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Transformacin mediada por Agrobacterium de embriones maduros de Triticum

aestivum y Triticum durum


Transformacin gentica de plantas de cultivo de Agrobacterium mediada por co-cultivo
es una eficiente y rentable mtodo para la entrega del gene. Monocotiledneas
las plantas, incluidos los cereales importantes se pensaba antes de ser recalcitrantes a
genes mediada por Agrobacterium transfer1, 2, pero el escenario ha cambiado en los
ltimos aos. Coherente los esfuerzos de los investigadores en los cultivos de cereales
han dado como resultado en el desarrollo de protocolos para la prestacin eficiente del
gene a travs de Agrobacterium en rice3, 4, maize5, barley6 y el trigo
Uno de los puntos clave de estos protocolos ha sido el uso de divisin activa clulas o los
tejidos como los embriones inmaduros e inmaduros callos derivadas de embriones que se
co ms cultivadas con Agrobacterium en presencia de inductores potentes de la virulencia
genes8. Mooney y coworkers9 fueron los primeros en demostrar la herida independiente
en el apego in vitro de Agrobacterium a los embriones de trigo. Posteriormente, Chen y
Dale10 reportado una mayor frecuencia de la infeccin mediante la incubacin de
exposicin meristemas apicales de semillas secas de trigo con Agrobacterium. El trabajo
previo de este laboratorio tambin inform de la expresin transitoria de gus gen en
meristemticas bases de las hojas, los callos, las semillas maduras y mesocotilo plntulas
perforado siguientes co-cultivo con diferentes cepas y vectores de Agrobacterium
tumefaciens11.
Estable mediada por Agrobacterium transformacin de trigo y la transmisin de los
transgenes a posteriores generaciones se han reportado por muchos workers7 ,12-15.
No obstante, la aplicacin a gran escala de esta metodologa en diversos genotipos sigue
siendo restringido. El presente estudio se centra tanto en el uso de extirpados maduros
embriones y madura callos derivadas de embriones como principal
explantes para la transformacin mediada por Agrobacterium de trigo pan (Triticum
aestivum) y tambin los macarrones trigo (Triticum durum). El protocolo optimizado fue
posteriormente utilizado para la introduccin de inhibidor de proteasa de patata
(Pin 2) de genes en T. aestivum y T. durum, el el uso exitoso de los cuales haba
conferido resistencia a los insectos en japonica rice16. El uso de inhibidores de la
proteasa para genticos ingeniera de resistencia a los insectos en el trigo tambin se ha
reported17.
Aqu mostramos la transformacin mediada por Agrobacterium de T. aestivum y T. durum
uso de embriones maduros como explantes destinatario.
MATERIALES Y MTODOS
Planta de los materiales y las condiciones de cultivo.
Las semillas de T. aestivum cvs HD2329, PBW343 CPAN1676, y T. durum cvs PDW215,
PDW233 y WH896 se obtuvieron de IARI, Nueva Delhi, as como la Direccin de
Investigacin de Trigo, Haryana parcial, la India. Las semillas fueron inicialmente se lava
con un detergente lquido (Teepol, Reckitt & Coleman, de la India) durante 1 minuto con
agua del grifo, y superficie esterilizados con etanol absoluto durante 30 s seguida un 4%
(v / v) de hipoclorito de sodio durante 30 min. Las semillas se lavaron bien con agua
estril antes de madurar embrin de la escisin en una campana de flujo laminar.
Embriones maduros fueron extirpados mediante la eliminacin de la parte del endospermo
de la superficie esterilizada cariopsis con una cuchilla estril.
Medium18 MS suplementado con 200 mg / l hidrolizado de casena y 100 mg / l de inositol
designado como MSE19, se utilizados en esta investigacin. El pH del medio de cultivo
se ajust a 5,8 con 1,0 M NaOH / HCl. Despus del ajuste de pH, Phytagel (0,4%) fue
aadido como la gelificacin agente (Sigma, EE.UU.) y en autoclave a 121 C y 1,08
kg/cm2 de presin durante 15 minutos. Madura a lo largo de embriones con el escutelo
adjunto se colocaron en el medio MSE2 con el eje embrionario lado hacia abajo, como
la germinacin precoz de embriones maduros fue drsticamente reduce cuando los
embriones fueron colocados de forma. Los explantes se cultivaron en MSE2 durante tres
semanas en un lugar oscuro a 26 1 C con subcultivo regular a intervalos semanales.
Los diferentes medios de comunicacin utilizados se enumeran en la Tabla 1.

Cepa bacteriana y los vectores del plsmido A. tumefaciens strain 20 LBA4404 y los
vectores binarios (P35SGUSINT, pBI101:: Ley y pCAMBIA3301:: pin 2) fueron empleados
para las transformaciones mediada por Agrobacterium.
Para la evaluacin de los parmetros involucrados en Agrobacterium transformaciones
mediadas, las construcciones pCAMBIA1301, pCAMBIA2301 y pCAMBIA3301 tambin
utilizados. Para la construccin del vector binario pBI101:: A1, el arroz ACT1-5 regin
se ha escindido del plasmid21 pDM302 como un fragmento HindIII de 1,5 kb y se clon en
el vector pBI101 (Clontech). Para la construccin de pCAMBIA3301 :: Pin2, el cassette de
expresin de la papa inhibidor de la proteasa (pin2) del gen fue suprimido en un 3,0 kb
PstI fragmento del pTWa vector de 16 y clonado en pCAMBIA3301 (ref. 22). El binario
vector23 p35SGUSINT fue aislado de la cepa GV2260 Agrobacterium y movilizado
por triparental mating24, 25 en A. tumefaciens cepa LBA4404.
Transformacin
Los cultivos bacterianos fueron iniciadas por la inoculacin de 50 l de accin del glicerol
en 30 ml de medio LB + (medio LB suplementado con 0,5% de glucosa) con 100 g / ml
de rifampicina, 100 g / ml de sulfato de kanamicina y 200 M acetosiringona.
Los cultivos se incubaron a 28 rpm C/200 . Por la transformacin de plantas, cultivos
bacterianos con A600 (absorbancia a 600 nm) de un valor de 0,5 a 1,00 fueron elegidos.
La extirpados embriones maduros o tres semanas de edad madura embrin callos
obtenidos fueron inoculados por inmersin en suspensin bacteriana e incubando durante
1 hora despus de lo cual los explantes se transfirieron a medio MSE2As. Co-cultivo
se realiz mediante la incubacin de las placas de Petri a los 28 C en oscuridad durante
2-3 das.


Seleccin y regeneracin de los transformantes. Despus de 2-3 das de co-cultivo,
los explantes fueron lavados en MSE2Cef250 lquido para eliminar Agrobacterium y
despus de varios lavados, puestos en las hojas estriles secante para eliminar el exceso
de humedad y se transfiere a MSE2Cef250 medio suplementado con 100 mg / l
paromomicina (por LBA4404 (PBI101: ACT1) y LBA4404 (p35SGUSINT)) o 5 mg / l
fosfinotricina para LBA4404 (pCAMBIA3301:: pin2). La explantes maduras de embriones
se cultivaron en MSE2Pm100Cef250 o MSE2P5Cef250 durante dos semanas. Explantes
mostrando callosidades en el medio de seleccin fueron trasladados a un nuevo
MSE2Pm100Cef250 o medio MSE2P5Cef250 y se mantendr durante diez das. Los
callos maduras derivadas de embriones tambin cultivadas en MSE2Pm100Cef250 o
MSE2P5Cef250 por tres semanas con una subcultura en el medio.
Para la regeneracin, los explantes se transfirieron a MSER medio suplementado con 2,5
mg / l fosfinotricina 50 mg / l paromomicina. Despus de 10 das en MSERP2.5 o
MSERPm50, los explantes se transfirieron a selectionfree medio de regeneracin y
despus de otros 10 das, el plntulas regeneradas fueron trasladados a MS1 / 2
suplementado con 2,5 mg / l fosfinotricina o 50 mg / l paromomicina de elongacin de
ramas. Las plntulas regeneradas fueron transferido a la transferencia de los enchufes
(Sigma) y se mantuvo durante cerca de diez das hasta que el sistema de races
firmemente establecido. plntulas enraizadas fueron transferidas a macetas que
contenan una mezcla de soilrite (Kel perlita, Bangalore, India) y el jardn del suelo (1, 1) y
ha crecido a la madurez en cmaras de crecimiento (Conviron, entornos de control
limitada, Winnipeg, Canad) que funcionan en 21 a 18 C a las 16 h luz / 8 / ciclo de
oscuridad. Las plantas se suministran con un lquido medium26 recomienda
para el crecimiento de plntulas de trigo.

Ensayo de enzima. Ensayo GUS: La actividad del gen gus fue bien localizados
histoqumicamente en los explantes o cuantitativamente determinada por el mtodo de
espectrofluoromtrico de acuerdo con la protocolo descrito por Jefferson et al.27.
Histoqumico localizacin de GUS se llev a cabo mediante la incubacin del tejido
muestras de la noche a 37 C en tampn de histoqumica (0,1 M de tampn fosfato de
sodio, pH 7,0, 50 mM EDTA; 0,5 mM K3Fe (CN) 6, 0,5 mM K4Fe (CN) 6, 0,1% Triton X-
100, 1 mg / ml de X-gluc (Amresco Inc., Ohio, EE.UU.)). Los explantes se lavaron a fondo
con etanol al 70% antes de las observaciones mediante un estereomicroscopio (Nikon,
SMZU).
Para la estimacin cuantitativa de la actividad de gus, las muestras fueron incubaron con
300 l de tampn de ensayo GUS (1,0 mM MUG en tampn de extraccin GUS) a 37 C
durante 15 horas y 900 l de dejar de tampn (0,2 M de Na2CO3), agreg. fluorescencia
relativa de las muestras se midi en cubetas de cuarzo de slice, empleando
unspectrofluorophotometer RF540 (Shimadzu, Japn) en una longitud de onda de
excitacin de 365 nm y de emisin longitud de onda de 455 nm. Las unidades se
convirtieron fluoromtricos en cantidad de 4-MU utilizando una curva de calibracin.
Especficos actividad se expresa en trminos de pmol o nmol de 4-MU mg de protena / h.
Cualquier actividad GUS observada en los controles se deducirse para obtener los valores
finales.
NptII punto blot: El nptII punto blot se realiz segn el protocolo de Roy y
Sahasrabuddhe29. La mancha fue envuelto en film transparente y expuesto a una pelcula
de rayos X (Kodak, la India) en Hypercassettes (Amersham, Reino Unido) a -20 C
durante 2-3 das, dependiendo del que cuenta. La pelcula X-ray fue desarrollado para
detectar nptII actividad en la forma de la intensidad de los puntos.

NptII funcional del ensayo: El ensayo funcional de nptII gen se performed21 en plntulas
de trigo en las tres hojas etapa por pulverizacin con una solucin de 2% (w / v)
paromomicina y el 0,1% de Tween-20. Por otra parte, las secciones 1.2 cm de las puntas
de las hojas fueron pintadas con una solucin de paromomicina con un bastoncillo de
algodn. La respuesta se observ despus de siete das de aplicacin paromomicina. Las
plantas con un funcional gen nptII mostraron poco o ningn dao. Sin embargo, las
plantas carecen de un gen nptII funcionales fueron identificados por el presencia de
manchas blanqueada en toda la hoja, que posteriormente afectada su supervivencia.
Fosfinotricina hoja pintura ensayo: La progenie de plantas transgnicas con el gen bar
como el marcador de seleccin se analiz mediante el ensayo de la hoja de pintura. Hoja
de pintura realizarn segn lo descrito por Lonsdale et al.30 una solucin de fosfinotricina
(150 mg / l) y 0.1% Tween-20 se aplic a las secciones de la hoja, tres veces por semana
a intervalos de dos das.Ausencia de dao necrtico en comparacin con los controles se
tomado como evidencia para la expresin de transgenes bar.
Aislamiento del ADN y el anlisis del Sur ADN genmico total fue aislado de hojas de
trigo de acuerdo a Dellaporta et al. La sonda fue marcada radiactivamente utilizando
Megaprime ADN kit de etiquetado (Amersham International Inc. Reino Unido) y (a-32P)
ATP (Brit, Hyderabad, La India), de acuerdo a las especificaciones del fabricante.
La hibridacin se llev a cabo durante 16-24 horas a 37 C con agitacin a 40 rpm. La
mancha fue lavada en secuencia, con las siguientes soluciones durante 10 minutos cada
uno: (i) 50% formamida, 5X SSC, SDS 0,1%, (ii) 2X SSC, SDS 0,1%; (Iii) 1X SSC, SDS
0,1% y (iv) O.5 SDS X SSC, 0.1%.

Anlisis de PCR El anlisis por PCR del ADN genmico se llev a cabo utilizando 200 a
300 ng de ADN genmico de trigo que emplean reactivos de MBI Fermentas (EE.UU.) en
un volumen de reaccin de 25 l de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Amplificacin por PCR se realiz por desnaturalizacin inicial a 94 C (5 min espera),
seguido por 25 ciclos a 94 C (30 s), recocido (30 s) y 72 C (30 s) y, finalmente, la
celebracin de 72 C (7 min) de extensin, empleando un Perkin-Elmer Gene Amp PCR
sistema de 2400. Las cartillas de avance y retroceso empleados para la amplificacin del
gen nptII fueron 5 -TCG TCG ATG ACTO GGG CAC AAC AGA-3 (NPTF) y 5 -AAG
AAG GCG ATA GAA GAT GGC GCG-3 (nptr), respectivamente. Cebadores utilizados
para la deteccin del gen bar de 5 -ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC G-3 (bar5) y 5
-TCT AGC TGA AAC AAC GTG C-3 (Bar3). Recocido temperaturas para la
amplificacin de los genes nptII y el bar 57 y 50 C, respectivamente. Los productos de
PCR se corrieron en un 1,6% gel de agarosa en TAE 1X junto con marcadores de tamao
(GeneRulerTM 1 kb escalera y escalera GeneRulerTM 100 pb, MBI Fermentas).

Resultados estudios de regeneracin en el trigo se han confinado principalmente a los
bases de las hojas, los embriones inmaduros, escutelo y inmaduros inflorescencia
tissue32, de 33 aos. A pesar de embriones maduros han sido los explantes de eleccin
para la regeneracin y la transformacin experiments34-37, su uso no es frecuente. En el
presente investigacin, los embriones maduros (ME) se han utilizados para evaluar la
regeneracin y la transformacin respuesta en tres cultivares de cada uno de T. aestivum
y T. durum, empleando diversos medios de comunicacin (Cuadro 2). En general, todos
los cultivares de T. aestivum y T. durum experimentado con que aparecen respuesta
razonable a la regeneracin MSER, y este ha sido el medio elegido para la regeneracin
del presente estudio. Sin embargo, algunas diferencias en callosidades y la regeneracin
de diferentes cultivares fueron evidentes, por ejemplo T. aestivum cv. HD2329 que
aparecen la mayor callosidades pero bajo la regeneracin. En cambio, en T. duro
cv WH896 aparecen callosidades pobre pero relativamente un la regeneracin de un
mayor porcentaje. Mayor regeneracin de acerca de 67 a 68% se observ en el cv T.
aestivum. CPAN1676 y T. cv duro. PDW233 (Tabla 2).

Factores que influyen en la entrega del gene La presente investigacin explora la
conveniencia de extirpar embriones maduros, as como el embrin madura derivados
callos a la infeccin agrobacterial. Extirpados maduros embriones fueron seleccionados
para la transformacin mediada por Agrobacterium, como la respuesta de la regeneracin
de este explante se encontr que era comparable a la de los embriones inmaduros en la
cultura. embriones maduros fueron extirpados de forma asptica superficie esterilizada
semillas y co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens LBA4404 albergar los vectores
binarios (PBI101:: ACT1 y pCAMBIA3301:: pin2). En general, dos observaciones
importantes se registraron. En primer lugar, el co-cultivo duracin de 2-3 das fue ms
eficaz que otros, como lo demuestra la determinacin cuantitativa de actividad GUS-
especficos (Tabla 3). En segundo lugar, el T. aestivum cultivar CPAN1676 era ms
receptivo a Agrobacterium la transferencia de genes mediada en comparacin con T.
durum PDW215 cultivar, especialmente en presencia de los inductores del vir
como acetosiringona (Figura 1). La actividad GUS de un explante individuales (embrin
maduro) de T. aestivum Se observ siempre a ser ms duro que el de T. siguientes
co-cultivo con Agrobacterium (Figura 2).
Acetosiringona se complet tambin en las bacterias medio de cultivo, la resuspensin de
mediano y cultivo co-medio como un inductor. Esto es coherente con las anteriores
observaciones en el caso del arroz y wheat8, la transformacin 10. En presencia de
acetosiringona, plsmido diferentes construcciones muestran diferentes preferencias para
diferentes genotipos (Tabla 3). Tales preferencias genotpicas estn bien documentados
en la literatura. La idoneidad de madurez embryoderived callos en explantes de mediada
por Agrobacterium transformacin fue evaluada despus de 2-3 das de cocultivo con
Agrobacterium. Los experimentos preliminares detecta la actividad del gen gus hasta 45
das despus de co-cultivo de callos derivadas de embriones maduros de T. aestivum
cv. HD2329 con LBA4404 (p35SGUSINT). Por lo tanto, esta combinacin de vectores
genotipo fue empleado para generacin de plantas transgnicas. La transformacin
gentica metodologas y las condiciones fueron similares a los optimizados para los
embriones maduros, excepto que la precaucin ms se observ para minimizar los daos
en el lavado de cefotaxima paso. As, tres das de co-cultivo se encontr que era ideal
para la transferencia de genes con xito como lo demuestra histoqumicas localizacin de
expresin de GUS y tambin fue confirmado por el ensayo GUS fluoromtricos de
madurez embryoderived callos de tres cultivares de cada uno de T. aestivum y T. durum
utilizando cuatro diferentes construcciones (Tabla 3).

Seleccin y regeneracin de los transformantes Embriones maduros de T. aestivum
cv. CPAN1676 y T. duro cv. PDW215 fueron extirpados aspticamente de las semillas y
co-cultivadas con A. tumefaciens LBA4404 (pBI101:: ACT1). Despus de tres das de co-
cultivo seguido por cuidadoso lavado, los embriones maduros de T. aestivum var
CPAN1676 fueron trasladados a MSE2Pm100Cef250 de callos la induccin de
aproximadamente 2-3 semanas. Formacin de callo se observ en MSE2Pm100Cef250
en 35 y el 16% de cocultivated explantes y explantes no transformados, respectivamente.
Aproximadamente el 80% de los embriones maduros (de control) formaron callos en
MSE2. En cv T. durum. PDW215, callos formacin en MSE2Pm100Cef250 se observ en
32 y el 12% de co-cultivadas y transformadas embriones maduros respectivamente
(Figura 2 d, e), y la induccin de callos fue alrededor del 78% en los explantes de control
en MSE2. El crecimiento de explantes no transformados se redujo cuando los callos
Posteriormente fueron trasladados a MSE2Pm100 para seguir multiplicacin. callos no
transformada no mostr crecimiento en MSE2Pm50, sin embargo, los callos derivados de
co-cultivo embriones maduros mostraron un crecimiento en MSE2Pm100. Despus de
cuatro semanas de co-cultivo, tanto en la proliferacin y no proliferativos callos fueron
transferidos a MSERPm50 para regeneracin. Despus de 2-3 semanas, la regeneracin
plntulas se transfirieron ms de MS1 / 2 de elongacin de ramas (Figura 2 f) y,
posteriormente, se traslad a la transferencia de los enchufes para el refuerzo del sistema
radical (Figura 2 g). Maduro callos derivadas de embriones se encuentran entre los
preferidos explantes con una respuesta de la regeneracin (~ 60%) son comparables a la
observada a partir de callos derivados de los inmaduros embriones. Sin embargo, esto
exige una mayor atencin de explante durante la manipulacin y dao fsico a los callos
se refleja en la respuesta de la regeneracin reducida y la transformacin eficiencia, as.
Maduro callos derivadas de embriones son particularmente propensos a daos durante el
antibitico de lavado paso, que es necesario para la eliminacin de Agrobacterium.
Mientras se lava como resultado la prdida de las clulas competentes, insuficiente el
lavado con cefotaxima generalmente como resultado de la necrosis y en la no
recuperacin de la regeneracin de callos de co-cultivo de explantes. As, en varios
experimentos a pesar de la proliferacin de los callos en el medio de seleccin, no hay
regeneracin se obtuvo de la madurez embryoderived callos. La regeneracin de
plntulas se obtuvo de los embriones maduros de co-cultivo en varios independientes
experimentos, sin embargo, los datos presentados son de dos experiencias exitosas que
indican una transformacin la eficiencia del 5,57% (16 transformantes supuesto un total
de 287 co-cultivo de explantes) con el cv T. aestivum. HD2329, calculado sobre la base
de la hoja de paromomicina pulverizacin de transformantes T0.

Anlisis de PCR amplificacin por PCR se llev a cabo para detectar la presencia del
gen bar en el transformantes transformadas con LBA4404 (pCAMBIA3301:: pin2). Las
muestras de hojas se recogida de transformantes putativos inmediatamente despus de
la regeneracin, pero antes de la transferencia de las plntulas a halfstrength medio MS
suplementado con 2,5 mg / l fosfinotricina. Plantas anot como positiva (Figura 3a) en la
base de un anlisis de PCR (presencia de un producto amplificado de ~) 296 pb tambin
sobrevivi en MS1/2P2.5, mientras que las plantas calific como algo negativo por anlisis
de PCR no fueron capaces de sobrevivir (25%), lo que confirma la autenticidad prctica
de la PCR y la fosfinotricina seleccin (Figura 3a, donde tres cuartas partes de las plantas
son la PCR-positivo). Sobre la base de la resultado de ensayo de pintura fosfinotricina
hoja y PCR anlisis, la transformacin de la eficiencia por el co-cultivo de embriones
maduros de T. aestivum cv. HD2329 con Agrobacterium LBA4404 cepa (pCAMBIA3301::
pin 2) se casi el 1,77%. amplificacin por PCR se llev a cabo ms de detectar la
presencia, as como la segregacin del gen nptII en la progenie T1 de T. aestivum
transformantes CPAN1676 transformadas con LBA4404 (pBI101:: ACT1; Figura 3 b).
El ADN genmico de transformantes putativos de T. aestivum HD2329 (LBA4404
(p35SGUSINT)) por co-cultivo de callos maduras derivadas de embriones fue
deteccin por PCR especfica para el empleo nptII. Amplificacin por PCR del gen nptII en
el ADN genmico muestras de transformantes T0 indica una transformacin exitosa
evento (Figura 3 c), que se evidencia por el presencia de un producto de amplificacin del
tamao esperado (~ 721 pb).
NPTII ensayo Las plntulas transformado (8-10 cm de largo) que crecen en las plntulas
bandejas fueron rociados con una solucin de 2% w / v paromomicina sulfato y el 0,1% de
Tween-20. Despus de siete das, transformado las plantas que aparecen poco o ningn
dao siguientes paromomicina pulverizacin. plantas no transformadas de control
desarrollado puntos blanqueada y, posteriormente, aparecen importantes la inhibicin del
crecimiento (Figura 2 l). La actividad de nptII gen se confirm por punto de ensayo-blot de
los transformantes de T. aestivum var CPAN1676 y cv T. duro. PDW215 prueba (Figura 4
b), las cuales fueron seleccionadas en el base de paromomicina hoja de aspersin de los
resultados. Transformacin frecuencias observadas en el caso de T. aestivum y T. durum
fueron 1.6 y 1.28% respectivamente, con la construccin LBA4404 (pBI101:: ACT1).
Cuando la construccin LBA4404 (PCAMBIA:: pin 2) se utiliz, la eficiencia de
transformacin de 1,77 y un 1,54% se observ en T. aestivum y T. duro, respectivamente.
Sin embargo, la respuesta de crecimiento de T0 transformantes fue pobre en comparacin
con los no transformados plantas de control. establecimiento de semillas se observ en el
40 y el 33,33% de los transformantes de T. aestivum y T. durum, respectivamente, e
incluso la calidad de las semillas no fue satisfactoria. Probablemente esto podra deberse
a la falta de disponibilidad de las condiciones de crecimiento ptimo.

El sur de anlisis de transformantes T0 El ADN genmico de transformantes T0 de T.
durum obtenidos despus de co-cultivo de embriones maduros con LBA4404 (PBI101::
ACT1) fue digerido con EcoRI y borrados en membrana de nylon y se hibrid con un gus-
especfica sonda. La digestin de pBI101:: ACT1 edite un 3,3 kb ~ fragmento que tiene la
regin de codificacin de Gus, una parte de arroz ACT1-5 regin y terminador NOS. Un
fragmento especfico hibridacin de GUS se observ en las lneas transgnicas prueba.
Esta observacin confirma la presencia de los gus gen en los transformantes
seleccionados (Figura 4 a). ADN mancha de transformantes primarios de T. aestivum cv.
HD2329 transformadas con LBA4404 (pCAMBIA3301:: pin 2) se prob con un fragmento
de 1,5 kb BamHI del pCAMBIA3301:: pin 2 que contiene el cdigo PIN2 regin y tambin
un pin2-3 terminador . El sur de anlisis de BamHI-digerido muestras revelaron la
presencia de la hibridacin seales en el rango de 1,5 kb en el transformantes T0 prueba.
EcoRI-digerido muestras de ADN genmico mostrar la presencia de bandas dehibridacin
(Figura 5), lo que demuestra la presencia de genes en el pin2 regenerantes T0.

Anlisis de la progenie Como se mencion anteriormente, el T. aestivum transformantes
T0 produce pocas semillas y la mayora de las semillas estaban mal desarrollados. De
una planta T0 representante, tres de cada diez semillas germinaron con xito en un medio
de resistencia MS. Despus de paromomicina pulverizacin de las plntulas de siete das
de edad, una de las plantas T1 desarrollado extensas manchas amarillas en las hojas,
mientras que las otras dos plantas sufrido poco o ningn dao (Figura 2 l). Presencia del
gen nptII en dos de las plantas T1 tambin fue confirmada por la amplificacin por PCR de
muestras de ADN genmico con primers nptII especfico (Figura 3 b). plantas T1 tambin
se muestra un mayor crecimiento de las plantas T0 (Figura 2 j), en macetas que contenan
una mezcla de tierra de jardn y soilrite.
Discusin
Los cereales, especialmente trigo, se consideraban recalcitrantes a la transformacin
mediada por Agrobacterium. Sin embargo, desde el primer informe xito de trigo
transgnico frtil plants7, ha habido un progreso considerable. Hay varios factores que
que influyen en el xito gentica mediada por Agrobacterium transformacin de trigo han
sido exploradas por varios los trabajadores en un intento de lograr una mayor eficiencia
de transformacin- Figura 5. ciency9, 13,12,35. Las ventajas de utilizar el Agrobacterium
enfoque mediada implican la capacidad de transferir grandes segmentos de ADN con un
mnimo de reordenamiento, con menor nmero de copias en una mayor eficiencia
efectuados con un mnimo de costo. De tal modo, como un enfoque da como resultado la
segregacin simple patrn, ms frecuencia de la transformacin y la ausencia de
secuencias de vector columna vertebral. Por otra parte, en ADN transformacin mediada
por Agrobacterium general se inserta en transcripcionalmente activa regions38 a travs de
ilegtima recombinacin, lo que garantiza la transcripcin activa / expresin de los
transgenes. la eficiencia de transformacin del trigo puede ser influenciada por muchos
factores, tales como el genotipo, tipo de explante, optimizado condiciones de la
inoculacin y el cultivo de cooperacin, optimizado callosidades y regeneracin de
plantas, seleccin de medios, cepa de vectores y Agrobacterium, etc.13. La presente
investigacin se inici para desarrollar una eficiente entrega de genes protocolo para el
trigo pan y trigo duro. Se han estudios limitados sobre la transformacin gentica del trigo
a travs de Agrobacterium co-cultivo y los pocos informes demostrar el xito de la
produccin de transgnicos las plantas de trigo. La mayora de la investigacin mediada
por Agrobacterium ha empleados embriones inmaduros, precultivado embriones
inmaduros, y sus callos embriognicos para la co-cultivation7, 16,35,36.
Para la introduccin eficiente de los genes del ADN-T en recalcitrantes explantes, varios
grupos han empleado diferentes enfoques como la mejora de la expresin de los genes
vir (por hiriendo a) o la promocin de la adhesin de Agrobacterium a los tejidos de la
planta. Diversos enfoques incluyen mecnica abrasin de trigo seeds11, el uso de
surfactants7, agrolistics39, uso de fibras de carburo de silicio por herir de inmaduros
embryos40 trigo, y someter a los tejidos vegetales para informar perodos de la ecografa
en la presencia de Agrobacterium (Transformacin mediada por Agrobacterium
sonicacin-asistida) 41. La tcnica aqu presentada consiste en la extirpacin de
embriones maduros: es simple y cumple con las heridas de base requisito y no requiere
medios especiales. En la presente investigacin, nuestras eficiencias de transformacin
(1,28-1,77%) son comparables con los reportados earlier7, 12,13,42,43, aunque no
hemos sido capaces de caracterizar en detalle los patrones de segregacin debido a la
escasez de transgnicos eventos. transformacin mediada por Agrobacterium ha ha
informado de lograr un mximo de 4,4% transformacin la eficiencia mediante la
construccin de aroA:: CP4 e inmaduros embriones como explants12.
El factor clave de xito en la generacin de transgnicos plantas es la optimizacin de las
condiciones para la regeneracin de las plntulas despus de varias rondas de seleccin
con el herbicida / antibiticos, que es tambin necesario para la eliminacin de
escapa. Nuestro trabajo tambin hace hincapi en las perspectivas de paromomicina y
fosfinotricina como la seleccin efectiva agentes para la transformacin del trigo, y esto es
consistente con las observaciones anteriores investigators2, 17. Estrategias a aumentar la
frecuencia de la transformacin implica optimizacin de parmetros tales como el uso
adecuado de los explantes junto con la optimizacin de los factores que promueven
Agrobacterium infeccin. Puesto que hay dos pasos limitantes, agroinfection y la
regeneracin de los callos transformados, enfoques tales como la transformacin de
inmaduros / embriones maduros en lugar de inmaduros / madura embryoderived
callos limitar la duracin del tiempo sin obstaculizar la capacidad de regeneracin de los
explantes. En el presente investigacin, callosidades y la regeneracin se optimizaron
para lograr transformaciones reproducibles, normalizado, segn prdida de potencial de
regeneracin a travs del tiempo ha sido una de las principales limitacin en la mayora
de experimentos de transformacin de trigo. Esta prdida de potencial de regeneracin,
especialmente durante prolongados la cultura, ha sido superado por que se completa el
medio de regeneracin con poliamina espermidina para mejorar recuperacin de
regenerantes de transformarse calluses14. Sin embargo, en la transformacin actual
enfoque directo de los embriones maduros se llev a cabo para minimizar la prdida del
potencial de regeneracin debido a la cultura prolongada. En la presente investigacin, se
utiliz LBA4404 como la cepa de Agrobacterium de eleccin. El xito de la produccin de
las plantas transgnicas se logr mediante co-cultivo de embriones maduros y maduras
callos derivadas de embriones. Nuestras investigaciones de apoyo las observaciones de
otros investigadores, que recomiendan el uso de acetosiringona y la glucosa para su
inclusin en la inoculacin y la cultura co- medium7. Acetosiringona fue empleado tanto
en la inoculacin as como el medio de co-cultivo, resultando en aumento de 1,5 a 2 veces
en la expresin transitoria de la actividad de gus, validando as la observacin de otros
workers42, de 43 aos. transformacin de trigo duro se ha logrado con xito utilizando el
biolstica approach37 ,44-48, pero por Agrobacterium transformacin mediada an no se
ha logrado. Los vectores utilizados con xito en este estudio son convencionales vectores
binarios, mientras que los vectores supervirulent (Con copias adicionales de virB, Virc y
virG del A281) que han sido ampliamente utilizados para la transformacin de arroz
y maize4, 5 no parecen ser esenciales para la transformacin del trigo, que esta
observacin tambin es compartida por otros coworkers7. En el vector binario pBI101: A1,
el gen gus est bajo el control de un promotor monocotiledneas (arroz ACT1) para
expresin especfica en los tejidos vegetales y contiene el gen gus un intrn en el
pCAMBIA3301 vectores:: pin2 y p35SGUSINT, que bloquea de manera eficiente su
expresin en bacterias, excluyendo as a los falsos positivos. El antibitico / la naturaleza
resistente a los herbicidas de los tejidos transgnicos demuestra que los genes
marcadores seleccionables estn activos en el trigo. Los resultados de los ensayos de
resistencia a los antibiticos y herbicidas se observaron ser consistentes con los de
anlisis molecular. La transformantes que un resultado positivo sobre la base de ensayos
de resistencia a los antibiticos y herbicidas tambin se detectaron positivos por anlisis
de Southern y PCR con la respectiva genes. Se observ una correlacin directa se
observ (datos no presentados) entre la expresin del pin 2 en T. durum y la resistencia
contra el nematodo del quiste de los cereales, Heterodera avenae49.
En nuestro laboratorio, la idoneidad de los embriones maduros como explante de partida
para la transformacin del trigo se ha demostrado demostrado tambin en experimentos
de permeabilizacin celular que involucra mecnicamente aislada embriones con
membrana permeabilizante agents35 y por bombardeo de partculas de basales de
embriones derivados de calluses48. Por lo tanto, parece que embriones maduros son un
excelente sistema de Agrobacterium transformacin mediada, ya que no slo son
convenientes debido a su facilidad de disponibilidad, sino tambin que manejo de grandes
cantidades en un plazo razonable, por lo tanto ayudar a la recuperacin de los
transgnicos. En el presente estudio, la mayora de las plantas regeneradas alcanzado la
madurez y las semillas de conjunto, y el anlisis ulterior de los transformantes se indica la
ausencia de las secuencias de vector columna vertebral y se confirm la integracin de T-
ADN en las copias de baja, lo que resulta en la segregacin simple patrones. tcnicas de
transformacin gentica con frecuencia ha asociado con aberraciones en la morfologa y
la fertilidad de las plantas. Los transformantes T0 obtenidos en el presente estudio
crecimiento que aparecen pobres en comparacin con plntulas regeneradas a partir de
callos sin transformar en un medio de seleccin libre. Sin embargo, la progenie T1 pareca
ser fenotpicamente normal y similares en la morfologa de control de semillas derivadas
de plantas.

Conclusin
Un mtodo reproducible para la produccin eficiente de los transgnicos las plantas de
trigo con A. tumefaciens con una frecuencia de cerca de 1,28 hasta 1,77% se ha logrado
tanto en el pan trigo, as como el trigo duro. Aunque no significativo se observaron
diferencias en la eficiencia de transformacin en condiciones similares, el nivel del gen
gus transitoria expresin se observ siempre a ser mayor en T. aestivum variedades en
comparacin con las variedades de T. durum. La razn para esto es difcil de determinar y
probablemente reside en el mejor optimizado las capacidades de regeneracin de T.
aestivum en comparacin con T. durum. transformacin mediada por Agrobacterium la
eficiencia puede ser mejorada por los factores que activan los genes vir y aumentar la
susceptibilidad de las clulas vegetales contra Agrobacterium como acetosiringona,
monosacridos (Incluyendo phytohormonal, CaCl2 y osmtica tratamientos). El presente
estudio se centra en la hasta ahora inexplorada el uso de embriones maduros como
explantes propicio transformacin mediada por Agrobacterium. Los factores que repercutir
en la entrega de T-ADN y la regeneracin son similares a las observadas cuando se
emplean embriones inmaduros, tales como la duracin de la pre-cultura, y tambin la
inoculacin y co-cultivo parameters13. Sin embargo, hemos desarrollado un mtodo para
la produccin de trigo transgnico por A. tumefaciens aplicables tanto para el trigo pan y
trigo duro trigo, lo que demuestra la independencia genotpica considerable.