NUEVO MTODO PARA LA EXTRACCIN DE ADN DE LA PULPA DENTAL

La pulpa dental es un tejido conjuntivo especializado que ocupa la cavidad de la pulpa dental de
los dientes. Su densa vascularizacin hace altamente susceptibles a los microorganismos
transmitidos por la sangre como se ha demostrado en modelos animales. Que ha demostrado
ser un pauelo de papel adecuado para el diagnstico de bacteriemia en los cobayos infectados
experimentalmente por la bacteria intracelular Coxiella burnetii. Tanto C. burnetii ADN viable
y C. burnetiiorganismos fueron recuperados de la pulpa dental en estos experimentos. En los
seres humanos, la deteccin por PCR del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) fue
confirmada por in situ hibridacin del genoma del VIH en los fibroblastos de la pulpa
dental. Un caso de Bartonella quintana infeccin de la pulpa dental se document en un
paciente curado de personas sin hogar B. Quintanabacteriemia por tres meses. En los seres
humanos enterrados y los gatos, la pulpa dental seca permaneci cerrada en forma de polvo en
los dientes. Este material ha sido utilizado con xito para amplificar los patgenos como la
peste agente de Yersinia pestis en los individuos sospechosos de peste antiguos, Salmonella
enterica Typhi en el 430 aC la peste de Atenas, B. Quintana en persona
prehistricos y Bartonella henselae en 13

-18

gatos siglo XVIII. La pulpa dental tambin se

ha utilizado como fuente de ADN del husped para la genotipificacin de los individuos
enterrados basado en la secuenciacin de los genes DQA1 de la regin HLA en el cromosoma 6,
loci STR 18 y la regin hipervariable 1 de la regin de control mitocondrial. En los pacientes,
que permiti el diagnstico pstumo molecular de enfermedades hereditarias como la distrofia
muscular de Duchenne y el sndrome de Rett.
TCNICA PARA RECUPERAR LA PULPA DENTAL
Se basa:
Apertura longitudinal del diente, provocando un gran riesgo de exposicin del material
con el medio ambiente del laboratorio, lo que podra dar lugar a la contaminacin de la
pulpa dental.
Por otra parte, la pulpa dental se pueden perforar fuera de la cavidad de la pulpa
dental por medio de un orificio pequeo para exponer la cavidad de la pulpa dental.
Ambas tcnicas requieren conocimientos de odontologa, de los gestos delicados de manipular
el diente. Estas limitaciones se ve obstaculizada nuevos avances en los diferentes laboratorios
de un protocolo universal para la recuperacin de ADN dental pulpa para la deteccin molecular
del husped y las bacterias en la pulpa dental. Adems, un protocolo con incrustacin de un
diente completo en silicona se ha propuesto.
Tomando la deteccin de bacterias como un paradigma de identificacin molecular de ADN de
la pulpa dental, una tentativa nica de 16S rDNA basado en la deteccin universal de bacterias
en la pulpa dental de los individuos enterrados durante siglos dio lugar a ampliaciones
contaminados. Pre-Resultados de laboratorio la contaminacin bacteriana de la flora del medio
ambiente y de la mano-a cargo y la contaminacin del laboratorio se debe a la flora de
laboratorio, reactivos PCR contaminados por ADN microbiano, amplicones anteriores y la
contaminacin cruzada con una muestra de verdaderos positivos o un control positivo.
Sin embargo, el desarrollo de un fcil de realizar, sin contaminacin de protocolo para la
deteccin de 16S rDNA base universal de las bacterias en la pulpa dental, permitira un mayor
uso de este tejido para el diagnstico microbiano transmitidas por la sangre de
microorganismos, tanto en los individuos contemporneos y antiguos.
La amplificacin del 16S rDNA, Secuenciacin e Identificacin
Los cebadores de PCR L1: 5'-ATTAGA (G / T) ACCCTGGTAGTCC-3 '(posiciones 781-
797, Escherichia coli AB210981 numeracin) y L2: 5'-CGACACGAGCTGACGACA-3 '(posiciones
1066 a 1052) fueron diseados para amplificar unas 286 -pares de bases (pb) del 16S rDNA
bacteriano. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo-en un thermocyclor PTC-200 (MJ
Research, Waltham, Mass) bajo las siguientes condiciones: un paso de activacin de 10 minutos
a 95 C seguido de 40 ciclos que incluye un paso de desnaturalizacin de 30 segundos a 95 C,
a un paso de hibridacin de 45 segundos a 60 C y un paso de elongacin de 90 segundos a 72
C, seguido de 7 minutos a 72 C para completar la extensin de los productos PCR. Cada
experimento de amplificacin incorporada 4 de agua estril, controles negativos. Amplicones
fueron secuenciados utilizando el Big Dye Terminator Kit, los productos de la secuencia fueron
tratados por la ABI PRISM 3100 Analizador Gentico y analizados utilizando el ABI PRISM de
secuenciacin de ADN Anlisis de Software versin 3.0 (Perkin-Elmer). Las secuencias se
compararon mediante el uso de BLAST con las secuencias disponibles en bases de datos
Cualquier secuencia 16S rDNA fue confirmado mediante la realizacin ms rpoB de secuencias
de genes basado en la identificacin. rpoB de PCR y cebadores de secuenciacin fueron
diseados sobre la base de los actuales 16S ADNr identificacin de secuencias.
RESULTADOS

Pulpa dental Extraccin de ADN total
ADN total de la pulpa dental se recuper fcilmente, con la excepcin de los dientes con pasta
dental calcificada. El protocolo dado 228 83 mg / ml de ADN por muestra y se llev 6 horas
para la digestin de la pulpa dental y 3 das para la recuperacin de ADN.

DISCUSIN
Los datos aqu presentados indican que la pulpa dental se recuper de los dientes humanos
extrados para el tratamiento odontolgico es adecuado para la PCR universal y basada en la
secuencia de identificacin de los organismos bacterimica en espera de que el uso de un
protocolo experimental mejor.
Deteccin molecular de las bacterias en las muestras se puede lograr mediante la amplificacin
y secuenciacin de objetivos muy especficos. Universal de dianas moleculares, como el ADNr
16S ofrecen la oportunidad de detectar la mayora de las especies bacterianas, pero estn
sujetos a la amplificacin no especfica debido a la contaminacin del ADN de pre-laboratorio y
fuentes de laboratorio. En este caso, nos pusimos en marcha un protocolo original para la
recuperacin de la pulpa dental, que limita las fuentes de contaminacin de laboratorio.
La contaminacin directa de la pulpa dental puede ser consecuencia de su exposicin al
ambiente del laboratorio. Esto fue impedido por aqu encierro de todo el diente
descontaminado en la resina estriles y otras manipulaciones en la cmara de la pulpa dental en
s. Se utiliz resina en lugar de silicona para permitir una verdadera inclusin de manejo, fcil
de los dientes y la inyeccin de los reactivos en el sistema de canales sin ningn riesgo de
contaminacin. Tambin utilizamos la colagenasa estril para facilitar la inyeccin de reactivos
en la cmara de la pulpa dental y por lo tanto utilizan los dientes naturales como tubo de
ensayo. De hecho, el primer paso de la extraccin de ADN se llev a cabo en la cavidad de la
pulpa misma, reduciendo as el riesgo de contaminacin por bacterias ambientales en contra de
protocolo anterior.
Con el fin de resolver 16S rDNA contaminacin del reactivo PCR, hemos desarrollado un
enfoque original de la incorporacin de la filtracin de la mezcla de PCR seguida de digestin
de dos enzimas de restriccin. Hemos observado que la filtracin mejorada la eficacia de la
enzima de restriccin basada en la descontaminacin y que el uso sucesivo de dos enzimas era
necesaria para lograr la descontaminacin completa.
Usando nuestro procedimiento, se han detectado secuencias especficas de ADN microbiano en
los dientes 14/144 prueba. Con la excepcin de P. stutzeri que pueden resultar de la
contaminacin del agua, creemos que estas secuencias eran autnticos, es decir que estaban
presentes en la pulpa dental respectivos antes del procesamiento de laboratorio. En todos los
casos, los controles negativos sigui siendo negativo y el 16S ADNr de deteccin basados fue
confirmado por un segundo rpoB gentica basada en la amplificacin y secuenciacin de
secuencia especfica. Adems, cada individuo cedi nica ADNr 16S y RPO secuencias del gen B
que no se encuentran en otras personas. Por ltimo, el hecho de que hemos recuperado la
identificacin de secuencias idnticas en varios dientes de un mismo individuo refuerza los
resultados. Debido a las diferencias en el rendimiento de extraccin de ADN entre las
diferentes especies de bacterias, el protocolo puede tener pasar por alto algunos organismos
que la pulpa dental, y las especies de bacterias que hemos encontrado, principalmente gram-
negativas especies, puede no ser representativa de la flora de la pulpa dental en general.
Se identificaron principalmente dos grupos de bacterias, aerobias gram-negativas presuntos
responsables de infeccin de transmisin sangunea y la flora oral asociada a periodontopathy
infeccin de transmisin. La mayora de las detectadas bacterias gram-negativas son conocidas
por causar bacteriemia en los seres humanos y no se encuentran en el tejido periodontal
seguro o enfermos. Estos incluyen Enterobacter cloacae , Enterobacter dissolvens , una
especie emergente estrechamente relacionado con Enterobacter cloacae, Acinetobacter
johnsonii yKlebsiella oxytoca y Klebsiella variicola , un genotipo de Klebsiella pneumoniae.
Nuestros resultados validan nuestro postulado de que es posible recuperar ADN de la bacteria
en la pasta dental durante una bacteriemia. El procedimiento que hemos desarrollado
proporciona una nueva herramienta para el diagnstico retrospectivo de bacteriemia en los
pacientes que se beneficiaron de extraccin dental ya que la pulpa dental es equivalente a un
cultivo de sangre pequeos. Adems de permitir la ms amplia del espectro de organismos
bacteriemia detectable en la pulpa dental, ms all del alcance de la Y. pestis, B. Quintana en
los seres humanos y B. henselae en gatos. Puede ayudar a resolver la etiologa de las epidemias
histricas, de etiologa desconocida, como la 15-17

episodios del siglo conocida como la peste

de Londres. Episodios ms tarde se investig sin xito, no hay evidencia de Y. pestis se
encontr para que la causa de estos episodios es incierto.
Este protocolo tambin podra aplicarse a la deteccin molecular y genotipificacin de ADN del
husped de los dientes recogidos de individuos enterrados y dientes de leche mantienen los
familiares de los nios muertos y enfermos, con aplicaciones en medicina forense y las ciencias
antropolgicas. En cuanto a estas aplicaciones, la prevencin de la contaminacin externa de la
pulpa dental por ADN moderno, anfitrin exgena es de primordial importancia para la
interpretacin precisa de los datos basados en la PCR.
NETGRAFA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/?term=extract+method+adn
revista pubmed central