J. Grzywna, M. B.A. Djamgoz,

Statistical Physics, Zakopane, 1419 VIII, (2007)

XX Smoluchowski Symposium on

7. N-inactivation of potassium ion chanel  modeling with Smoluchowski equation with functional drift, K. Maysiak, Z.J. Grzywna,

International Symposium on Bionanomaterials,

1011 III, Gliwice (2008)

8. On the possibile methods for the mathematical description of the ball and chain model of ion
channel inactivation, K. Maysiak, Z.J. Grzywna, Konferencja Bony Biologiczne, Szklarska
Por e ba 1618 V (2008)
9. Inactivation of voltage gated ionic channels with Smoluchowski equation and its fractional

XXI Sitges Conference on Statistical Mechanics and Molecular Biophysics, 2-6 VI, (2008)
counterpart, K. Maysiak, Z.J. Grzywna,

23

10. Electrostatic interactions in Kv.1.2 ion channel inactivation. Langevin type simulation appro-

XX Marian Smoluchwoski Symposium on Statistical

Physics, Zakopane 1318 IX, 2008 (ORAL CONTRIBUTION)
ach, K. Maysiak, Z.J. Grzywna,

11. Diusional approach to modelling of a wound healing assay, Monika Krasowska, K. Maysiak,
Zbigniew J. Grzywna,

XXI Marian Smoluchowski Symposium on Statistical Physics,

Zakopane, 13-18 IX, (2008)

12. Electrostatic interactions in Kv.1.2 ion channel inactivation. Langevin type simulation approach, K. Maysiak, Z.J. Grzywna, Gliwice, 1920 IX, 2008 (ORAL CONTRIBUTION)
13. Role of electrostatics in inactivation of Kv1.2 potassium ion channel, Langevin-type simulations, K. Maysiak, Zbigniew J. Grzywna,

Gliwice Scientic Meetings, Gliwice, 21-22

XI, (2008) (Fifth place in the Best Poster Contest )

14. On the channel N-inactivation by Poisson-Nernst-Planck equation, K. Maysiak, K. Janiczek,
Z. J. Grzywna,

Warsaw School of Statistical Physics; 27 VI  4 VII (2009)

24

Literatura
[1] S. B. Long, E. B. Campbell, and R. Mackinnon, Crystal structure of a mammalian voltage-

dependent Shaker family K

channel.,

Science, vol. 309, no. 5736, pp. 897903, 2005.

[2] W. N. Zagotta, , T. Hoshi, and R. W. Aldrich, Restoration of inactivation in mutants of Shaker

potassium channels by a peptide derived from ShB,

Science,

vol. 250, no. 4980, pp. 568571,

1990.
[3] R. M. Lagnado and R. W. Aldrich, Interactions of amino terminal domains of Shaker K
channels with a pore blocking site studied with synthetic peptides,

J. Gen. Physiol., vol. 102,

no. 6, pp. 949975, 1993.

[4] R. M. Lagnado and R. W. Aldrich, Energetics of Shaker K
peptides,

J. Gen. Physiol., vol. 102, no. 6, pp. 9771003, 1993.

channels block by inactivation

[5] K. Maysiak and Z. J. Grzywna, On the possible methods for the mathematical description of
the ball and chain model of ion channel inactivation.,

Cell. Mol. Biol. Lett., 2008.

[6] S. Goldstein,  On Diusion By Discontinuous Movements, And On The Telegraph Equation,

Q J Mechanics Appl Math, vol. 4, no. 2, pp. 129156, 1951.

[7] K. Maysiak and Z. J. Grzywna, On the ball and chain model by simple and hyperbolic diusion
 an analytical approach,

Acta. Phys. Pol. B, vol. 38, pp. 22552270, 2007.

[8] M. Wachsmuth, W. Waldeck, and J. Langowski, Anomalous diusion of uorescent probes

inside living cell nuclei investigated by spatially-resolved uorescence correlation spectroscopy.,

J Mol Biol, vol. 298, no. 4, pp. 677689, 2000.

[9] M. Weiss, M. Elsner, F. Kartberg, and T. Nilsson, Anomalous subdiusion is a measure for
cytoplasmic crowding in living cells.,

Biophys J, vol. 87, no. 5, pp. 35183524, 2004.

[10] R. Metzler and J. Klafter, The random walk's guide to anomalous diusion: a fractional dynamics approach,

Phys. Rep., vol. 339, no. 1, pp. 177, 2000.

[11] T. J. Dolinsky, J. E. Nielsen, J. A. McCammon, and N. A. Baker, Pdb2pqr: an automated

pipeline for the setup of poisson-boltzmann electrostatics calculations.,

Nucleic. Acids. Res.,

vol. 32, pp. W665W667, 2004.

[12] N. A. Baker, D. Sept, S. Joseph, M. J. Holst, and A. J. McCammon, Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

vol. 98,

no. 18, pp. 1003710041, 2001.

[13] K. Turnheim, J. Gruber, C. Wachter, and V. Ruiz-Gutierrez, Membrane phospholipid composition aects function of potassium channels from rabbit colon epithelium,

Physiol, vol. 277, no. 1, pp. C8390, 1999.

[14] C. Antz and B. Fakler, Fast inactivation of voltage-gated K

ture.,

News Physiol. Sci., vol. 13, pp. 177182, 1998.

Am J Physiol Cell

channels: From cartoon to struc-

[15] K. Maysiak and Z. J. Grzywna, Ball and chain inactivation with smoluchowskitype equation,

Submitted to Europhysics Letters.

25