UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

EFECTO DE LA ADMINISTRACIN DE VITAMINA E Y SELENIO
SOBRE LA MOTILIDAD Y VIABILIDAD ESPERMATICA DE
SEMEN OVINO DURANTE LA ADAPTACIN A 5C PARA EL
PROCESO DE CRIOPRESERVACIN


TESIS REMITIDA AL PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA Y
ZOOTECNIA DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS
VETERINARIAS COMO UN REQUISITO PARA OBTENER EL
GRADO DE:

MDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

PRESENTA:

CATHIA CECILIA LASTRA GONZLEZ

DIRECTOR DE TESIS:

DR. JOS MARIA CARRERA CHVEZ


Ciudad Jurez, Chihuahua Mayo de 2014
ii



EFECTO DE LA ADMINISTRACIN DE VITAMINA E Y SELENIO
SOBRE LA MOTILIDAD Y VIABILIDAD ESPERMATICA DE SEMEN
OVINO DURANTE LA ADAPTACIN A 5C PARA EL PROCESO DE
CRIOPRESERVACIN

TESIS PRESENTADA POR CATHIA CECILIA LASTRA GONZLEZ
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE:

MDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

C.D. Daniel Constandse Cortez
Director del Instituto de Ciencias Biomdicas





Ph D. Eduardo Prez Egua
Jefe del Departamento de Ciencias Veterinarias





Dr. Ramn Rivera Barreno
Coordinador del Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia


Mayo de 2014
Ciudad Jurez, Chihuahua
iii



ESTA TESIS FU REALIZADA BAJO LA DIRECCIN DEL CONSEJO
PARTICULAR INDICADO, HA SIDO APROBADA POR EL MISMO Y ACEPTADA
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE:

MDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA





Ciudad Jurez, Chihuahua. Mayo, 2014





________________________________
Dr. Jos Maria Carrera Chvez
DIRECTOR DE TESIS








_________________________________
Dr. Andrs Quezada Casasola
SINODAL








__________________________________
M. en C. Federico Prez Casio
SINODAL





iv



AGRADECIMIENTOS


Agradezco primeramente a mi asesor el Dr. Jos Maria Carrera por su
apoyo, enseanza y paciencia a lo largo de este trabajo, as como tambin al Dr.
Andrs Quezada por su apoyo incondicional y ser pieza fundamental para la
realizacin de este trabajo. A mis maestros el M. en C. Federico Prez Casio, al
Dr. Fernando Arechiga, a la Dra. Marcela Beristain, a la M. en C. Imelda Ramos, al
M.V.Z. Jorge Cardona, al M. en C. Zimri Cortes, al Dr. Eduardo Prez Egua, al
M.V.Z. Eutimio Apodaca y a cada uno de mis maestros que han sido parte de mi
formacin.
Finalmente doy gracias a mis padres y a mis cuatro hermanas por darme el
apoyo y fortaleza para siempre salir adelante, as como a mis amigos y
compaeros que me brindaron su apoyo durante el desarrollo del presente trabajo.














v




DEDICATORIA

Dedico el presente trabajo a todos los animales que hacen de este un mejor
lugar, especialmente a los cuatro sementales que involuntariamente fueron el eje
de esta investigacin.
































vi



CURRICULUM VITAE


La autora del presente trabajo naci el 22 de Noviembre de 1990
en Ciudad Jurez, Chihuahua, Mxico.

2005-2008 Estudios de Preparatoria en la Preparatoria Bachilleres plantel
No. 5 en Ciudad Jurez, Chihuahua.


2008-2014 Estudios de Licenciatura en el Programa de Medicina Veterinaria
y Zootecnia del Departamento de Ciencias Veterinarias
perteneciente al Instituto de Ciencias Biomdicas de la
Universidad Autnoma de Ciudad Jurez.




























vii



EFECTO DE LA ADMINISTRACION DE VITAMINA E Y SELENIO SOBRE LA
MOTILIDAD Y VIABILIDAD ESPERMATICA DE SEMEN OVINO DURANTE LA
ADAPTACIN A 5C PARA EL PROCESO DE CRIOPRESERVACIN
Por:
Cathia Cecilia Lastra Gonzlez
Mdico Veterinario Zootecnista
Departamento de Ciencias Veterinarias
Instituto de Ciencias Biomdicas
Universidad Autnoma de Ciudad Jurez
Asesor: Dr. Jos Maria Carrera Chvez

RESMEN

El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia de la adicin de vitamina
E y selenio en semen ovino diluido para disminuir el dao espermtico que se
presenta durante el proceso de adaptacin a 5C como paso para la
criopreservacin. Se utiliz el semen de cuatro carneros. Los eyaculados se
obtuvieron por medio de electroeyaculador, los cuales fueron mezclados y diluidos
en un extensor a base de Tris-fructosa-glicerol-yema de huevo. Despus de ser
diluidos, los eyaculados fueron divididos en cinco tratamientos en los cuales se
adicion Vitamina E (VE; 1 mg mL
-1
diluida en etanol al 100%), Selenio (Se; 2 g
mL
-1
), VE/Se, (1 mg mL
-1
y 2 g mL
-1
) etanol (10 l/ml) y un grupo control (sin
aditivo) para un total de cinco grupos experimentales. Las muestras de semen
diluido se almacenaron en pajillas y se enfriaron gradualmente durante tres horas
viii



hasta llegar a 5C. Despus de alcanzar esta temperatura las pajillas fueron
sumergidas en agua a 36C durante 30 segundos para su evaluacin. Las
muestras fueron examinadas para determinar la motilidad progresiva y la viabilidad
espermtica. Los resultados del presente estudio mostraron una reduccin de la
viabilidad de los espermatozoides en los cuales se adicion etanol en
comparacin con el grupo control y selenio. En cambio, aquellos tratamientos a los
que se les agreg etanol y VE no mostraron diferencias significativas (P<0.05). La
motilidad progresiva no fue diferente en ninguno de los tratamientos. Se concluye
que la adicin de 1 mg mL
-1
de VE diluida en etanol al 100% y 2 g mL
-1
de Se y
su combinacin, no mejora la viabilidad ni la motilidad del semen de ovino
adaptado a 5C; sin embargo, la adicin de vitamina E disminuye el efecto txico
del etanol sobre el espermatozoide.










Palabras clave: Semen, vitamina E, selenio, etanol, criopreservacin, viabilidad
espermtica, motilidad progresiva.
ix



EFFECT OF THE ADMINISTRATION OF SELENIUM AND VITAMIN E ON
VIABILITY MOTILITY SPERM SPERM AND SHEEP DURING ADAPTATION
TO 5 C PROCESS CRYOPRESERVATION

SUMMARY

The present study aimed to evaluate the effectiveness of the addition of vitamin E
and selenium in sheep semen diluted to reduce sperm damage that occurs during
the adaptation to 5C for cryopreservation. Four rams semen was used. The
ejaculates were obtained by electroejaculator, came together in pool and were
diluted in Tris-based diluent-fructose-egg yolk. After being diluted ejaculates were
divided into five equal aliquots in which vitamin E was added (VE, 1 mg mL-1
diluted in 100% ethanol ), selenium (Se; 2 mg mL
-1
), VE/Se (1 mg mL
-1
and 2 mg
mL
-1
) ethanol (10 l) and a control group (no additive) for a total of five
experimental groups. Diluted semen samples were stored in straws and gradually
cooled for three hours to 5C. After reaching this temperature, the straws were
immersed in water at 36C for 30 seconds for evaluation. The samples were
examined for sperm motility and viability. The results of this study showed an
increase in mortality of spermatozoa in which ethanol was added in comparison to
the control group and selenium. Instead, those treatments that were added ethanol
and VE showed no significant difference (P < 0.05). Progressive motility was not
different in any of the treatments. It is concluded that addition of 1 mg mL
-1
of VE
diluted in 100% ethanol and 2 ug mL
-1
and its combination is not improving quality
x



of semen seminal adapted 5C; however the addition of vitamin E if you lower the
toxic effect of ethanol on sperm.


































Key words: Semen, vitamin E, selenium, ethanol, cryopreservation, sperm viability,
progressive motility.
xi



CONTENIDO

PORTADA i
HOJA DE FIRMAS .. ii
AGRADECIMIENTOS iv
DEDICATORIA v
CURRICULUM VITAE vi
RESMEN ... vii
SUMMARY ... ix
LISTA DE CUADROS xiii
LISTA DE ABREVIATURAS . xiv
1. INTRODUCCIN ................................................................................. 1
2. REVISIN DE LITERATURA ............................................................... 3
2.1. Situacin de la ovinocultura...................................................... 3
2.2. Inseminacin artificial en ovinos................................ 4
2.3. Criopreservacin de semen............................................................. 6
2.4. Estrs oxidativo............................................... 7
2.5. Antioxidantes..................................................... 9
3. MATERIALES Y MTODOS.................................................................. 12
3.1. Localizacin del rea de estudio..................................................... 12
3.2. Iniciacin y duracin del experimento............................ 12
3.3 Caractersticas de las unidades experimentales............................. 12
3.4 Coleccin de semen............................................... 13
xii



3.5 Dilucin del semen y adicin de los tratamientos.. 15
3.6 Anlisis de parmetros estndar... 15
3.6.1 Motilidad progresiva................................................................. 16
3.6.2 Viabilidad espermtica... 16
3.7 Variables a evaluar. 16
3.8 Anlisis estadstico.. 16
4 RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................ 18
5 CONCLUSIONES ................................................................................ 26
6 LITERATURA CITADA ......................................................................... 27




























xiii



LISTA DE CUADROS



CUADRO Pgina




1. ESCALA BASADA EN EL PORCENTAJE DE CLULAS
MTILES........................................................................... 14
2. EVALUACIN DE LA MOTILIDAD MASAL Y VIABILIDAD
ESPERMATICA DEL SEMEN FRESCO....... 19
3. PORCENTAJE DE MOTILIDAD PROGRESIVA Y VIABILIDAD
ESPERMTICA TERMINADO EL PROCESO DE
ADAPTACIN A 5C Y DESPUES DE LA ADICIN DE VE,
SE, VE/SE Y ETANOL........................... 20
4. CONTRASTES ENTRE TRATAMIENTOS DESPUES DE EL
PROCESO DE ADAPTACIN A 5C..... 25

















xiv



LISTA DE ABREVIATURAS


VE= Vitamina E
Se= Selenio
IA= Inseminacin artificial
O
2
= Oxigeno
O
2
-= Superxido
H
2
O
2
= Perxido de hidrogeno
-OH= Radical hidroxilo
ROS= Especies reactivas al oxgeno
LPO= Peroxidacin de lpidos
NAC= N-acetil-cistena
GSH= Glutatin reducido
GSH-PX= Glutatin peroxidasa
CAT= Catalasa
SOD= Superxido dismutasa
ATP= Trifosfato de adenosina
ADP= Adenosn difosfato
AMP= Adenosn monofosfato cclico









1



1. INTRODUCCIN

A nivel mundial, aunque distante de la importancia que tiene la produccin
de carne bovina, porcina y de ave, la carne de ovino ocupa el cuarto lugar dentro
del consumo de protena animal, representando 5% del consumo mundial de
crnicos (excluyendo el pescado; Carrera et al., 2011).
De acuerdo con los ltimos datos publicados por el Sistema de Informacin
Agropecuaria y Pesquera, en 2011 se contaba con un hato ovino nacional de 8.2
millones de cabezas, destacando en este sentido los estados de Hidalgo y Mxico.
El estado de Chihuahua se encontraba situado en la posicin diecisis en ese
mismo ao con 216,227 cabezas (SIAP, 2013).
Las tecnologas disponibles para favorecer el desarrollo de un programa de
mejora gentica tienen como base la inseminacin artificial, la que sin duda tiene
relacin directa con el desarrollo de las tcnicas de preservacin del semen. La
preservacin de semen favorece un uso ms eficiente y prolongado de los
carneros asignados a programas de mejoramiento gentico, al permitir su
utilizacin dentro y fuera de la estacin reproductiva (Naimn et al., 2009).
Factores ambientales, fisiolgicos y genticos han sido implicados en la
falla reproductiva de sementales ovinos. Por lo tanto, es importante identificar los
factores que afectan al espermatozoide. Entre estos factores se encuentra el
estrs oxidativo al cual se le atribuye afectar la fisiologa de los espermatozoides.
El estrs oxidativo se da generalmente cuando especies oxidantes superan en
nmero a los antioxidantes (Kaur y Bilaspuri, 2011).
2



La vitamina E (VE) y el selenio (Se) son nutrientes importantes que actan
sinrgicamente y pueden afectar algunos procesos biolgicos incluyendo el
metabolismo, la inmunidad, la espermatognesis y la calidad del semen. La
asociacin de la deficiencia de VE con un deterioro del semental se estableci
hace ms de tres dcadas, y tradicionalmente se le ha nombrado como la
"vitamina anti-esterilidad". El Se es un oligoelemento esencial en la dieta,
necesario para la fertilidad del macho por medio de la biosntesis de testosterona
(Gamal et al., 2013).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la adicin de VE, Se
y la combinacin de ambos sobre la calidad seminal de semen diluido de ovino
durante el periodo de adaptacin a 5C para el proceso de criopreservacin.

























3



2. REVISIN DE LITERATURA

2.1Situacin actual de la ovinocultura
Dado el alto costo de la carne de cordero, una de las tendencias ms
significativas en la industria de la carne ovina ha sido el aumento en la
productividad de la industria. Globalmente, la mejora en la productividad es
evidente en las estadsticas de los rebaos y de la produccin. Desde 1990 los
nmeros de rebaos a nivel mundial han disminuido en un 11.2%. A pesar de la
cada en los nmeros, la produccin de carne ovina ha aumentado. Las
estadsticas de la FAO muestran que China (pas con crecimiento ms alto)
aument ms de dos veces su produccin de carne ovina desde 1990, mientras el
nmero de cabezas tan solo aumento el 12% (Molina, 2005).
En Mxico se tienen registradas alrededor de 53,000 unidades de
produccin ovina, que estn distribuidas aproximadamente de la siguiente forma:
53% en el centro, 24% en el sur-sureste y 23% en el norte. La ovinocultura de
carne se desarrolla bajo un esquema de tipo regional, en la zona central se
producen carne y lana con razas de lana (Suffolk, Hampshire, Rambouillet y
Dorset) y de pelo (Katahdin, Dorper y Pelibuey), la regin sur-sureste se basa
principalmente en la produccin de carne con razas de pelo (Pelibuey, Black Belly,
Katahdin y Dorper) y produce un poco de lana para uso artesanal con animales
criollos en Oaxaca y Chiapas; la zona norte ahora se dedica a la produccin de
carne, no obstante fue la principal proveedora de lana en pocas pasadas, por lo
que an se mantiene una poblacin de animales de la raza Rambouillet, pero ms
4



recientemente se han introducido razas de pelo (Pelibuey, Katahdin y Dorper;
Partida et al., 2013).
Estudios recientes han demostrado que la rentabilidad del ganado ovino de
carne puede incrementarse con el uso de la inseminacin artificial as como el uso
de razas prolficas, aumentando la paricin de 1.5 corderos por ao (Kukovics et
al., 2011).

2.2 Inseminacin Artificial en Ovinos
La inseminacin artificial (IA) es la colocacin de semen por medios
mecnicos en el tracto reproductor de la hembra (De Lucas y Arbiza, 2003). El
papel principal de la IA en la produccin ovina es aumentar la tasa de
mejoramiento gentico (Leethongdee, 2009).
El obstculo ms importante en la IA en los ovinos es la estructura
anatmica del tracto reproductivo de la oveja, la cual impide el pasaje transcervical
para la colocacin de semen en los cuernos uterinos. Las tasas de concepcin
despus de la IA vaginal o cervical media, son aceptables, aunque slo con el
semen recin obtenido el cual est sometido a una mnima manipulacin
(Candappa y Bartlewski, 2011).
La criopreservacin del semen no ha tenido la misma aplicacin en el
ganado ovino que en el bovino, ya que la fertilidad obtenida al inseminar
cervicalmente ha arrojado resultados muy variables, generalmente bajos (menores
a 30%). Los espermatozoides del carnero son muy susceptibles a sufrir daos
acrosomales durante el proceso de criopreservacin. Para la utilizacin de semen
criopreservado, se ha desarrollado la inseminacin intrauterina mediante
5



laparoscopa, lo que permite la visualizacin de los cuernos uterinos y el depsito
del semen en la luz uterina con buenos resultados de fertilidad (Das, 2010).
Ventajas del uso de la IA en ovinos:
1. Mejoramiento gentico
2. Mayor difusin de machos superiores en programas de seleccin y
mejoramiento.
3. Uso de machos ms jvenes (reduccin del intervalo generacional).
4. Incremento de la presin de seleccin.
5. Identificacin temprana de machos superiores (Pruebas de progenie).
6. Conservacin del material gentico
7. Transporte del material gentico.
8. Control de enfermedades.
9. Reduccin o eliminacin de machos en la explotacin.
10. Organizacin del establecimiento y registros.
11. Utilizacin de machos con incapacidad copulatoras no hereditarias.
12. Reproduccin sincronizada y/o fuera de temporada.
13. Uso de otra tecnologa.
Desventajas del uso de la IA en ovinos:
1. Inseguridad en la mejora (eleccin errada de machos).
2. Propagacin de enfermedades (infecciosas y/o hereditarias).
3. Costos (estos se convierten en ventajas a la hora de evaluar el beneficio
resultante de buenas prcticas de IA; Aisen, 2004).

6



2.3 Criopreservacin de semen
Los programas de IA a gran escala en el siglo XX se enfocaron en la
preservacin de espermatozoides bajo condiciones controladas para prolongar su
supervivencia por largos perodos de tiempo. Esto podra lograrse por mtodos
que reducen el metabolismo de los espermatozoides, y por lo tanto prolonga su
vida frtil. Hoy en da existe una gran cantidad de informacin sobre los aspectos
de la conservacin de semen ovino, como diluyentes que se han utilizado para
extender el semen, agentes protectores como glicerol y yema de huevo, tasas de
dilucin de semen, mtodos de refrigeracin y adaptacin a 5C, mtodos de
congelacin y descongelacin (Salomon y Maxwell, 1995).
La fertilidad obtenida con semen congelado es menor a la de semen fresco,
debido principalmente a una baja viabilidad post-descongelamiento y a un
trastorno subletal en la proporcin de espermatozoides sobrevivientes (Sandoval
et al., 2007). Se ha sugerido que la dilucin, enfriamiento, congelacin y
descongelacin (proceso de criopreservacin) inducen cambios estructurales que
conducen a procesos de capacitacin (Marco et al. 2005).
El espermatozoide de los mamferos domsticos no sobrevive al
enfriamiento rpido hasta 0C (shock fro) debido a la perdida de cationes y
enzimas (Byrne et al., 2000). El descenso rpido de temperatura tambin destruye
la permeabilidad selectiva de las membranas del espermatozoide al calcio, lo que
conduce a niveles intracelulares excesivos, los cuales reducen la motilidad y
conducen a necrosis (Bailey et al, 2000). En las mitocondrias de los
espermatozoides durante el enfriamiento a 5C se puede observar un cambio
7



morfolgico en la vaina mitocondrial resultante de la prdida de protena (Salomon
y Maxwell, 1995).
Una reduccin gradual en la actividad metablica de los espermatozoides
durante el almacenamiento a 5C puede limitar la produccin de subproductos
perjudiciales y tambin influye en las funciones espermticas esenciales tales
como la motilidad. Entre las diferentes alteraciones se encuentra la actividad de la
enzimas intracelulares, la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa es la primera enzima
que se daa durante el descenso de la temperatura. La concentracin intracelular
de ATP se reduce o se pierde y se aumenta el ADP y el AMP cclico de ah que la
reduccin en la membrana acrosmica en combinacin con el dao por el
descenso de temperatura representan la mayor parte de la perdida de fertilidad en
el proceso de criopreservacin (Lemma, 2011).

2.4 Estrs oxidativo
El oxgeno (O
2
) es esencial para la vida de los organismos aerobios y la
mayor parte (98%) es utilizado para la generacin de energa, la cual es liberada
durante las oxidaciones biolgicas y almacenadas por las clulas en forma de ATP
(Villa y Ceballos, 2007). De manera habitual, el O
2
se encuentra en su forma ms
estable, sin embargo por reacciones puramente qumicas, por acciones
enzimticas o por efecto de las radiaciones ionizantes, se pueden producir una
serie de especies qumicas o sustancias prooxidantes (molculas o radicales libres
altamente reactivos) que son capaces de dar lugar a mltiples reacciones con
otros compuestos presentes en el organismo, que llegan a producir dao celular
8



(Venereo, 2002). Una consecuencia directa de este proceso es que en el
intermedio se forman varias molculas con diferente grado de oxidacin, algunas
de las cuales tambin pueden entregar uno o dos electrones al O
2
y producir
intermediarios parcialmente reducidos llamadas especies reactivas al oxgeno
(ROS) tales como anin superxido (O
2
-), perxido de hidrgeno (H
2
O
2
), radical
hidroxilo (-OH), radicales alcoxi, peroxi y peroxinitritos (Villa y Ceballos, 2007).
Ciertos niveles de radicales libres son necesarios para el funcionamiento normal
de las clulas espermticas, incluyendo procesos como la capacitacin, la
hiperactivacin, la reaccin acrosmica, la fusin al ovocito y la fertilizacin
(Restrepo et al., 2012). Sin embargo, cuando estas especies oxidantes rebasan la
capacidad antioxidante se presenta el estrs oxidativo (Membrillo et al., 2003).
Cuando el semen se almacena a 4-5C hay una disminucin de la
motilidad, de la integridad funcional de las membranas y de la fertilidad (Mustafa y
Necmettin, 2007). Los espermatozoides producen y envan ROS al medio
extracelular, de los cuales la mayora son producidos por las mitocondrias y son el
producto de la reduccin monovalente del oxgeno molecular durante la
fosforilacin oxidativa. Los ROS inactivan enzimas glucolticas que traen como
consecuencia un bloqueo en la biosntesis de ATP y la consiguiente prdida de la
motilidad por falta de combustible necesario para la contraccin de los
microtubulos flagelares de los espermatozoides (Cordova et al., 2010).
Uno de los principales procesos biolgicos asociado con ROS es la
peroxidacin de lpidos (LPO). La susceptibilidad de los espermatozoides de
rumiantes a la LPO es una consecuencia de la abundancia cidos grasos
poliinsaturados en la membrana plasmtica del espermatozoide. Esta da la fluidez
9



a las membranas y la flexibilidad para ayudar a los espermatozoides a participar
en los eventos de fusin de membrana asociados con la fertilizacin (Kaur y
Bilaspuri, 2011). Los espermatozoides descargan la mayor parte de su citoplasma,
inmediatamente antes de la espermiacin y, como consecuencia, pierden la
proteccin de las clulas que se basa en enzimas citoplasmticas (como la
catalasa, superxido dismutasa y glutatin peroxidasa). La peroxidacin lipdica
provoca la prdida de la integridad de la membrana, inactivacin enzimatica y
dao estructural al ADN terminando con la muerte celular (Anghel et al., 2010).

2.5 Antioxidantes
Los antioxidantes son un conjunto de compuestos qumicos o productos
biolgicos que contrarrestan de una manera directa o indirecta los efectos nocivos
de los radicales libres u oxidaciones. Se han clasificado en dos principales
sistemas, el sistema no enzimtico que comprende el glutatin, cido lipoico, la
bilirrubina, las ubiquinonas, los bioflavonoides, la vitamina E (alfa tocoferol), la
vitamina C (cido ascrbico), la vitamina A, los carotenoides, acetil-L-carnitina,
coenzima Q10, curcumina, N-acetil-cistena (NAC), resveratrol, vitamina B;
mientras que los minerales selenio, cobre, zinc y magnesio forman parte de la
estructura molecular de algunas de las enzimas antioxidantes (Lpez et al., 2012).
Por otro lado, el sistema enzimtico que corresponde a glutatin reducido (GSH),
glutatin peroxidasa (GSH-PX), catalasa (CAT) y superxido dismutasa (SOD).
Estos sistemas se han descrito como un mecanismo de defensa contra la
peroxidacion de los lpidos en el semen y son factor determinante en el
10



mantenimiento de la motilidad y viabilidad del espermatozoide (Mustafa et al.,
2008).
La dilucin del semen comnmente utilizado en el proceso de
criopreservacin promueve la reduccin de la concentracin de antioxidantes, lo
que resulta en un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes, y por lo tanto en
estrs celular. Con el fin de reducir los posibles efectos de este desequilibrio se ha
estudiado el efecto de la adicin de los extensores junto con la de diversos
antioxidantes (Guerra et al., 2012). El uso de antioxidantes podra constituir una
alternativa para mejorar los protocolos de criopreservacin de semen ovino
mediante el bloqueo de la desestabilizacin espermtica y as lograr mejores tasa
de fertilidad (Santiani et al., 2007).
Se ha propuesto que la VE es el principal componente del sistema
antioxidante de los espermatozoides y es uno de los principales protectores de la
membrana espermtica contra ROS y LPO (Bansal y Bilaspuri, 2009). Debido a su
liposolubilidad, la VE es la primera lnea de defensa contra la peroxidacin de los
cidos grasos poliinsaturados. Est acta en la rotura de la cadena oxidante en las
membranas, ya que disminuye los radicales libres tales como el anin superxido,
perxido de hidrgeno y el radical hidroxilo (Amini et al., 2013).
El Se es un elemento que cumple importantes funciones en los procesos
reproductivos. En el macho cantidades insuficientes de Se en el organismo se ven
reflejadas en hipogonadismo, lo que traer como consecuencia baja produccin y
mala calidad del semen (Seremak et al., 1999). El aumento del microelemento en
los sementales ovinos produce un aumento en la motilidad y en el conteo total de
clulas en el semen, as como en las proporciones de espermatozoides vivos y
11



normales (Carrillo et al., 2012). El selenio tiene tambin una funcin antioxidante
como cofactor de la enzima citoplasmtica glutation-peroxidasa, enzima
relacionada con la neutralizacin y eliminacin de los radicales libres de oxgeno
que pueden alterar la integridad celular (Daza, et al., 2000).





































12



3. MATERIALES Y METODOS

3.1 Localizacin del rea de estudio
El presente estudio se llev a cabo en las instalaciones de la Unidad de
Prcticas en Rumiantes as como tambin en el Laboratorio Multidisciplinario de
Veterinaria pertenecientes al Departamento de Ciencias Veterinarias del Instituto
de Ciencias Biomdicas de la Universidad Autnoma de Ciudad Jurez, ubicado
en Ciudad Jurez, Chihuahua el cual tiene una altitud aproximada de 1133 msnm
(INEGI, 1991), una latitud de 31.746534 y una longitud de 106.443191 (Google
Maps, 2014).

3.2 Iniciacin y duracin del experimento
La investigacin inicio en el mes de septiembre de 2013. El trabajo de
campo se llev acabo en veintin das los cuales correspondieron a los meses de
marzo y abril de 2014. La recopilacin de informacin, anlisis estadstico y
escritura tuvo una duracin de nueve meses.

3.3 Caractersticas de las unidades experimentales
Se utilizaron cuatro carneros con encaste de las razas Black-belly,
Katahdin, Pelibuey y Dorper de aproximadamente de 2 aos de edad. Contaban
con un peso de 60 kg aproximadamente y una condicin corporal de 4 (en una
escala de 1 a 5; Thompson y Meyer, 1994). La alimentacin de los animales
durante la realizacin del estudio se bas principalmente en heno de alfalfa y
maz.
13



Antes de iniciar el experimento se realiz una prueba de fertilidad a cada
uno de ellos para determinar sin eran aptos para el experimento; sta consisti en
una evaluacin fsica, evaluacin del tamao y tono testicular, evaluacin del pene
y prepucio, y evaluacin seminal.

3.4 Coleccin de semen
Los eyaculados fueron evaluados e incluidos en el estudio solamente si
cumplan las siguientes caractersticas: volumen de 0.3-1.5 ml, concentracin de
1x10
9
espermatozoides por ml y motilidad masal del 70% (Azawi y Hussein, 2013).
En total se obtuvieron 26 eyaculados con la utilizacin de electroeyaculador. Los
eyaculados se obtuvieron cada tercer da durante tres semanas. Para la
evaluacin seminal se consider el volumen el cual se midi con un tubo
graduado; la concentracin, la cual se obtuvo a travs del conteo espermtico con
la cmara de Neubauer con el mtodo descrito por la Universidad de Wisconsin
(UW, 2014); la motilidad se determin por apreciacin visual de ondas, utilizando
la clasificacin elaborada por Hafez (2000; Cuadro 1); y por ltimo, para conocer el
porcentaje de viabilidad se realiz una tincin basada en eosina-nigrosina (eosina
1% y nigrosina 5% en solucin salina). Para realizar la tincin se utiliz un
portaobjetos atemperado a 34C en cual se colocaron 30 l de semen y la misma
cantidad de tincin, se mezcl y se dej reposar 50 segundos y se realiz el frotis.
Una vez seco, el frotis se observ al microscopio con objetivo de 60X, se eligi un
campo al azar y se contabilizaron 100 clulas. Las clulas teidas de rosa
representan el porcentaje de mortalidad y las no teidas se consideran clulas
viables (Chemineau y Cagni, 1991).
14








CUADRO 1. ESCALA BASADA EN EL PORCENTAJE DE CLULAS MTILES.
Valor
descriptivo
Aspecto del modelo
% de clulas
mviles
Criterio evaluativo
Muy buena Movimiento en ondas
vigorosas y en remolinos
rpidos
80-90% ++++
Buena Remolinos y ondas ms
lentas
60-80% +++
Regular Sin remolinos, pero con
oscilaciones generalizadas
40-60% ++
Mala Escasa o ninguna
motilidad
0-40% + o -







15



3.5 Dilucin del semen y adicin los tratamientos
Para la dilucin de las muestras de semen se utiliz un diluyente comercial
a base de Tris-fructosa-glicerol-yema de huevo (Triladyl) en una proporcin de
20% de diluyente, 20% de yema de huevo y 60% de agua. Despus de la adicin
de diluyente al semen, la muestra se evalu nuevamente para asegurar que la
dilucin no afectara la calidad seminal.
Los eyaculados se manejaron en conjunto, se mezclaron y fueron
divididos en cinco alcuotas iguales de 3 ml en las cuales se adicion VE (1 mg
mL
-1
debido a la insolubilidad de la vitamina E en agua se utiliz etanol al 100%
para diluirla; Azawi y Hussein, 2013), Se (2 g mL
-1
; Dorostkar et al., 2012),
VE/Se, (1 mg/ml y 2 g mL
-1
,) etanol (10 l mL
-1
; Upreti et al., 1997) y sin aditivo
(control) para un total de cinco grupos experimentales, los cuales tenan una
concentracin final de 80x10
6
espermatozoides por ml (DAlessandro et al., 2001).
Las alcuotas fueron distribuidas y almacenadas en pajillas francesas de 0.5 ml las
cuales fueron selladas por calor y refrigeradas durante tres horas hasta que su
temperatura descendi de 36C a 5C.

3.6 Anlisis de parmetros estndar del semen
Despus del almacenamiento del semen a 5C, las pajillas fueron
sumergidas durante 30 segundos en un bao de agua a 36C para la evaluacin
de los parmetros estndar (Ahmet et al., 2008).


16



3.6.1 Motilidad progresiva
La motilidad progresiva se evalu colocando 40 l de semen diluido sobre
un portaobjetos a temperado a 36C, la gota se cubri con un cubreobjeto tambin
atemperado y se observ en el microscopio con objetivo de 40X. Las estimaciones
de la motilidad de los espermatozoides se llevaron a cabo en tres campos
microscpicos diferentes para cada muestra de semen. La media de las tres
estimaciones sucesivas se registr como la puntuacin de la motilidad final
(Mustafa y Necmettin, 2007).

3.6.2 Viabilidad espermtica
La viabilidad espermtica se evalu con la tincin eosina-nigrosina
utilizando la metodologa previamente descrita.

3.7 Variables a evaluar
a) Motilidad progresiva.
Porcentaje de espermatozoides con movimiento lineal progresivo despus del
proceso de refrigeracin.
b) Viabilidad espermtica.
Porcentaje de espermatozoides vivos despus del proceso de refrigeracin.

3.8 Anlisis estadstico
Los efectos del tratamiento sobre la tasa de motilidad progresiva y la tasa
de viabilidad se analizaron a travs de un diseo completamente al azar utilizando
17



el procedimiento GENMOD de SAS y se realizaron contrastes simples entre los
tratamientos.






















18



4. RESULTADOS Y DISCUSIN

En el cuadro 2 se observa la motilidad masal y la viabilidad de los
eyaculados antes de la dilucin del semen y la adicin de los tratamientos. Al
comparar los resultados obtenidos en el control (cuadro 3) con la motilidad inicial
antes de la dilucin del semen (cuadro 2) se obtuvo una diferencia del 15%,
resultado no muy diferente al descrito por Cmara et al. (2011) quienes obtuvieron
una diferencia de 9%. La diferencia de la viabilidad del control en comparacin con
el semen antes de la dilucin es de 9%, la cual coincide con los resultados de
Mustafa et al. (2007).
La motilidad progresiva observada con el uso de VE no mostro diferencias
significativas en comparacin con el control. Estos resultados no coinciden con los
descritos por Amini et al. (2013) quienes compararon el efecto de la VE a
diferentes dosis sobre el semen de carnero en el proceso de adaptacin a 5C
encontrando un incremento significativo de un 20% en la motilidad progresiva con
la adicin de 1 mg mL
-1
de VE, similar a lo reportado por Azawi y Hussein (2013)
quienes utilizando la misma dosis de 1 mg mL
-1
reportaron un incremento de
motilidad en un 10% a las 120 horas a 5C. Ball et al. (2001) aadieron Tempo
(anlogo de VE) y VE en el semen de equino utilizando dosis de 1 mg mL
-1
y 0.5
mg mL
-1
el cual se almacen por 72 horas a 5C, sin observar diferencias en los
tratamientos. La dosis de 1 mg de VE mL
-1
de semen diluido fue la que mostr el
mayor incremento en la motilidad progresiva en los artculos consultados, razn
por la que fue seleccionada para el presente estudio.
19










CUADRO 2. EVALUACIN DE LA MOTILIDAD MASAL Y VIABILIDAD
ESPERMTICA DEL SEMEN FRESCO.
Repeticin Motilidad Masal (%) Viabilidad (%)
1 70 87
2 80 85
3 87 83
4 87 91
5 90 80
6
Media
80
82.33 2.97
90
86.001.71

20

















CUADRO 3. PORCENTAJE DE MOTILIDAD PROGRESIVA Y VIABILIDAD
ESPERMTICA TERMINADO EL PROCESO DE ADAPTACIN A
5C Y DESPUES DE LA ADICIN DE VE, SE, VE/SE Y ETANOL
(MEDIAEE).
Tratamiento Motilidad (%) Viabilidad (%)
Control 67.002.84
a
76.673.24
a

Vitamina E 65.502.29
a
73.004.42
ab

Vitamina E/Selenio 64.831.70
a
73.333.89
ab

Selenio 67.673.49
a
75.504.30
a

Etanol 63.502.83
a
68.334.12
b

Los valores medios de cada parmetro en la misma columna con distinta letra (
a,

b
)
son significativamente diferentes (P <0.05).




.


21



Los resultados del cuadro 3 muestran que la motilidad progresiva es igual
en el control que en los espermatozoides tratados con Se, mientras que los dems
tratamientos muestran una motilidad menor, sin mostrar diferencia significativa en
ninguno de los casos (P0.05). Scott et al. (1998) estudiaron el efecto del Se
suplementado oralmente a hombres de 32 aos, los cuales tomaron 100 g de Se
al da. En los resultados se observ que aquellos hombres que fueron
suplementados con Se tenan hasta 9% ms de motilidad espermtica que los
hombres del grupo control. Por otra parte, Dorostkar et al., (2012) utilizaron
diversas dosis de Se adicionndolo directamente sobre el semen de bfalo
(Bubalus bubalis) adaptado a 5C, encontrando diferencias significativas en el
semen al agregar 2 g mL
-1
de Se; por esta razn y la escasa informacin sobre el
efecto directo del Se en el espermatozoide, se decidi utilizar esta dosis. Sin
embargo, Seramak et al., (1999) obtuvieron resultados muy similares a los
obtenidos en el presente estudio, sin diferencias significativas comparando
diversas dosis de Se (1 y 10 g mL
-1
) en el semen de carnero criopreservado.
Con la combinacin de los tratamientos de VE y Se no se observaron
diferencias en comparacin con el control y los dems tratamientos. Vezina et al.
(1996) describieron que al suministrar por va oral 100 g de Se y 200 mg de VE a
hombres de 31 aos de edad durante 180 das se observ un incremento de 17%
en la motilidad en comparacin con el da 0. Guzmn et al (2000) tambin
observaron diferencias significativas en su investigacin sobre semen de cerdos a
los cuales se les agrego a la dieta 0.5 ppm de Se y 220 UI/kg de VE. Por otra
parte Kolodziej y Jacyno (2005) adicionaron 0.2 mg de Se y 30 mg de VE en la
22



racin diaria de verracos durante 110 das sin obtener alguna mejora en la
motilidad espermtica.
El tratamiento experimental de etanol se llev a cabo debido a la
insolubilidad de la VE en agua (Febles et al., 2002), por ello todos los grupos
experimentales con VE fueron diluidos en etanol. La motilidad progresiva del
control en comparacin con el tratamiento de etanol, pese ser la ms distante de
todos los tratamientos con 3% menos de motilidad, no es una diferencia
estadsticamente significativa. Los resultados encontrados acerca del efecto del
etanol son contradictorios. Upreti et al. (1997) diluyeron 10 l de etanol por cada
mililitro de diluyente con semen de carnero, y reportan que obtuvieron 3% ms
motilidad en el tratamiento de etanol que en el grupo control. Por otro lado Nasiri
et al. (2011) reportan diferencias significativas al adicionar 5 l mL
-1
de etanol en
semen de toro, reduciendo la motilidad progresiva en un 17% en comparacin al
control.
La VE en comparacin con el control present 3% menos de viabilidad, lo
cual no representa una diferencia. Marti et al. (2008) diluyeron semen de carnero
en leche, a la cual aadieron 1 mg/ml de VE y realizaron el proceso de
criopreservacin; as mismo, Bansal y Bilaspuri (2009) trabajaron con semen de
toro agregando 0.5, 1, y 1.25 mg mL
-1
de VE incubando el semen a 37C. En
ambos estudios no se obtuvieron diferencias, coincidiendo los resultados con los
obtenidos en este estudio. Por otra parte Anghel et al. (2010) obtuvieron 14% ms
de viabilidad en semen de ciervo (Cervus elaphus) al agregar 1 mg mL
-1
de VE en
comparacin con su control. La VE es agregada al semen con la finalidad de crear
un efecto protector en el espermatozoide, este efecto es debido a su
23



liposolubilidad, lo que crea una lnea de defensa contra la peroxidacion lipdica
(Febles et al., 2002).
En cuanto a viabilidad, en la comparacin hecha entre el control y el
tratamiento de Se no se observaron diferencias. Sin embargo, en el tratamiento
con etanol se observa 9% menos de viabilidad espermtica. Al igual que los
resultados obtenidos, Dorostkar et al., (2012) mencionan que no encontraron
diferencias en cuanto a viabilidad al agregar 2 g mL
-1
de Se en el semen de
bfalo (Bubalus bubalis). Kendall et al. (2000) describen que ofrecer bolos de
minerales como selenio, zinc y cobalto mejora significativamente la viabilidad del
espermatozoide despus de 79 das de ofrecer el bolo. La importancia del Se en
el semen es debido a la funcin como cofactor de la enzima GSH-PX, la cual se
encarga de la eliminacin de radicales libres a travs de la presencia de la
selenoproteina glutation capsular (Agarwal y Sekhon, 2010).
La viabilidad espermtica, al adicionar la combinacin de VE/Se no mostr
diferencias. Por el contrario, Segerson y Johnson (1980) al aplicar 680 UI de VE y
50 mg de Se de forma parenteral a toros, obtuvieron un descenso en la viabilidad
de 3% en comparacin al grupo control, en cambio Mahmoud et al. (2013)
observaron 14% ms de viabilidad en el semen de carnero al aplicar de manera
intramuscular 5 mg de selenito de sodio y 450 mg de VE dos veces en 30 das. La
combinacin de VE y Se se justifica debido a su funcin sinrgica como
antiperoxidantes. La VE es la base de la quelacin del Se, es por ello que
sinrgicamente la VE potencializa el efecto del Se como antioxidante (Agarwal y
Sekhon, 2010).
24



Al comparar los resultados obtenidos en el presente estudio se pueden
observar diferencias en el tratamiento de etanol con 8% menos de viabilidad en
comparacin con el control y el tratamiento de Se. Nasiri et al. (2011) describen
que al agregar 0.5 l de etanol en el semen de toros y despus del proceso de
criopreservacin obtuvieron 19% menos viabilidad que en su control, lo cual
coincide con los resultados del presente estudio. La mortalidad y la disminucin de
la motilidad de los espermatozoides al agregar etanol al semen se explica debido
a las interacciones de la membrana celular con protenas las cuales se modifican
por la accin de etanol en la membrana. El etanol acta sobre la membrana
celular estresndola mecnicamente (Rivera y Lima, 2013). Sin embargo, se
observ que al adicionar etanol con VE, el efecto txico del etanol disminuye, ya
que tanto en los tratamientos de VE y VE/Se, no se observaron diferencias en la
motilidad progresiva y viabilidad en comparacin al control como la que si se
observ en el tratamiento de etanol.
En el cuadro 4 se muestran los valores de probabilidad de los
contrastes entre tratamientos. Respecto a la motilidad progresiva, aunque no
existieron diferencias estadsticamente significativas, la mayor diferencia se
observ entre los tratamientos de etanol y selenio. El control tuvo una tendencia
similar al selenio.
En la viabilidad espermtica se observaron diferencias entre los
tratamientos de control contra etanol y Se contra etanol, mientras que los
tratamientos con VE (solo VE y VE/Se) y etanol no mostraron diferencias.
25







CUADRO 4. CONTRASTES ENTRE TRATAMIENTOS DESPUES DE EL
PROCESO DE ADAPTACIN A 5C.
Tratamientos
Motilidad Progresiva
Probabilidad
Viabilidad
Probabilidad
T
1
- T
2
0.80 0.63
T
1
- T
3
0.43 0.18
T
1
T
4
0.58 0.14
T
1
- T
5
0.20 <0.01
T
2
- T
3
0.30 0.39
T
2
- T
4
0.42 0.32
T
2
- T
5
0.13 <0.01
T
3
- T
4
0.81 0.90
T
3
- T
5
0.63 0.06
T
4
- T
5
0.47 0.08

T
1
Control
T
2
Selenio
T
3
Vitamina E/Selenio
T
4
Vitamina E
T
5
Etanol



26



5. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en el presente estudio indican que la adicin de 1
mg mL
-1
de VE y 2 g mL
-1
de Se y su combinacin no aumentan la viabilidad ni
la motilidad progresiva de los espermatozoides durante la adaptacin a 5C para
el proceso de criopreservacin.
La adicin de 10 l mL
-1
de etanol al semen diluido afecta la viabilidad de
los espermatozoides. Sin embargo la adicin de VE disminuye el efecto toxico del
etanol sobre el espermatozoide, ya que en los tratamientos VE y VE/Se se
observ un efecto protector de la VE sobre el espermatozoide expuesto al etanol.
En trabajos posteriores, se recomienda disminuir la cantidad de etanol
como diluyente de la VE o evaluar diferentes alternativas para realizar la dilucin
de la VE sin el uso de etanol. Otra alternativa es evaluar el incremento de la dosis
de VE, con el objetivo de disminuir el efecto toxico del etanol sobre el
espermatozoide.

27




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