Professional Documents
Culture Documents
Esta cantidad de medio se le adicionara, a cada uno de los das, cuyas muestras de microalgas
provenga al 5% de glicerol. Estos respectivo clculos se empelarn a cada una de las
concentraciones restantes.
Para un volumen de 0.90ml
Para un volumen de 0.85ml
Para un volumen de 0.80ml
Para un volumen de 0.75ml
Para un volumen de 0.70ml
5
METODOLOGIA.
Ubicacin.
Este proyecto de investigacin preliminar fue desarrollado en la Universidad del Atlntico, en la
ciudad de Puerto Colombia -Colombia.
Materiales y reactivos.
Equipos
Cmara de Neubauer
Balanza analtica
Esterilizador
Materiales
Estante metlico
Tubos de ensayo
Tubos eppendorf
Dos lmparas de luz blanca
Pipetas
Erlenmeyers
Vidrio reloj
Frascos pequeos para toma de muestras
Mangueras
Beakers
Papel aluminio
Reactivos
NaNO3
K2HPO4
MgSO4*7H2O
CaCl2*2H2O
HNO3
Citrato Frrico de Amonio
EDTA
Na2CO3
Agua destilada
H3BO3
6
MnCl2* 4H2O
ZnSO4* 7H2O
Na2MoO4* 2H2O
Cu2SO4* 5H2O
Co(NO3)2* 6H2O
NaOH
Nota: todos los materiales fueron esterilizados antes de ser usados
CRIOGENIZACIN
Sacar muestras del cultivo de Spirulina Platensises con una pipeta esterilizada y llenar los tubos
eppendorf con los diferentes porcentajes de muestra que se van a utilizar, ya sean 95%, 90%, 85%,
80%, 75% y 70% v/v y posteriormente aadirle los diferentes porcentajes de glicerol a cada tubo
hasta completar el 100%. Todo esto se debe hacer en un medio estril, el cual se crea por medio del
calor que genera un mechero encendido. Luego estas muestras se guardarn en diferentes bolsas,
clasificndolas de acuerdo al porcentaje de muestra de cultivo y se guardarn en un congelador.
DESCONGELAMIENTO
Para esta parte del proceso, se sacan las muestras del congelador que corresponden a los 15, 30, 45,
60,75 y 90 das segn la fecha que corresponda y se descongelan las muestras en agua calentada a
37C, luego se centrifugan las muestras para retirarles el crioprotector y el cultivo de algas se
agrega al medio ptimo para su crecimiento en tubos de ensayo. El cultivo estar expuesto a 12
horas de luz y otras doce sin ella. Se har el conteo de las algas utilizando una cmara de Neubauber
el da que se sacan del congelador y se colocan en el medio y posteriormente se har conteo una
semana despus con el fin de saber si las algas han sobrevivido.
PREPARACIN DEL MEDIO BG-11
Para el cultivo, posterior a la criogenizacin, se trabajar con el medio estndar BG11. Los
reactivos necesarios y la cantidad requerida para su preparacin se presentan en la tabla
N COMPONENTE CANTIDAD
1 NaNO3 1.5 g
2 K2HPO4 0,04 g
3 MgSO47H2O 0,075 g
4 CaCl2 2H2O 0,036 g
5 HNO3 0,006 g
6 Citrato Frrico de Amonio 0,006 g
7 EDTA 0,001 g
8 Na2CO3 0,02 g
7
9 Mezcla de trazas de metales 1 (mL)
10 Agua destilada 1 (L)
Tabla 2: Cantidad de cada reactivo para la preparacin del cultivo
La mezcla de trazas de metales se prepara utilizando los componentes mostrados en la tabla 3.
N COMPONENTE CANTIDAD
1 H3BO3 2,86 g
2 MnCl2 4H2O 1,81 g
3 ZnSO4 7H2O 0,222 g
4 Na2MoO4 2H2O 0,39 g
5 Cu2SO4 5H2O 0,079 g
6 Co(NO3)2 6H2O 0,049 g
7 Agua destilada 1 (L)
Tabla 3: trazas de metales para el medio BG-11
El procedimiento para la preparacin del medio BG11 se realizar de la siguiente manera:
1. Se prepara la solucin de mezcla de trazas de metales en un 1 L de agua destilada.
2. Se prepara el medio de cultivo BG11 en 600 mL de agua destilada y se agrega 1ml de la
solucin de mezcla de trazas de metales.
3. El volumen obtenido de medio de cultivo se afora hasta completar 1L con agua destilada.
4. Se esteriliza el medio y se refrigera.
DETERMINACIN TOTAL DEL VOLUMEN DE MICROALGA NECESARIO PARA
REALIZAR TODOS LOS EXPERIMENTOS
Para la criogenizacin en glicerol de la SpirulinaPlatensis, se trabajaran diferente concentracin de
glicerol la cuales sera al 5,10,15,20,25,30% de glicerol, tambin se tomara un intervalo de das que
sera de 15,30,45,60,75,90 das, se realizarn dos muestras por cada da y cada concentracin para
un total de 60 muestras (incluidas las repeticiones). Como se muestra en el diagrama que se
presenta a continuacin:
Da No.\ concentracin de
glicerol
5% 10% 20% 25% 30%
15 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
30 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
45 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
60 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
8
75 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
90 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
Tabla 4: Cantidad de muestras a criogenizar con sus respectivos das de congelacin y concentracin de glicerol
Por lo cual la cantidad de microalga que necesitaremos se estimar de la siguiente manera: para
concentracin necesitamos dos muestras, para cada uno de los das. Entonces supondremos
volmenes aditivos para facilidad del clculo preliminar.
)
Donde:
: Sera el volumen al cual llenaremos los tubos que posteriormente congelaremos
Para una concentracin de 5%
( )
Concentracin al 10%
( )
Concentracin al 15%
( )
Concentracin al 20%
( )
Concentracin al 25%
( )
Concentracin al 30%
( )
Total volumen cultivo: 59.4mL aproximadamente
BIBLIOGRAFA
[1] Carlos Nio Martnez, David Londoo Martnez, Evaluacin del crecimiento de
Spirulinaplantesis sobre un efluente de suero de quesera. Universidad de la sabana, pagina 22,
2006, http://intellectum.unisabana.edu.co:8080/jspui/bitstream/10818/5088/1/130003.pdf
9
[2] Cryopreservation of Cyanobacteria By Jerry J. Brand, Botany Dept., Univ. of Texas at Austin
Consultado el 31/08/14. Disponible en: http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/protocols/cryo.html
[3] CRYOPRESERVATION OF Plasmodium (Novyella) juxtanucleare WITH GLYCEROL. By
Aulo C. A. Souza, Carina Elisei, Cleber O. Soares y Carlos L. Massard. Citado el 31/08/14.
Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-07202000000100003
[4] Caracterizacin molculas de cepas nativas colombianas de Azotobacter spp. Mediante el
anlisis de restriccin del DNA Ribosomal 16s. Citado el 31/08/14. Disponible en:
http://hermes.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis14.pdf