PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA

INDICE
Pgina
Introduccin y observaciones preliminares 1
Material por pareja 2
Medios de cultivo 3
Esterilizacin 4
Siembra de microorganismos 5
Fermentacin de azcares 6
Observacin de las bacterias 6
Ensayos bioqumicos estandarizados 8
Antibiosis 9
Actividad catalasa 11
Anlisis microbiolgico de aguas contaminadas 11
Transferencia gentica entre bacterias Gram negativas
Conjugacin 13
Transformacin 14
Titulacin de un virus bacteriano y Transduccin 15
Crecimiento bacteriano 17
Aislamiento de bacterias lcticas y produccin de yogur 18
OBJETIVOS
El objetivo de estas prcticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las tcnicas ms
comnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiologa y permitir la observacin experimental de
los conceptos aprendidos durante las clases de teora.
NORMAS DE SEGURIDAD
Aunque los microorganismos que vamos a manejar no son patgenos habituales, su ingestin
masiva o el contacto con heridas puede provocar diversos problemas. Por ello hay que seguir unas
cuantas normas de seguridad:
1) No se puede fumar ni comer en el laboratorio
2) Es obligatorio la utilizacin de la bata
3) La ropa y los objetos personales no deben mantenerse cerca de las zonas de trabajo
4) Al comenzar las prcticas conviene colocar un papel de filtro sobre la zona de
manipulacin, y retirarlo al terminar el da.
5) Lavarse las manos cuidadosamente antes de salir del laboratorio
CALIFICACIN
Cada alumno deber completar un cuaderno donde anotar con detalle los fundamentos de la
prctica correspondiente, los resultados obtenidos y la explicacin de stos.
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ORGANIZACION
Las prcticas se desarrollarn por parejas en dos periodos de una semana cada uno. El programa
diario que se describe a continuacin puede ser sujeto a modificaciones dependiendo del calendario
concreto de cada grupo.
Lunes Martes Mircoles Jueves Viernes
SEMANA 1
Preparacin de
medios de
Cultivo
Siembra Siembra Antib.
OMac.
OMic.I
Siembra API
Antib.
OMicII
Rdo. API
Rdo. antib.
Catalasa
Rdo.BacProb
Siembra Yogur
SEMANA 2
AnAguasI
Conjug. I
Transformacin I
Inoculacin
Leche
AnAguasII
Conjug.II
Transformacin
II
AnYogur
AnAguas III
Rdo. Conjug.
Rdo. Transf.
TVirus
Transduc.
Rdo TVirus
Rdo. Transduc.
CrecBact.
SEMINARIO
Abreviaturas. An.AguasI, II, III, Rdo.) Anlisis de aguas y resultados; Antib.) Antibiosis;
Rdo.Antib) Resultado antibiosis; Conjug.I,II, Rdo.) Conjugacin y resultados; CrecBact.)
Crecimiento bacteriano; OMac) Observacin macroscpica: OMicI) Observacin por contraste de
fases y tincin de Gram; RdoBacProb) Resultados de identificacin de la bacteria problema.
OMicII) Tincin de esporas; TVirus) Titulacin de un virus bacterifago; API) Ensayos bioqumicos
estandarizados. Transduc) Transduccin. AnYogur) Anlisis microscpico de yogur.
MATERIAL POR PAREJA
A cada pareja se le asignar una clave consistente en el nmero de la mesa seguido de una letra de
la A a la D y dispondr de una taquilla numerada. En esa taquilla debe de encontrarse el material para
prcticas que se indica en el listado, y es responsabilidad de cada pareja comprobar su estado al
principio de la prctica y asegurarse de que queda completo una vez concluidas stas. Diariamente hay
que abrir la taquilla con la llave localizada en el tablero junto a las pizarras ( no dejeis las llaves puestas
en los candados porque se doblan!).
Equipo:
Un trpode Rejilla para trpode
Un cristalizador Un puente de tincin
Unas pinzas Un asa de siembra
Un rotulador Un Microscopio
Una Propipeta
Coleccin de colorantes y reactivos.
Cristal violeta Lugol
Safranina Azul de metileno
Verde malaquita Etanol
Frasco lavador con agua Aceite de inmersin.
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2
MEDIOS DE CULTIVO
Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio de Microbiologa se requiere disponer de una serie
de medios de cultivo estriles. Aunque se darn ya preparados por falta de tiempo, resulta necesario
conocer los mtodos de preparacin y esterilizacin utilizados habitualmente en el laboratorio.
Los medios de cultivo que vamos a utilizar son indefinidos o naturales, porque en su preparacin
siempre se incluye algn extracto de composicin qumica desconocida. El ms utilizado, el caldo
comn o su versin solidificada con agar, es un medio que permite el crecimiento de la mayora de las
bacterias que se van a utilizar en estas prcticas, pero tambin se emplean otros que contienen
inhibidores semiespecficos como el agar de McConkey, cuyas sales biliares inhiben el crecimiento de la
mayora de las bacterias Gram positivas. En algunos casos, se utilizarn medios que contienen
componentes tales como indicadores de pH que cambian de color cuando el microorganismo realiza una
actividad metablica preferente sobre substratos concretos (Ej: fermentacin).
Preparacin de medios de cultivo:
Caldo comn. Composicin por litro.
Extracto de carne 3 g
Peptona bacteriolgica 10 g
Cloruro sdico 5 g
Para prepararlo, se aaden los distintos componentes en un matraz de dos litros, se disuelven en
agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 (en nuestro caso no es necesario porque el pH queda ajustado
directamente) se lleva al volumen !inal correspondiente. Posteriormente, se reparten, utilizando una
jeringa "asta aca#ar con todo el volumen, $ ml%tu#o. &l resto del medio se reparte en matraces con $'
7$ ml. (os recipientes se a)slan con tapones met*licos o de algod+n graso envuelto en gasa se esterilizan
a , atm de so#represi+n durante 2' minutos.
Agar nutritivo. La composicin es la misma que la del caldo comn, pero se aade antes de esterilizar
15 g de agar por litro, disolvindolo durante la esterilizacin. Cuando an est caliente, se agita para
hacer la disolucin de agar homognea y se extiende en placas (a 45C) y en tubos, que seguidamente
son inclinados para obtener una superficie ms extensa.
Medio base para la fermentacin de azcares. Inicialmente se prepara un medio base pobre en
aminocidos de la siguiente composicin por litro:
Extracto de carne 1 g
Peptona bacteriolgica 10 g
Cloruro sdico 5 g
Una vez disueltos los componentes, se ajusta el pH a 7 y se aaden 2 ml de solucin de prpura de
bromocresol (PBC: 1.6 g en 100 ml de etanol al 45%. Se disuelve inicialmente en etanol al 95 y
posteriormente se diluye con agua) por litro. Este es un indicador de pH que vira a amarillo por debajo
de pH 5.2, por lo que permite la deteccin de la produccin de cido en el medio. El medio se reparte en
tres volmenes iguales a los que se aade 10 g por litro de glucosa, lactosa (Gal-Glu) o sacarosa (Glu-
Fru). -na vez disuelto, se reparten, utilizando una jeringa "asta aca#ar con todo el volumen, 7 ml%tu#o, en
el que previamente se "a introducido una campana .ur"am, pequeo tubo de ensayo que se dispone en
posicin invertida para detectar la presencia de gases. El medio ha de ocupar completamente el interior
de estas campanas para poder detectar posteriormente el desprendimiento de gases en la fermentaci n.
(No olvidar marcar cada tubo con la inicial del azcar que contenga). -na vez taponados, se esterilizan a
'.$ atm de so#represi+n durante 2' min.
El resto de los medios utilizados ya vienen premezclados en forma deshidratada y listos para su
reconstitucin. Las principales caractersticas a destacar de su composicin son:
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Agar de McConkey. Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que vira hacia rojo a pH cido
cuando la lactosa es fermentada. Adems, contiene sales biliares que inhiben el crecimiento de muchas
bacterias, especialmente Gram positivas.
Agar al verde brillante (AVB). Contiene lactosa, sacarosa, una elevada concentracin de aminocidos,
verde brillante como inhibidor de crecimiento de muchos fermentadores, y rojo de fenol como indicador
de pH. Los oxidativos producen amonio a partir de los aminocidos y generan color rosa. Los
fermentativos o no crecen o dan color amarillo.
Agar de tres azcares e hierro (TSI). Contiene lactosa, sacarosa y glucosa, citrato frrico y tiosulfato de
sodio, elevada concentracin de aminocidos y rojo fenol como indicador. Se prepara en tubos
inclinados pero de mucho volumen. Las bacterias se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensin
superficial. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificacin y las oxidativas rosa sobre la
superficie (basificacin). Las sulfitoreductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros
en la zona anaerbica.
Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB). Se trata de un medio rico lactosado con dos colorantes, eosina y
azul de metileno, que tambin funcionan como inhibidores del crecimiento de Gram positivos. En este
medio E.coli crece como colonias negras con brillo verde metlico.
Caldo de urea-Indol. Es un medio muy pobre y bastante tamponado
que permite determinar la presencia
de la actividad ureasa y la produccin de indol a partir de triptfano. En estas prcticas se emplear
slamente para determinar la presencia de actividad ureasa, cuya actividad provoca la degradacin de la
urea presente en el medio (un 2% p/v) a CO2 y Amonio, con la consiguinte alcalinizacin. Este cambio
de pH es detectado por cambio de color del indicador azul de bromotimol desdee el verde original al
azul intenso. Si se quisiera determinar la produccin de indol bastara aadir al medio tras la incubacin
0.3 ml el reactivo de Kovacs (reactivo IND del ensayo API), siendo positiva si se produce cambio de
color al rojo.
.
Agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe). Se trata de un medio natural muy rico que contiene polisorbato,
acetato, magnesio y manganeso que actan como factores de crecimiento para muchos lactobacilos. El
crecimiento se efectuar en medios microaerfilos empleando jarras para el cultivo de organismos
anaerbicos y un sistema comercial para la eliminacin del oxgeno.
ESTERILIZACIN
La presencia de microorganismos en todos los medios ambientales hace imprescindible que para
estudiar una bacteria determinada sea necesario destruir todas aquellas que pudieran encontrarse
contaminando los medios o los instrumentos de trabajo. Esto se consigue mediante la
ESTERILIZACION, consistente en la destruccin de todo microorganismo.
En estas prcticas vamos a utilizar especialmente el calor como mtodo de esterilizacin rutinario,
aunque tal y como se ha explicado en clase existen otras posibilidades. Los medios con contenido
acuoso han de ser esterilizados en el AUTOCLAVE mediante calor hmedo, obtenido por
calentamiento en un depsito hermtico que contiene agua y del que previamente ha sido evacuado el
aire con el fin de limitar las oxidaciones. En este sistema el vapor de agua sobrecalentado a 121 (2 atm)
o 111 C (1.5 atm) difunde muy rpidamente, haciendo que los elementos termosensibles de las clulas
se desnaturalicen, especialmente sus enzimas.
Por lo tanto, una vez preparados los medios de cultivo hay que proceder a su esterilizacin en
autoclave, realizada habitualmente a 1 atm de sobrepresin (121C) durante 15 20 min., salvo en el
caso de medios cuyos componentes sufran alteraciones tales que los hagan inadecuados para el
crecimiento. Este es el caso de los azcares utilizados en los ensayos de fermentacin, que se suelen
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esterilzar a menor presi+n /'.$ atm. de so#represi+n (,,,01)2 para evitar su "caramelizacin" , una
modificacin consistente en su oxidacin y consecuente conversin en formas txicas para el
metabolismo de las bacterias, o en el caso de la urea, que conviene esterilizarla independientemente por
filtracin.
Por otra parte, todo el material de vidrio se esteriliza mediante calor seco en el Horno Pasteur. Una
vez limpio, el material se envuelve en aluminio o se introduce en un contenedor (ej: pipetas en pipetero)
y se mantiene en el horno durante dos horas a 160C. En el caso de los portainculos que se estn
utilizando constantemente, se utiliza el calor directo del mechero, que tambin sirve para flamear los
bordes de tubos, matraces, pipetas, etc.
Prctica:
&n esta pr*ctica vamos a proceder a la preparaci+n de caldo com3n, de medios para la
!ermentaci+n de az3cares de placas de agar com3n siguiendo los protocolos descritos anteriormente (ver
4caldo com3n4, 4medio #ase para la !ermentaci+n de az3cares4 4agar nutritivo4, respectivamernte) las
instrucciones de los monitores.
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
En Microbiologa se entiende como siembra el proceso mediante el cual se lleva una porcin de
una poblacin de microorganismos, denominada entonces inculo, de un cultivo crecido a un medio
nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios
previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de prcticas. La principal
advertencia consiste en trabajar siempre prximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de
conveccin verticales que genera, es capaz de crear un ambiente estril en la zona inmediatamente
alrededor y debajo de la llama.
Como instrumento portainculos ms frecuente se utiliza el asa de siembra, con el que se puede
tomar inculo a partir de colonias o de medio lquido, debido a que mantiene un pequeo volumen de
agua por tensin superficial. Para depositar el inculo en lquido basta con introducir el extremo en el
medio y agitar ligeramente. Sobre slido hay que hacer un recorrido largo sobre la superficie salvo en el
caso del medio TSI, en el que tambin hay que inocular picando en profundidad para observar
reacciones metablicas en anaerobiosis. A veces se utilizan pipetas para transportar volmenes grandes
de inculos como en la prctica de crecimiento bacteriano.
Procedimiento: Cada pareja deber inocular y mantener durante la mayor parte de las prcticas una
serie de bacterias conocidas que denominaremos coleccin y una bacteria sin nombre que constituir el
problema y que deber de ser identificado despus de realizar toda una serie de ensayos. Las bacterias
de la coleccin y sus temperaturas de crecimiento son:
Escherichia coli 37C Gram negativa
Pseudomonas aeruginosa 37C Gram negativa
Staphylococcus aureus 37C Gram positiva
Micrococcus luteus 30C Gram positiva
Nocardia corallina 30C Gram positiva
Bacillus cereus 37C Gram positiva (Cuidado porque forma esporas!)
En esta prctica se inocularn cada una de las bacterias de la coleccin en un tubo de caldo comn
y en otro de agar inclinado. La bacteria problema, adems de en estos medios, ser inoculada en una
placa de agar comn al objeto de obtener colonias aisladas, bien por agotamiento de la siembra o bien
por siembra y esterilizacin entre recorridos solapantes, segn las explicaciones de los monitores. Una
vez inoculado, incubar cada bacteria a su temperatura ptima de crecimiento y no olvidarse de marcar el
nombre de la bacteria y la clave de pareja de prcticas.
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FERMENTACION DE AZUCARES
Se entiende por fermentacin a reacciones de mantenimiento que no requieren la participacin de
una cadena de transporte de electrones, aunque en ciertos casos stas pueden jugar papeles auxiliares. En
el caso de azcares se trata de procesos de xido-reduccin capaces de regenerar NAD y que
comnmente tienen como productos finales alcoholes (etanol, isopropanol, n-butanol, etc.), cidos
(actico, frmico, lctico, etc.) acompaados o no por la formacin de gases.
Adems de su inters bioqumico, la capacidad para fermentar diferentes azcares es una propiedad
utilizada muy frecuentemente en taxonoma. En nuestro caso utilizaremos un procedimiento clsico para
ensayar la capacidad de fermentacin de tres azcares: Glucosa, Sacarosa y Lactosa. La produccin de
cidos se observar por el viraje a amarillo del Prpura de Bromocresol. La produccin de gas por su
acumulacin en las Campanas Durham, de donde habr desplazado parte del lquido inicialmente
includo. Ambas determinaciones se efectuarn a las 24 y 48 horas de incubacin para as tener una idea
de la rapidez de su produccin. Asmismo, se har una cuantificacin en funcin de la extensin del
viraje del indicador y de la cantidad de gas producida.
Procedimiento:
Inocular con la bacteria problema y con una de la coleccin (escogidas de forma que no estn
repetidas en la mesa) e inocular cada una de ellas en tres tubos que contengan cada uno de los tres
azcares (G,S,L). Incubarlos a las correspondientes temperaturas de crecimiento. Hacer las
determinaciones a las 24 y 48 horas y apuntar los datos del problema y de toda la coleccin en el
cuaderno de prcticas.
OBSERVACION DE LAS BACTERIAS
a) Observacin macroscpica.
El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que forman sobre
medios slidos s son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de caractersticas que nos ayudan a
su identificacin. A nivel morfolgico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamao, aspecto
del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio
lquido las bacterias producen modificaciones de inters para su clasificacin y que tienen que ver
esencialmente con las caractersticas de su metabolismo. As se observa si la turbidez es uniforme, si
crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.
b) Observacin microscpica.
Puesto que la inmensa mayora de las bacterias son incoloras, la nica forma de observarlas bien en
el microscopio ptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue
mediante su teido con colorantes o mediante la disposicin de una ptica especial de contraste,
generalmente de fases, en el microscopio.
La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las bacterias vivas y
determinar algunas caractersticas tales como su movimiento. Para ello, disponer una gota de cultivo
lquido, previamente agitado, sobre un portaobjetos y taparlo con un cubre de forma que se establezca
una delgada pelcula entre ambos cristales. Posteriormente, se observa con el objetivo de contraste de
40x (ojo!, tiene una banda roja y no todos los microscopios disponen de l) y el condensador anular (se
desplaza horizontalmente y con suavidad hasta alcanzar su posicin en el camino ptico). Con este
sistema se deben de poder distinguir aquellas bacterias con flagelacin polar, que se mueven en zig-zags
muy rpidos, de la pertricas, de movimientos ms suaves y ondulados. En las inmviles se producen
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desplazamientos generales por la existencia de corrientes y vibraciones en el medio de observaci n.
Determinar la forma y capacidad de movimiento de la bacteria problema, y observar tambin alguna
preparacin de las de la coleccin: Pseudomonas (polar), E.coli (pertrica), etc.
Para observar las bacterias teidas, hay que proceder previamente a su fijacin. Inicialmente se
prepara un frotis a partir de medio lquido o dispersando en una gota de agua una porcin de clulas
crecidas en slido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso
de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del
mechero. Tras la fijacin por calor se procede a la tincin.
Tincin de Gram. Se trata de una tincin diferencial muy utilizada que distingue las bacterias por las
caractersticas de su pared celular. Con el fin de disponer de controles internos que nos permitan saber si
la tincin ha sido correcta se efectan tres tinciones como mnimo: una con la bacteria problema sla, y
otras dos en las que sta es mezclada (a nivel del frotis!) con una bacteria G+ o con una G- de
morfologa distinta a la problema. As, si todo va como debe la bacteria problema ha de mantener su
coloracin Gram constante en los tres frotis, apareciendo en una de las mezclas otras bacterias de
coloracin Gram contraria. El proceso de tincin se efecta siguiendo el siguiente protocolo:
1) Hacer un frotis y fijar segn se indica anteriormente.
2) Cubrir con cristal violeta durante 1 minuto. En este paso, todas las clulas quedan teidas
por el colorante.
3) Eliminar el cristal violeta volcando el porta y tratar con lugol durante 1 minuto. De esta
forma se refuerza la interaccin entre el colorante y la pared celular.
4) Lavar con alcohol por goteo continuado durante 20 segundos. Aadir inmediatamente agua
para evitar el arrastre completo de todo el colorante. En esta fase se produce la decoloracin
diferencial de las Gram negativas.
5) Tratar con safranina durante 1 minuto como colorante de contraste.
6) Lavar con agua abundante, secar al aire y observar en inmersin (100x). En esta fase las
Gram negativas adquirirn color rojo de la safranina mientras que las Gram positivas
continuarn con el color azul propio del primer colorante.
Tincin de esporas. Se trata de otra tincin diferencial que se efecta de forma separada con la bacteria
problema y con Bacillus subtilis (de la coleccin) como productor de esporas. El procedimiento a seguir
es el siguiente:
1) Hacer dos frotis de cultivos procedente de medio slido de la bacteria problema y de
Bacillus de la coleccin. Fijarlos por calor de la forma ya descrita.
2) Colocar los portas sobre el trpode y cubrir la preparacin con tres papeles de filtro
recortados de forma que no sobresalgan.
3) Aadir verde de malaquita hasta que los papeles queden empapados y pegados a los frotis.
Coger el mechero por su base y calentar lentamente las preparaciones hasta que estas
empiecen a emitir un vapor blanquecino (detectable mejor sobre fondo negro). Mantener esa
emisin con el mechero durante 5 a 7 minutos sin dejar que se sequen las muestras (se
aade ms colorante). En esta fase se tien las formas vegetativas y las esporas.
4) Coger las preparaciones con pinzas (queman!) y lavarlas intensamente con agua fra hasta
que se observe muy poca coloracin. Durante este lavado diferencial el agua arrastra el
colorante de las formas vegetativas, mientras que el incluido en las esporas se mantiene en
el interior debido al enfriamiento de las envolturas, que se vuelven de esta forma mucho
menos permeables.
5) Teir con un colorante de contraste como la safranina, ahora en fro, durante 1 minuto. Este
slo teir a las formas vegetativas, mientras que las esporas permanecern refractarias a su
entrada.
6) Desteir con agua fra. Secar al aire y observar con el objetivo de inmersin.
Si todo va como debe, las esporas aparecern de color verde y las formas vegetativas en rojo.
Determinar si la bacteria problema forma esporas o no.
7
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ENSAYOS BIOQUIMICOS ESTANDARIZADOS (API20E)
Adems de las fermentaciones de azcares, existe una gran diversidad de ensayos bioqumicos que
permiten identificar a un determinado organismo. No obstante, el desarrollo individualizado de un
conjunto de estos ensayos es muy lento, y requiere la manipulacin de gran cantidad de material, lo que
a efectos prcticos los hace inviables en laboratorios de anlisis rutinarios. Para stos, se han
desarrollado sistemas miniaturizados que permiten el ensayo a gran escala y de forma sencilla de
muchos ensayos bioqumicos simultneos. Uno de estos ensayos es el denominado galera API20E,
especialmente diseados para Enterobacterias, pero que puede ser aplicado a otras bacterias. En nuestro
caso, usaremos una galera de ensayo de este tipo para caracterizar algunas reacciones bioqumicas de la
bacteria problema.
Actividades a ensayar. La galera API20E consta de 10 reacciones especficas de fermentacin para los
azcares y otras 10 reacciones de utilizacin de sustratos o presencia de determinadas enzimas segn se
detalla en el siguiente cuadro:
TESTS SUBSTRATOS REACCIONES/
ENZIMAS
NEGATIVO POSITIVO
ONPG Orto-nitro-fenil-
galactsido
-galactosidasa
incoloro amarillo (1)
ADH Arginina arginina dihidrolasa amarillo rojo/naranja (2)
LDC Lisina lisina descarboxilasa amarillo naranja
ODC Ornitina ornitina descarboxilasa amarillo rojo/naranja (2)
(CIT) Citrato sdico utilizacin de citrato verde-plido/
amarillo
azul-verde/ azul (3)
H
2
S Tiosulfato sdico produccin de sulfdrico incoloro/ gris depsito negro
URE Urea ureasa amarillo rojo/naranja
TDA Triptfano triptfano deaminasa amarillo* marrn*
IND Triptfano produccin de indol anarillo* anillo rojizo*
(VP) piruvato sdico produccin de acetona incoloro* rojo-rosa
(GEL) gelatina de Kohn gelatinasa No difusin difusin de
pigmento negro
GLU Glucosa fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
MAN Manitol fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
INO Inositol fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
SOR Sorbitol fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
RHA Ramnosa fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
SAC Sacarosa fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
MEL Melibiosa fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
AMY Amigdalina fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
ARA Arabinosa fermentacin/Oxidacin
(4)
Azul/verdoso Amarillo
*) Requiere la adicin de reactivos
1) Un amarillo muy plido debe considerarse positivo
2) Un color naranja plido despus de 24 horas de incubacin podra considerarse negativo
3) La lectura debe hacerse en la cpula (aerobiosis)
4) La fermentacin comienza en la parte inferior de los tubos, la oxidacin en la superior
9
Materiales y reactivos:
Galera de identificacin API20E
P-200 y puntas estriles
Pipetas de 5 ml estriles
Tubo 5 ml estril
Solucin salina estril (Cloruro sdico 0.9%)
Aceite de parafina estril
Reactivo TDA Cloruro frrico 3.4 g
Agua 100 ml
Reactivo IND Paradimetil-amino-benzaldehido 5 g
Alcohol isoamlico 75 ml
HCl 37 % 25 ml
Reactivo VP1 KOH 40 g
Agua 100 ml
Reactivo VP2 1 naftol 6 g
Etanol 100 ml
Procedimiento:
1) Preparar una cmara de incubacin con su tapa correspondiente y repartir 5 ml de agua en los
alveolos para proporcionar un atmsfera hmeda. Anotar el nmero de pareja en el lateral de la galera.
2) Colocar la galera en la cmara de incubacin.
3) Disponer 5 ml de solucin salina estril en el tubo. Tomar mediante el asa de siembra una colonia
aislada y homogeneizar la suspensin con el agitador.
4) Inoculacin de la galera (ver el esquema)
- Llenar los tubos pero no las cpulas ( A) de los tests salvo los indicados abajo.
- Llenar el tubo y la cpula (B) de los test (CIT), (VP) y (GEL) con la suspensin anterior.
- Llenar la cpula de los test ADH, LDC, ODC, URE, H2S con aceite de parafina (C) para
obtener atmsfera anaerobia.
5) Cerrar la cmara de incubacin e incubar a 35-37C durante 24 horas.
Lectura de la galera (Anotad todos los datos obtenidos en el cuaderno!):
1) Leer los resultados de las reacciones espontneas de acuerdo con la tabla de positivos y negativos.
Anotadlo en el cuaderno.
2) Revelado de (VP): Aadir 1 gota de reactivo VP1 y otra de VP2. Esperar 10 min. Si sale rojo o rosa
es positivo.
10
3) Revelado TDA: Aadir una gota de reactivo TDA. La aparicin inmediata de un color marrn
oscuro es resultado positivo.
4) Revelado IND: Aadir una gota de reactivo IND y esperar dos minutos. Un anillo rojo indica
reaccin positiva.
ANTIBIOSIS
Existen diferentes tcnicas para estudiar la actividad de los antibiticos frente a distintos
microorganismos, utilizndose en clnica pruebas esencialmente cualitativas, aunque en muchos casos se
requieren determinaciones cuantitativas. En estas prcticas vamos a efectuar ensayos de ambos tipos.
Las pruebas cualitativas o antibiograma se van a efectuar con la bacteria problema mientras que las
cuantitativas las haremos con una bacteria conocida (E.coli ). Cada pareja deber pues inocular el da
anterior al del ensayo su bacteria problema E. coli en sendos tubos de caldo comn, procurando evitar
contaminaciones.
Las pruebas que vamos a realizar se basan en la difusin del antibitico sobre una placa de medio a
partir de un punto central. En este caso, una cantidad concreta del antibitico se encuentra incluido en
un disco de papel que se deposita sobre una placa de agar comn, que ha sido previamente inoculada
con una fuerte dosis de la bacteria a ensayar. As, el disco de papel absorbe agua de la placa, se disuelve
el antibitico y se inicia el proceso de difusin de ste hacia las zonas que lo rodean, generndose un
gradiente de concentracin cuyo nivel mximo se encuentra bajo el disco. Las bacterias que se
inocularon crecern durante su incubacin all donde la concentracin del antibitico sea lo
suficientemente baja como para no impedrselo (normalmente alejado del disco), mientras que no
podrn hacerlo en las proximidades del disco donde las concentraciones del antibitico son elevadas.
Puesto que los lmites de concentracin de antibitico que afectan al cultivo son por regla general muy
estrechos, se suelen formar halos de inhibicin, esto es, zonas sin bacterias alrededor de los discos, de
bordes bastantes definidos y cuyo dimetro tiene que ver con la concentracin de antibitico que haba
en el disco y con la sensibilidad a ste de las bacterias ensayadas.
Procedimiento:
Antibiograma: El objetivo es determinar a qu antibiticos es sensible la bacteria problema. Se utilizarn
discos comerciales con los antibiticos y dosis que se especifican en la tabla.
Antibitico Abreviatura Dosis ( g/ disco) Efecto Inhibidor
Cloranfenicol C 30 Sntesis de protenas
Cefalotina CR 30 Sntesis de peptidoglicano
Tetraciclina TE 30 S. de protenas
A. Nalidxico NA 30 Replicacin
Eritromicina E 15 S. de protenas
Estreptomicina S 10 S. de protenas
Trimetoprim TMP 5 Sntesis A. flico
Inicialmente se extiende con la bolitas de vidrio un inculo de 0,2 ml de la bacteria problema a
partir de un cultivo denso en medio lquido (Utilizando las pipetas automticas como potainculos: No
se os ocurra flamearlas, que son de plstico!). Despus se van disponiendo los discos de cada antibitico
sobre la placa (hay que presionar ligeramente) y a distancias equivalentes, empleando unas pinzas
esterilizadas por calentamiento y enfriadas al aire. Para extraer los discos de sus contenedores hay que
seguir las instrucciones de los monitores.
Prueba cuantitativa. Se trata de determinar el grado de sensibilidad o concentracin mnima inhibitoria
(CMI) de un antibitico frente a la bacteria ensayada. Cada pareja sembrar de la forma descrita un
csped de E. coli, y colocar cinco discos con cantidades crecientes de Estreptomicina. Para preparar los
11
discos, cada pareja preparar 5 diluciones seriadas (1:4 en agua estril) a partir de una disolucin
valorada que le darn los monitores, y aadirn 10 l de cada una de stas diluciones a sendos discos de
papel estriles. Puesto que los discos no estn marcados, es imprescindible indicar su concentracin
debajo de la placa. Siempre resulta conveniente mantener un orden creciente en la disposicin de los
discos.
Una vez colocados los discos de ambos experimentos, las placas se incuban en posicin invertida
durante toda la noche a la temperatura ptima de crecimiento de la bacteria que se est utilizando. A la
maana siguiente hay que medir el dimetro de los halos de inhibicin y anotarlos en el cuaderno.
Resultados:
En el caso del antibiograma, se har un cuadro de sensibilidad (S) o resistencia (R) para cada uno
de los antibiticos frente a esta estirpe, y posteriormente sern utilizados como criterio para la
determinacin de la bacteria problema. El criterio a seguir, internacionalmente reconocido, ser:
Sensible (S) si el dimetro del halo es mayor de 15 mm
Resistente (R) si el dimetro del halo es menor de 13 mm
Intermedio (R/S) si el dimetro del halo est comprendido entre 13 y 15 mm
En el caso del ensayo cuantitativo se representar el dimetro del halo frente al logaritmo de la
concentracin correspondiente. Los puntos obtenidos entonces se ajustarn a una recta, de la que se
extrapolar la concentracin necesaria para generar un halo de 15 mm, que ser considerada como la
concentracin mnima inhibitoria (CMI) de este antibitico frente a la bacteria ensayada.
ACTIVIDAD CATALASA
Se trata de un ensayo muy simple que intenta determinar si la bacteria problema tiene capacidad
para degradar el perxido de hidrgeno, uno de los agentes oxidantes producidos como consecuencia de
determinadas reacciones metablicas oxidativas propias del metabolismo aerobio. La enzima encargada
de degradar este producto es denominada catalasa y aparece en casi todos los microorganismos aerobios
obligados o facultativos. Existen sin embargo organismos anaerobios o microaerfilos que carecen de
dicha actividad, constituyendo esta prueba un importante elemento taxonmico.
El ensayo es muy sencillo, pues basta con aadir una gota de agua oxigenada sobre una colonia del
cultivo y observar si de sta se empiezan a desprender burbujas de oxgeno como consecuencia de la
actividad enzimtica de la catalasa:
2H
2
O
2
==========> 2H
2
O

+ O
2
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
La deteccin de microorganismos contaminantes en alimentos y bebidas constituye una prctica
habitual en cualquier laboratorio de Bromatologa. Para ello se utilizan medios selectivos, indicadores y
generales que nos permiten identificar desde el total de bacterias contaminantes (realmente slo se
detecta una cierta parte de la poblacin total) hasta grupos de bacterias concretas, de especial inters
como agentes contaminantes por su posible peligrosidad, o por tratarse de indicadores de procesos
sufridos por el producto durante su manufacturado o almacenamiento.
Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de distinguir la presencia y cantidad
de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:
12
Escherichia coli
Samonella typhimurium
Morganella morganii
Enterobacter aerogenes.
El mtodo a seguir consistir en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada
en solucin fisiolgica, siguiendo el esquema que se representa a continuacin:
A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:
Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 10
-5
, 10
-4
y
10
-3
sobre tres placas de agar comn, e incubarlas a 37C durante la noche en posicin invertida. Tras
incubar 24 horas se cuenta el nmero de colonias y se multiplica por los factores de dilucin
correspondientes.
Determinacin de bacterias fermentadoras de lactosa. Se extiende 0.1 ml de las diluciones 10
-4
y
10
-3
sobre dos placas de agar MacConkey, incubndolas de la forma descrita. Una vez crecidas, se
cuentan las colonias rojas y las rosceas y se multiplican ambos nmeros por los factores de dilucin.
Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y se extiende un inculo
denso sobre la superficie de una placa de agar EMB, incubando a continuacin a 37C durante toda la
noche. En este medio, confirmativo para E. coli, esta especie debe dar lugar a colonias negras con
reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da colonias ms rosceas y nunca reflejos.
Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli, sobre el total de coliformes.
Determinacin de Salmonella y Morganella. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 10
-5
y 10
-4
en
placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37C durante 24-48 horas. Sobre este medio Salmonella
y Morganella generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las colonias se vuelvan
rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el amarillo (una buena
forma de detectar coliformes).
Con estos datos, hay que deducir el nmero de bacterias (por ml) de agua contaminada que dan
colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o Morganella, hay que reinocularlas en caldo de
urea-indol y en TSI. Sobre caldo de urea la estirpe de Morganella debe generar color azul, y en TSI
nicamente la estirpe de Salmonella debe aparecer con precipitados negros (por produccin de SH
2
que
genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto de los caracteres siguientes:
Fondo* Pendiente Ennegrecimiento
S. typhimurium A+G Alcalino S
M. morganii A+G Alcalino No
*) A indica produccin de cido y G de gas
TRANSFERENCIA GENETICA ENTRE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
13
SF
I) Conjugacin
Uno de los mecanismos ms comunes de diseminacin de genes en la naturaleza es la conjugacin,
un fenmeno mediante el cual una cepa portadora de un plsmido, denominado conjugativo, es capaz de
transferir una copia de ste a una bacteria receptora casi siempre de la misma especie. No obstante,
existen los denominados plsmidos conjugativos promiscuos, esto es capaces de saltar la barrera de
especie y, en ciertos casos, la de gnero. Este mecanismo es el causante primario de la difusin de genes
de resistencia a antibiticos y, por tanto, de la prdida de efectividad de stos observada durante los
ltimos aos.
Superpuesto sobre la capacidad de transferencia interespecfica de plsmidos se encuentra la
movilizacin de los genes de resistencia a antibiticos promovida por elementos genticos denominados
transposones. Un transposn es un fragmento de DNA con capacidad para cambiar de localizacin
dentro de la misma molcula de DNA o entre molculas distintas (ej: plsmido a cromosoma o al revs)
y que en muchas ocasiones es portador de genes de resistencia a antibiticos, contribuyendo de esta
forma a su diseminacin.
Objetivos: Vamos a transferir un transposn que confiere resistencia a Kanamicina desde una cepa de
E.coli a una cepa de Salmonella typhimurium, utilizando plsmidos derivados del conjugativo y
promiscuo RP4. Como medidas de seguridad, tanto las cepas donadoras y receptoras como los plsmidos
que vamos a emplear son derivados inocuos de las formas naturales obtenidos en el laboratorio.
Material biolgico:
Plsmido: se utilizar el plsmido pUT (5.2 kpb). Este plsmido contiene el origen de replicacin de
R6K, que slo funciona en cepas de E.coli que expresen la protena desde un bacteriofago lisognico
(pir), y el origen de transferencia del plsmido conjugativo RP4. El plsmido contiene tambin el
gen de la transposasa (tnp) y un gen de resistencia a Kanamicina entre los extremos I/O de
recombinacin (transferible mediante la actividad transposasa). Como elemento de seleccin del
plsmido, tambin lleva un gen de resistencia a Ampicilina (una -lactamasa, bla). Para que sea
transferido, este plsmido requiere otras funciones propias de RP4, que solo se encuentran en la cepa E.
coli S17-1pir. El mapa de restriccin del plsmido se presenta a continuacin:
Cepas de E.coli: se emplearn las cepas de E.coli CC118pir y S17-1pir transformadas con el plsmido
pUT. Slo la cepa S17-1pir posee la capacidad de transferir el plsmido a otras cepas, pues contiene en
el cromosoma genes de RP4 necesarios para la conjugacin. La cepa CC118pir ser empleada como
control negativo en la transferencia.
14
Cepa de Salmonella. Utilizaremos como receptor la cepa de S. typhimurium LB5010-R2 (resistente a
Estreptomicina y a Rifampicina). Esta cepa posee otras caractersticas especiales: es restriccin menos,
permitiendo una mayor frecuencia de transferencia, y carece de la protena , por lo que el plsmido
pUT no puede replicarse en ella.
Material no biolgico:
Placas de agar comn.
Placas de seleccin: se emplear agar comn con Rifampicina (80 g/ml), y Kanamicina (10 g/ml).
Solucin de lavado. Solucin estril de ClNa al 0.9 % (p/v).
Solucin de conjugacin : SO
4
Mg 10 mM (estril).
Procedimiento:
1) Crecimiento de las cepas (lo harn los monitores): Se emplearn cultivos de 24 horas crecidos en
caldo comn conteniendo, para las dos cepas de E. coli Ampicilina (100 g/ml) y Kanamicina (30
g/ml), y para la cepa de Salmonella, Rifampicina (80 g/ml). Una vez crecidas, las clulas sern
lavadas por centrifugacin y resuspendidas en 1/10 del volumen inicial de SO
4
Mg 10 mM.
2) Sobre una placa de agar comn, depositar dos filtros estriles de nitrocelulosa separados (actuarn
de soporte slido para la conjugacin). Marcad en las placas debajo de cada filtro CC118 y S17. Aadir
10 l de la suspensin de Salmonella en cada uno de ellos, dejar que absorba el lquido y aadir sobre
uno de los filtros 10 l de la suspensin de E.coli CC118pir, y sobre el otro 10 l de la de S17-1pir.
Incubar toda la noche a 37C.
3) Al da siguiente, tomar cada filtro con las pinzas (en condiciones de esterilidad), introducirlo en
sendos tubos estriles. Aadir 5 ml de SO
4
Mg 10 mM, agitar intensamente y extender 100 l en dos
placas de seleccin (Rifampicina 80, Kanamicina 10). Dejar crecer a 37C durante toda la noche.
Resultados: Confirmar la aparicin de colonias nicamente en la conjugacin entre E. coli S17-pir y
Salmonella. Contar las colonias. Explicad los resultados obtenidos en el cuaderno de prcticas.
II) Transformacin
La transformacin es un proceso a travs del cual el DNA es introducido dentro de un
microorganismo. En algunas bacterias la transformacin es un proceso natural e inducible que les permite
la adquisicin de manera activa de DNA exgeno. En otros muchos la transformacin puede producirse de
forma artificial mediante tratamientos qumicos o fsicos. En esta prctica vamos a proceder a introducir
plsmidos de clonaje en una cepa de E. coli mediante el tratamiento qumico de stas.
Materiales:
Cepa de E. coli JM83. Se trata de una cepa carente de actividad -galactosidasa, aunque dispone de
las permeasas especficas de lactosa. En ausencia de plsmidos esta cepa es sensible a ampicilina e incapaz
de fermentar la lactosa, por lo que genera colonias blancas en agar lactosado de McConkey. Cuando esta
cepa es transformada con un plsmido que porta un fragmento del gen de la -galactosidasa (fragmento
alfa) la actividad enzimtica es funcional y se obtienen bacterias fermentadoras de lactosa (colonias rojas
en este medio). Cuando el gen de la -galactosidasa portado por el plsmido es interrumpido artificialmente
mediante la introduccin de un fragmento de DNA exgeno, este gen deja de funcionar dando lugar a
colonias blancas, una propiedad muy utilizada en como indicador de clonaje.
15
Plsmidos: cada pareja dispondr de una mezcla de los plsmidos pUC119 y pUC119-X. Se trata
de plsmidos con un origen de replicacin autnoma funcional en E. coli, un gen de resistencia a
ampicilina, y el sistema de seleccin de clones con inserto dependientes del gen -galactosidasa comentado
ms arriba. En pUC119 este sistema est intacto, mientras que en pUC119-X el gen de la -galactosidasa
ha sido interrumpido por la insercin de un fragmento de DNA (X) de otro organismo.
Material no biolgico:
Soluciones fras de Cl
2
Ca y Cl
2
Mg a 100 mM
Dos placas de agar lactosado de McConkey con 100 g/ml de ampicilina (Agar Mc de seleccin)
Caldo comn estril
Procedimiento:
1) Cada pareja deber centrifugar 1,5 ml (~ un tubo Eppendorf lleno) de cultivo exponencial de la bacteria
(5 min a 5.000 rpm) y resuspenderlas con cuidado y en condiciones de esterilidad en 1 ml de Cl
2
Mg fro (4
C). Tras volver a centrifugar en las mismas condiciones, las clulas sern resuspendidas en 200 l de
Cl
2
Ca 100 mM, tambin fro, y dejadas en la nevera hasta el da siguiente. Durante este tiempo se produce
una induccin de competencia artificial en E. coli mediada por las sales de calcio.
2) Tras esta incubacin, distribuir las clulas tratadas con el Cl
2
Ca en dos tubos con 100 l cada uno.
Aadir 10 l de la mezcla de plsmidos a uno de ellos, dejando el otro sin DNA (control negativo). Incubar
ambos en hielo durante 20 min. Someterlos posteriormente a un choque trmico a 42 C durante 90
segundos exactamente en un bao de agua previamente estabilizado a esta temperatura. Volver a enfriar en
hielo (2 minutos), aadir 800 l de caldo comn e incubarlos en la estufa de 37 C durante 30 min para que
se exprese el gen de resistencia al antibitico. Tras ese tiempo, extender 100 l de cada tubo sobre sendas
placas de agar Mc de seleccin e incubarlas a 37C durante 24 h
3) Observar la cantidad y tipo de colonias que aparecen sobre cada una de las placas.
III) Transduccin (Ver la prctica de titulacin)
TITULACION DE UN VIRUS BACTERIANO y TRANSDUCCION
Titular una suspensin de virus consiste en determinar el nmero de unidades infectivas por ml
presente en la misma. En el caso de los virus bacterianos lticos, la titulacin se realiza asumiendo que
cada unidad infectiva es capaz de producir una placa de lisis sobre un csped bacteriano, lo que es cierto
para bajas multiplicidades de infeccin. As, determinando el nmero de placas de lisis producidas al
infectar con distintas diluciones de la suspensin de virus, podremos calcular el nmero de unidades
infectivas presentes en la muestra original.
Utilizaremos la estirpe de E. coli JM83 que permite la expresin de un bacterifago lambda
utilizado en ingeniera gentica (derivado de RS45) que porta el gen de la -galactosidasa bajo el
control de un potente promotor de transcripcin constitutivo, y un gen de resistencia a kanamicina, de
forma que podremos seleccionar y detectar la integracin en la prctica simultnea de transduccin.
16
pUC119
pUC119-X
Amp
Amp
-gal X
Como medios para el cultivo e infeccin se puede utilizar directamente caldo y agar comn a los que se
aade siempre Cl
2
Mg a una concentracin final de 10mM, al objeto de evitar la disgregacin de los
componentes de la cpsida del virus. Tambin se utilizar agar blando, que se obtiene aadiendo 0.6%
(p/v) de agar al caldo comn (con el Cl
2
Mg presente), y que tiene como funcin el permitir una difusin
limitada de la progenie vrica tras la lisis de la bacteria. Para el ensayo de transduccin emplearemos
placas de agar de McConkey con el antibitico kanamicina
Procedimiento:
1) Se prepara un inculo de la cepa de E. coli a infectar (ojo! NO es la misma que se emplea en la
coleccin) en un medio que contiene 10 mM de Cl
2
Mg y maltosa al 0.2%, y se deja incubando a 37C y
con agitacin durante la noche anterior (Esto lo hacen los monitores para todo el grupo).
2) Se funden los matraces con el agar blando (con 10mM de Cl
2
Mg) y se mantienen en estado lquido en
los baos a 50C (Los monitores hacen esto).
3) Preparar diluciones decimales (tantas como indiquen los monitores) de la suspensin de virus
utilizando el caldo comn con el magnesio.
4) Disponer 0.2 ml del cultivo de bacterias ya crecido en cinco tubos estriles, y aadir a cada uno 0.1
ml de tres diluciones consecutivas del virus, siguiendo las indicaciones de los monitores. Homogeneizar
suavemente e incubar a 37C durante 15 minutos con el fin de permitir la adsorcin del virus a la
superficie de las bacterias.
5) Aadir tambin 0,1 ml de la dilucin 10
-1
a otro tubo con 0,1 ml de la bacteria para la prctica de
transduccin. Incubar en la estufa como en el punto 4. Hacer un control paralelo con igual cantidad de
bacterias, pero sin virus.
6) Aadir 3-4 ml del agar blando (a 45-50C) sobre los tres tubos ms diludos, homogeneizar y
extender sobre placas de agar comn procurando que no queden burbujas. Dejar que se solidifique este
agar manteniendo las placas sobre la mesa durante 5-10 minutos.
7) Extender directamente los tubos para la transduccin sobre placas de seleccin de McConkey con
kanamicina, empleando para ello bolitas de cristal estriles.
8) Incubar a 37C en posicin invertida durante toda la noche.
9) Al da siguiente contar las placas de lisis que se han formado en las placas con el agar blando. Puesto
que cada una de ellas corresponde a un proceso de infeccin por un virus nico, multiplicando por los
factores de dilucin correspondientes en cada caso se podr determinar el TITULO del fago, esto es, el
nmero de unidades infectivas por ml.
10) En las placas de Mc con kanamicina observar si aparecen colonias y el color de stas. La aparicin
de colonias rojas indicar que el fago se ha integrado en el cromososoma confirndo a esta bacteria
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resistencia al antibitico de seleccin y capacidad de utilizacin de lactosa mediante la introduccin de
genes procedentes de otras bacterias (Transduccin).
CRECIMIENTO BACTERIANO
En esta prctica, realizada en grupos de 4 personas, seguiremos el crecimiento de un cultivo
esttico de E.coli y observaremos el efecto producido sobre ste por algunos agentes antibacterianos de
uso habitual en medicina como la Ampicilina y la Estreptomicina.
Procedimiento:
A partir de un cultivo crecido que os darn los monitores, inocular en condiciones de esterilidad 5
ml de ste en un matraz que contenga 75 ml de caldo comn enriquecido con 0.2% (p/v) de glucosa
(aadir 0.75 ml de glucosa al 20% en el matraz en condiciones de esterilidad si no lo hicieron
previamente los monitores). A continuacin, tomar de la mezcla 5 ml con una pipeta estril, dejarlos en
un tubo de ensayo (que no tiene por qu ser estril), e introducir inmediatamente el matraz en el bao de
incubacin (hay que procurar que las bacterias no se enfren a lo largo del proceso de crecimiento),
apuntando la hora a la que se tom esta muestra que ser considerada como tiempo 0.
Con los 5 ml de la muestra hay que efectuar medidas de pH y turbidez. El pH se mide para valorar
la produccin de cido como consecuencia del metabolismo bacteriano, y es el parmetro que hay que
medir en primer lugar. Despus se mide la turbidez o densidad ptica en un colormetro a una longitud
de onda de 550 nm. Este valor refleja un parmetro proporcional a la concentracin de masa celular
(siguiendo la ley de Lambert-Beer) hasta un valor de 0.5, a partir del cual se pierde esta
proporcionalidad. Por esta razn, cuando al medir obtengamos un valor superior a 0.5 se proceder a la
dilucin (1 ml de cultivo + 4 ml de caldo) con medio de cultivo, de forma que el valor que se obtenga,
multiplicado por el factor de dilucin (5 x), mantenga la proporcionalidad con la concentracin de la
masa bacteriana.
A partir del tiempo considerado como 0 se seguirn tomando muestras de 5 ml cada 45 ml en las
que se medir el pH y la turbidez para reflejarlo con posterioridad en una grfica.
Cuando los cultivos alcancen una DO de 0.4-0.5, las parejas C-D de las mesas aadirn las
concentraciones de antibiticos que se indican, continuando la incubacin y la toma de muestras cada 45
min.
Mesa 1 100
(g/ ml)
de Ampicilina
Mesa 2 100
(g/ ml) de
Estreptomicina
Mesa 3 100
(g/ ml)
de Ampicilina + Estreptomicina
Mesa 4 100
(g/ ml)
de Estreptomicina
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Resultados:
Los resultados de DO de cada uno de los experimentos se irn apuntando en la pizarra para que
sean a continuacin representados sobre papel semilogartmico (en ste, la escala logartmica transforma
directamente los valores obtenidos en las posiciones de sus logaritmos correspondientes), de forma que
en el cuadernillo final aparezcan una grfica del cultivo no tratado y otras tres de los tratados con los
antibiticos. De estas grficas se podr observar: 1) Fases exponencial y entrada en estacionaria (la fase
de latencia no se ve en este medio y condiciones, y la de muerte tarda mucho en llegar); 2) Tiempo de
generacin, calculable a partir de la pendiente de la grfica en su fase exponencial.; 3) Efectos de los
antibiticos, ltico para Ampicilina y no ltico para Estreptomicina.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS LCTICAS Y PRODUCCIN DE YOGUR
Las bacterias lcticas estn implicadas en una gran variedad de procesos de transformacin de
alimentos. En esta prctica vamos a aislar bacterias de yogur y las vamos a emplear para inocular leche
y comprobar su capacidad fermentativa.
Materiales: Cada pareja se encargar de traer un yogur natural como fuente de lactobacilos. Para el
aislamiento, emplearemos el medio MRS (Man, Rogosa y Sharpe). Se trata de de un medio natural muy
rico que contiene polisorbato, acetato, magnesio y manganeso que actan como factores de crecimiento
para muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuar en medios microaerfilos empleando jarras para
el cultivo de organismos anaerbicos y un sistema comercial para la eliminacin del oxgeno. Para la
produccin de yogur se emplear leche estril (UHT) y tubos de plstico de 5 ml.
Procedimiento:
1) Tomar 50 l del suero de yogur con una pipeta estril (puntas amarillas) y diluirlos en 1 ml de
solucin salina. Hacer una o varias diluciones 1/10 en solucin salina segn indiquen los monitores, y
extender 50 l de la ms diluda sobre una placa de agar MRS (que no est muy seca) empleando bolitas
esttiles. Incubar boca abajo en condiciones de microaerofilia durante 48 horas a 37 C.
2) Observar si las colonias crecidas sobre la placa son homogneas y calcular su nmero aproximado.
Utilizar varias colonias para inocular con el asa de siembra un tubo conteniendo 5 ml de leche est ril
(UHT). Mantener el segundo tubo sin inocular. Incubar ambos tubos a 37C hasta el da siguiente.
3) Observar el grado de gelificacin del tubo inoculado y compararlo con el no inoculado. Abrir el tubo
y proceder como en el paso 1 para obtener una suspensin del contenido del yogur. Hacer un frotis y
una tincin simple para observar los organismos que han crecido.
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