LIMPIEZA FITOSANITARIA

DE ENFERMEDADES VIRALES
EN PLNTULAS DE CTRICOS
Palmira, Agosto de 2006 Boletn Divulgativo N 26
Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria
Centro de Investigacion Palmira
Proyecto:
Fortalecimiento del Centro de Investigacin Palmira como un centro de referencia
nacional para la produccin de plntulas certificadas y el mejoramiento de la
productividad de ctricos en Colombia.
LIMPIEZA FITOSANITARIA DE ENFERMEDADES VIRALES
EN PLNTULAS DE CTRICOS
1
lvaro Caicedo A
2
Oscar Julin Muoz R
1
I.A. Master en Citricultura, CORPOICA, C. I. Palmira. E-mail
ilogo, CORPOICA, C. I. Palmira. E-mail:
acaicedo@telesat.com.co
oscarive9@hotmail.com
2
B
Los ctricos en Colombia se encuentran afectados por enfermedades vrales y
otros agentes patgenos los cuales causan prdidas econmicas; una
citricultura rentable a largo plazo debe partir de la siembra de rboles sanos
que permitan maximizar los rendimientos con buena calidad del fruto y
longevidad de la explotacin.
CORPOICA en el Centro de Investigacin de Palmira (C.I.), adelanta proyectos
de Mejora Sanitaria de Ctricos, utilizando la tcnica de Microinjertacin in
Vitro de pices caulinares. Estas actividades buscan sanear las introducciones
del Banco de Germoplasma de Ctricos del C.I. Palmira, y en especial las
variedades comerciales demandadas por los citricultores, promoviendo el uso
de variedades libres de enfermedades y garantizando la pureza gentica del
material de siembra.
El objetivo de esta publicacion es ilustrar el proceso de limpieza fitosanitaria de
plntulas de ctricos con el uso de tcnicas biotecnolgicas, mediante tres
etapas: 1) Acondicionamiento de la infraestructura y equipos, 2)
Microinjertacin y 3) Serologia y multiplicacin de yemas sanas, por medio del
cual se ilustra al lector en puntos clave de la limpieza fitosanitaria enfocada a la
certificacin de plntulas de ctricos.
Introduccin
I ETAPA
REQUERIMIENTOS MINIMOS DEL PROCESO DE LIMPIEZA
FITOSANITARIA DE CTRICOS EN EL C.I. PALMIRA
Acogiendo el concepto de Certificacin de plntulas de ctricos, como la implementacin de una serie de normas
legales y procedimientos de laboratorio para garantizar el ptimo
y la , de material ampliamente demanda por los viveristas, citricultores y dems
actores relacionados con el sector citricola de una pas. En este sentido uno de los pilares fundamentales de este
proceso lo constituye la identidad gentica del material de propagacin, que se logra solo a partir de Bancos de
Germoplasma constituidos para tal fin. El siguiente esquema integra algunos conceptos relacionados con la
importancia de los bancos de germoplasma de ctricos y otras especies.
ESTADO FITOSANITARIO, la AUTENTICIDAD
VARIETAL CALIDAD AGRONMICA
Biodiversidad:
Recurso Gentico:
Germoplasma:
Banco de Germoplasma:
Conservacin:
Variedades:
Variabilidad de organismos vivos (Ej.: colecta de ctricos que reposan en
el B.G.)
Material biolgico (planta), portador y transmisor de caractersticas
genticas heredables, de valor social, econmico y cultural (investigacin).
Material gentico que forma la base fsica de la herencia
(introducciones).
Coleccin de la diversidad de genes existente en cada
especie.
Manejo, preservacin y utilizacin de los recursos genticos.
Grupo de cultivares de una misma especie, introducidas y criollas con
caractersticas de algn inters.
CONCEPTOS INTEGRADOS A BANCO
DE GERMOPLASMA DE CITRICOS
3
En el C.I. Palmira se tiene la responsabilidad ante el pas y ante los citricultores de velar por la conservacin (sanidad), estudio,
caracterizacin, ampliacin y multiplicacin del material vegetal conocido como introducciones, procedentes de colectas
nacionales e importaciones de materiales extranjeros. La composicin de este recurso gentico se ilustra en la Tabla 1.
Algunos elementos bsicos a conocer en programas de
limpieza fitosanitaria, estn representados por el
conocimiento de los principales disturbios fitosnitarios y las
tcnicas o herramientas que nos permiten afrontar estos
problemas, se ilustran en los siguientes temas:.
ENFERMEDADES VIRALES DE MAYOR IMPORTANCIA
PARA COLOMBIA
Tristeza de los Ctricos. En especial en limas tahit y
pajarito, pomelos, y todas las combinaciones sobre
naranjo agrio.
Psorosis. Especialmente susceptibles naranjos y
tangelos.
Exocortis y xyloporosis. Patrones: naranja trifoliada y sus
hbridos.
Cristacortis, blight, leprosis
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Tabla 1. Resumen de la composicin del Banco de Germoplasma de Ctricos del C.I. Palmira,
Por cultivares, gneros y procedencia.
TRANSMISION DE ENFERMEDADES VIRALES.
HOMBRE. Injerto (practica que perpetua
enfermedades sistmicas), herramienta (la no
desinfeccin de esta), movimiento ilegal
fronterizo, Cuarentena (traslado ilegal de material
procedente de pases con enfermedades exticas
para Colombia).
INSECTOS. fidos (Toxoptera citricida, Aphis
gosiipy, vs. Virus CTV)
OTRAS. Ausencia de medidas legales, asistencia
tcnica, monitoreo, diagnsticos, Certificacin)
LIMPIEZA FITOSANITARIA.
Tcnica de Microinjertacin, (herramienta
biotecnolgica que permite sanear material madre
contaminado)
Patrn o Portainjerto, Citranges: Troyer y Carrizo u
otros patones trifoliados (permiten identificar la
yema meristemtica microinjertada). Tablas 2 y 3
resume el listado de caractersticas de los
patrones a utilizar en injertaciones.
Variedades o Copas, Demanda Comercial
(pices meristemticos).
DIAGNOSTICO FITOSANITARIO.
Pruebas Serolgicas, Tristeza de los Ctricos o
CTV.
Pruebas Moleculares, Psorosis, Leprosis,
Viroides, etc.
Plantas Indicadoras, Razas CTV, psorosis,
viroides de la exocortis y xyloporosis.
B. Germoplasma: Variedades sanas
B. Fundacin: Plantas lite
B. Propagacin: Plntulas Madre.
B. Multiplicacin: Aumento yemas.
VIVEROS COMERCIALES
Figura 1. Esquema simplificado de la funcin de los bloques de multiplicacin
de material sano de ctricos.
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La Tabla 2 y 3.
Presentan un
resumen de las
principales
caractersticas
agronmicas
de los patrones
ms utilizados
en Colombia.
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EL PROCESO DE LIMPIEZA FITOSANITARIA DEBE CONTAR CON CASAS DE MALLAANTIFIDO:
Estas son estructuras metlicas, de madera inmunizada o de guadua, recubiertas con plstico y malla antifidos,
preferiblemente blanca, diseadas para aislar plntulas sanas de insectos-plaga vectores de virus y otros patgenos, y poder as
conservar e incrementar material de propagacin sano (yemas) obtenido de plantas madre multiplicadas por procesos
biotecnolgicos.
F.
E.
D.
C.
B.
A.
Figura 2: (A). Vivero tecnificado con plantas sanas de
ctricos (1 milln plantas/ao) en Sao Paulo, Brasil, (B).
Empresa citricola que se autoabas-tecimiento de
plantas certificadas,
(C). Visita a Viveros certificados de EMBRAPA (Cruz
das Almas, Baha), (D). Estructuras metlicas
invernaderos y casas malla Cenicaf, (E). Casa malla
antipulgn C.I. Palmira, (F). Casas de malla CIAT.
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Huerto de semilla de patrones:
rea convenientemente demarcada y aislada, para la
produccin de semilla sexual de patrones que sern
utilizados en la multiplicacin masiva de plntulas sanas a
partir de yemas de plantas madre producidas en ambientes
protegidos o casas de malla antipulgn. La extraccin y
conservacin de semilla se debe hacer siguiendo protocolos
de laboratorio que existen para tal fin (Corpoica, C.I.
Palmira).
Figura 3. Huerto de semilla sexual de patrones de ctricos procedentes del
Bando de Germoplasma del C.I. Palmira.
Casa-malla antifido en el C.I. Palmira, en donde se
conservan, evalan e injertan las variedades lite,
(comerciales), saneadas por mtodos de microinjertacin
in-Vitro, para multiplicacin masiva de yemas con destino a
investigacin, viveristas y citricultores en general.
Figura 4: Casas de malla antifido en el C.I. Palmira: (A)
Casas malla bloque de fundacin, propagacin y
multiplicacin respectivamente, (B) Casa malla antifido
que conserva el germoplasma microinjertado Plantas
madre.
8
A
B
Figura 5. Laboratorio para limpieza fitosanitaria y equipos de uso frecuente en microinjertacin y diagnostico serolgico: (A) laboratorio
equipado con equipos y reactivos en procesos de diagnostico de enfermedades virales (Fundecitrus-Brasil), (B) autoclave para esterilizacin de
cristalera y otros usos, (C) peachmetro para monitorear soluciones, (D) reactivos de uso frecuente en el C.I. Palmira en microinjertacin, (E)
lector de Elisa para procesamiento de muestras de tejido vegetal de plantas microinjertadas y plantas madre, y (F) estereoscopio) equipo bsico
para proceso de microinjertacin de pices caulinares de ctricos.
II ETAPA.
PROCESO DE MICROINJERTACION Y DIAGNOSTICO.
A. B. C . .
D. E F . .
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Figura 6. Proceso de Microinjertacin en laboratorio: (A) semilla escarificada para facilitar y agilizar el proceso de germinacin en tubos de
ensayo, (B) preparacin de yemas de 0.2 mm, siembra de semilla patrones in-Vitro, y preparacin de patrones para la microinjertacin, (C)
siembra de semilla, que servir de patrn en un tubo de ensayo en medio slido MS, (D) patrn en desarrollo por incubacin en oscuridad a 24
26C donde al cabo de 15 das se obtienen plntulas etioladas para realizar la tcnica de microinjerto, (E) Poda de rbol madre e induccin de
yemas para micro injertar, (F) yemas o brotes aptos para micro injertar en patrones etiolados.
10
B.
F.
E.
C.
A.
D.
B.
11
Figura 7. Proceso de preparacin del patrn etiolado, y microinjertacin de la yema, y su posterior prendimiento, desarrollo y
conservacin en tubos de ensayo. La yema micro-injertada es re-injertada en patrones desarrollados que crecen en casas de malla antifido.
Estos pices de 2 a 3 cm, se obtienen de plantas donantes, portadoras de patgenos, previamente seleccionadas y podadas. Despus de
esterilizarlas y con la ayuda del estereoscopio se extrae el pice meristemtico y se procede a la eliminacin de cotiledones del patron, poda de
epicotilo, despunte radicular (A), la yema con una longitud 0.2 a 0.4 mm, est acompaada con uno o dos primordios foliares (B). Las plntulas
microinjertadas (C), se colocan en un tubo con medio nutritivo lquido Murashige+Sacarosa (D), suspendidas mediante un soporte de papel de
o
filtro a una temperatura de 24 - 36 C y 16 horas luz por espacio de 30-40 das (E).
Foto 8. Proceso de Re-injertacin en casa de malla antipulgn, con brotes microinjertados en patrones etiolados en laboratorio. El transplante se
hace directamente en macetas con suelo tratado, o se reinjerta sobre un patrn desarrollado en bolsa (A), mediante injertacin convencional: (B)
patrn trifoliado, (C) Injertacin y amarre, (D) microinjerto procedente del tubo de ensayo, (E) prendimiento del brote microinjertado. Se cubre con
bolsas de polietileno para evitar deshidratacin (F); permaneciendo en invernadero a T C. y H.R. controladas. Finalmente se obtiene una plntula
madre (G) que ser evaluada por serologia para confirmar su sanidad.
A. B. C.
D. E. F. G.
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Figura 9. Lector de Elisa, Equipo bsico de diagnstico para
determinar presencia de partculas virales mediante la utilizacin de
anticuerpos policlonales, en tejido vegetal de plantas madre
microinjertadas en laboratorio de biotecnologa. Garantiza el proceso de
saneamiento de las variedades lite y del Banco de Germoplasma de
ctricos. Despus de tener la planta desarrollada, se practican pruebas
serolgicas y biolgicas para enfermedades de origen viral, como es el
caso de la tcnica de inmunoimpresin ELISA, para diagnstico de
CTV.
(Tabla 4).Cultivares de ctricos saneados en el C.I. Palmira (Julio/06), mediante
la tcnica de microinjertacin In Vitro de pices caulinares de ctricos,
conservados en casa malla antifido
Grupo
Naranjas
Mandarinas
Limas cidas
Clementinas
Pomelos
Limones
Satsumas
Otros
Hbridos
Nombre cientfico
Citrus sinensis
C. reticulata
C. aurantifolia
C. clementina
C. paradisi
C. limn
C. satsuma
Varias sp.
Varios cruzamientos
Microinjertadas +
Reinjertadas
210
42
40
27
22
8
7
7
47
410
Total plantas en casa malla
13
Figura 10.
Proceso de conservacin y
mantenimiento de plantas
saneadas procedentes del
Banco de Germoplasma, y
protegidas en casas de malla
antipulgn, para preservar su
sanidad como plantas madre.
Las fotos (A, B, C, D y E) ilustran
e l e s t a d o a c t u a l d e
conservacin de las plantas
madr e pr oveni ent es del
laboratorio de biotecnologa del
C.I. Palmira, las cuales son
monitoreadas peridicamente
para comprobar su sanidad
como plantas donadoras de
yemas en programas de
certificacin.
A.
B.
C.
D.
E.
III. ETAPA.
PROCESO DE MULTIPLICACION INTENSIVA
Y MANEJO AGRONMICO
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Figura 11. La aplicacin de practicas agronmicas desde el momento de preparar el sustrato en proporcin 1:1:1 arena+cascarilla arroz+tierra, (A),
y el germinador (D), para el desarrollo de la plntula en bolsa, el manejo de la nutricin qumica y orgnica, esta ltima a base de productos biolgicos
(B, C): Ej.: agroplus (10%), y las medidas de desinfeccin de la herramienta de corte con hipoclorito de sodio, 5% (F), permiten asegurar el normal
desarrollo de yemas y plntulas (E) conservadas en condiciones de ambientes protegidos (casas de malla antiplulgon), para procesos de
multiplicacin masiva de yemas.
A. B. C.
D. E. F.
15
Varetas porta-yemas sanas listas para ser injertadas en patrones desarrollados previamente seleccionados de acuerdo a la
variedad a injertar. Plantas injertadas y desarrolladas sobre patrones en procesos posteriores a la injertacin a partir de material
sano. Fase final del proceso de limpieza fitosanitaria el cual debe ser sometido al chequeo de las autoridades sanitarias para
garantizar el proceso de sanidad del material y proceder a la entrega de material certificado a viveristas y citricultores en general.
Figura 12. Varetas porta-yemas sanas procedentes de programas de certificacin de plntulas de ctricos, tal es el caso de pases como:
Espaa, Brasil, Sudfrica, Estados Unidos, Uruguay, Argentina, Cuba y Mxico, que han sido referentes para procesos de certificacin en
pases como Colombia.
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Plano de distribucin de casas de malla antipulgn con rboles madre sanos para multiplicacin masiva de yemas y
plntulas con destino al sector viverista y citricultores en general. El C.I. Palmira dispone de esta infraestructura para iniciar el
proceso de escalamiento tecnolgico con material de propagacin sano a escala comercial.
Figura 13. El esquema detalla el nmero de plantas posibles de instalarse en un rea construida de 500 mtr2. En el C.I. Palmira, el modulo (A) contempla la
instalacin de los cultivares lite de citricultores provenientes del Banco de Germoplasma de Ctricos (88 plantas de las variedades comerciales de mayor
demanda de los citricultores). El modulo (B) contiene la propagacin de plntulas, en el suelo directamente (1.404 plntulas madre donadoras de yemas), para
producir yemas para abastecer el modulo (C) que es donde se realiza la multiplicacin masiva de yemas para beneficio del sector viverista (3.375 plntulas
levantadas en mesas de 1.0x3.0 metros).
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Figura 14. Esquema final que integra la produccin de yemas sanas a partir del B.G. de ctricos (casa malla antipulgn matriz centro),
alimentando bloques de fundacin (variedades elite izquierda), bloque de propagacin (incremento masivo de plntulas), bloque de multiplicacin
(incremento masivo de yemas). Paralelo a este proceso, el proceso se apoya con laboratorios y pruebas biolgicas (derecha), como tambin
viveristas y semilla certificada que alimenta todo el proceso de multiplicacin de plntulas y yemas sanas.
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El programa de certificacin de plntulas de ctricos libres de enfermedades virales para
Colombia, se da inicio con la limpieza o sanidad de las variedades lite y la introduccin al Banco
de Germoplasma de Ctricos (es un procedimiento genrico, no solo de Colombia).
El programa se ha fortalecido en los ltimos aos con el apoyo de entidades gubernamentales
(Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, COLCIENCIAS), en aspectos
tecnolgicos (tcnicas, diagnsticos, propagacin masiva de yemas).
Con la implementacin y puesta a punto de tcnicas biotecnolgicas como la microinjertacin In-
Vitro de pices meristemticos de ctricos y la posterior comprobacin serolgica, se ha
avanzado significativamente en la sanidad del Bancos de Germoplasma y en especial de los
materiales lite de agricultores.
CORPOICA en el C.I. Palmira, ha estructurado procesos en el tema de limpieza fitosanitaria
mediante una mayor capacidad instalada en infraestructura, equipos y personal capacitado, que
permiten dar respuesta a la demanda de material sano de plantas madre por parte de viveristas.
Colombia cuenta con material bsico y comercial libre de enfermedades virales, (virus de la
Tristeza de los Ctricos), y prximamente para el virus de la Psorosis y el viroide de la Exocortis.
El programa ha contemplado la capacitacin y transferencia de tecnologa a viveros del pas,
quienes se han apoyado en las experiencias de CORPOICA en la produccin de yemas sanas, lo
cual se convierte en un impacto positivo para el futuro de la citricultura colombiana.
Conclusiones
Agradecimientos
Al Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnologa Francisco Jos de Caldas
COLCIENCIAS, quien financi el Proyecto: Fortalecimiento del Centro de Investigacin Palmira como
un centro de referencia nacional para la produccin de plntulas certificadas y el mejoramiento de la
productividad de ctricos en Colombia, y del cual hace parte esta cartilla.
A los investigadores de diferentes pases que han desarrollado experiencias exitosas en programas de
Certificacin de Plntulas de Ctricos, compartiendo sus conocimientos para enriquecer este proceso,
investigadores agrupados en la Red Interamericana de Ctricos RIAC.
A los viveristas: Profrutales Ltda., Granja Venecia y El Sesteo del Comit de Cafeteros del Valle,
Jaibana, Vivero Oriente, El Paraso, Frutos Tropicales, Hawai, Cicolsa, y todos aquellos quienes de
una u otra forma han apoyado esta iniciativa.
BOLETIN DIVULGATIVO No. 26
Cdigo No. : 2.7.26.05.32.06
Revisin: Juan Jaramillo V, Coordinador de Investigacin Corpoica C.I. Palmira.
Edicin y Arte: Jesan Gmez S. Progr. Transferencia de Tecnologa. C.I. Palmira.
Fotografa: lvaro Caicedo A. Corpoica - Palmira.
Impresin: Editorial Litotamara Ltda.
Tiraje: 1.000 ejemplares.