ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE SALUD PBLICA

ESCUELA DE MEDICINA
CARRERA MEDICINA

GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA # 7 PRUEBA DE SENSIBILIDAD BACTERIANA

1. DATOS GENERALES
NOMBRE: CODIGO:
Dipaola Pino V. 26283
FECHA DE REALIZACION: FECHA DE ENTREGA:
30 de junio de 2014 6 de junio de 2014

2. INTRODUCCION
Las pruebas de sensibilidad bacteriana se llevan a cabo mediante el antibiograma
que sirve para medir la sensibilidad de una cepa bacteriana a uno o varios
antibiticos. El estudio de la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos
parar la eficacia in vivo de un tratamiento antibitico. Tambin es importante para
realizar estudios sobre la evolucin de las resistencias bacterianas que permite
revisar los protocolos de la antibioticoterapia emprica.
Un agente antimicrobiano es cualquier sustancia que acta contra el
microorganismo. Antibitico es una sustancia derivada de organismos vivientes que
es capaz de inhibir varios procesos de vida de los microorganismos. Pueden ser
obtenidos de bacterias, hongos, algas, lquenes y otras plantas
Para determinar la sensibilidad de un microorganismo a un antibitico se puede
utilizar diversas pruebas, las ms empleadas son el mtodo de disco y el de dilucin
seriadas en caldo.
3. OBJETIVO GENERAL
Demostrar la sensibilidad de las bacterias frente a un antibitico determinado
3.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Observar la bacteria obtenida en el microscopio
Determinar
4. METODOLOGIA
Se utilizara un cultivo puro de entero bacterias, realizando un antibiograma por el
mtodo de kirbybauer o difusin en agar, el que se realizara la siembra de las
bacterias seleccionadas y se probaran con diferentes discos de antibiticos.
Este mtodo incorpora el antimicrobiano a discos de papel de filtro. Su introduccin
permiti agilizar la determinacin de la sensibilidad de las cepas bacterianas frente
a un nmero importante de antimicrobianos de forma simultnea. El empleo de los
discos de papel de filtro para las pruebas de sensibilidad esta estandarizado y se
correlaciona con la CMis. Durante muchos aos, y a pesar de ser una tcnica
puramente cualitativa, el mtodo de difusin por disco, en funcin sobre todo de su
comodidad, economa, y fiabilidad, ha sido uno de los ms utilizados en los
laboratorios
5. MATERIALES Y EQUIPOS
- Hisopos
- Cajas Petri con agar Mullerhinton
- Discos de antibiticos
- Pinza metalica
- Mecheros
- Incubadora
- Palillos
- Agua destilada o suero fisiolgico estriles
- Lpiz graso
- Cajas Petri con cultivo bacteriano (enterobacterias)
6. MARCO TEORICO
Las pruebas de sensibilidad bacteriana se llevan a cabo mediante el antibiograma
que sirve para medir la sensibilidad de una cepa bacteriana a uno o varios
antibiticos. El estudio de la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos
para la eficacia in vivo de un tratamiento antibitico. Tambin es importante para
realizar estudios sobre la evolucin de las resistencias bacterianas que permite
revisar los protocolos de la antibioticoterapia emprica.(6)
Conceptos:
La determinacin de la Concentracin Mnima Inhibidora (CMI) es la medida de
la sensibilidad de una bacteria a un antibitico. Es la mnima cantidad de
Antimicrobiano que es capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en
unas condiciones normalizadas. Es el mtodo habitual utilizado en los laboratorios
de Microbiologa Clnica. Para llevarlo a cabo es necesario utilizar cepas control (de
referencia) con el fin de que los resultados sean reproducibles y comparables. Este
mtodo nos ofrece informacin sobre la sensibilidad de las bacterias S (sensible), I
(intermedia) y R (resistente).
o Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de
un tratamiento a la dosis habitual.
o Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No
es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de
tratamiento.
o Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir
efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o
aumento de la posologa).
Existen diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de forma
rutinaria, y de manera semicuantitativa, las CIM (mtodos manuales y mtodos
automatizados o semiautomatizados). Se puede realizar mediante:

Difusin en agar: Disco placa y E test
Dilucin: Medio slido y Medio lquido (micro/macrodilucin)
Mecanizados y Automatizados
La Concentracin Mnima Bactericida (CMB) es la mnima cantidad de antibitico
capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en condiciones
estandarizadas.
Mtodos
En un primer momento, el mtodo estndar utilizado para las pruebas in vitro fue el
de dilucin en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo. Actualmente
existen varios mtodos que se utilizan para llevar a cabo los estudios de
sensibilidad a los antibiticos y todos ellos se realizan bajo condiciones
entandarizadas por organismos internacionales.
Dilucin en caldo
Se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente
diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que mantiene el desarrollo del
microorganismo. Los antibiticos se preparan en "soluciones madre" concentradas y
luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento.
Despus de un periodo de incubacin adecuada se observa la turbidez de los tubos
que indica el desarrollo bacteriano. El microorganismo crecer en el tubo control y
en todos los que no contengan suficiente antibitico que sea capaz de inhibir su
desarrollo. La concentracin de antibitico que presente ausencia de crecimiento es
la Concentracin Mnima Inhibitoria.
Para medir la CMB se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea
el mismo sistema de dilucin en caldo que para medir la sensibilidad.
A partir de la CMI, se siembra una cantidad conocida de inculo de cada uno de los
tubos de caldo que no tienen turbidez en placas de agar, y el nmero de colonias que
crece en estos subcultivos, despus de incubar durante la noche, se compara con el
nmero de UFC/ml del cultivo original. La mnima concentracin del agente
antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inculo original se
denomina concentracin bactericida mnima (CBM).
Difusin en agar
Este mtodo incorpora el antimicrobiano a discos de papel de filtro. Su
introduccin permiti agilizar la determinacin de la sensibilidad de las cepas
bacterianas frente a un nmero importante de antimicrobianos de forma
simultnea. El empleo de los discos de papel de filtro para las pruebas de
sensibilidad est estandarizado y se correlaciona con las CMIs. Durante muchos
aos, y a pesar de ser una tcnica puramente cualitativa, el mtodo de difusin por
disco (o mtodo Kirby-Bauer), en funcin sobre todo de su comodidad, economa y
fiabilidad, ha sido uno de los ms utilizados en los laboratorios.
El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su
superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibiticos. Se incuban
las placas durante 16-24 horas y se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el
dimetro de la zona de inhibicin que se forma alrededor de cada disco y se
compara con las referencias oportunas publicadas por la NCCLS. De esta manera se
sabe si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente a cada uno de los
antibiticos.


Mtodo de E-test
Es un mtodo ms reciente, es una combinacin de caractersticas de los mtodos
anteriores. Se trata de una tcnica cuantitativa en placa que permite obtener una
lectura directa de CMI en g/ml, ya que se emplean tiras plsticas impregnadas en
concentraciones crecientes de antibitico.
El microorganismo se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del
antibitico (o antibiticos) a ensayar. Se incuba durante 16-24 horas a 35C y se
valora la zona de inhibicin alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente
observando el punto ms bajo de la elipse que presente el crecimiento.

Mtodos automatizados
La mayora de estos mtodos utilizan sistemas de micro dilucin en medio lquido
sobre micro placas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en
los diferentes pocillos por medio de un autoanalizado (mediciones por turbidez o
fluorescencia). Anteriormente se haca por lectura ptica del tcnico a travs de un
espejo invertido.
Son sistemas fciles y rpidos, generalmente automatizada o semiautomatizada.
Son mtodos ideales para grandes volmenes de trabajo. Una de sus grandes
limitaciones es que slo ofrecen garanta para investigar microorganismos de
crecimiento rpido y que no tengan requerimientos especiales.(6)


7. PROCEDIMIENTO
1. El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar
mullerhintos con hisopo, tomando una colonia de la bacteria seleccionada y
realizando varias estriaciones seguidas en 3 planos, de lado a lado del agar sin dejar
espacios libres.
2. Sobre su superficie del agar, con una pinza estril se disponen los discos
correspondientes a varios antibiticos, colocar los discos separados y no ponerlos
alado del borde de la caja



3. Se incuban las placas durante 16 a 24 horas y se estudia el crecimiento de ellas.
4. se valora el dimetro de la zona de inhibicin que se forma alrededor de cada
disco y se compara con el cuadro de referencias. de esta manera se sabe si el
microorganismo es sensible, intermedio o resistente a cada uno de los antibiticos
(8)
DISCOS DE ANTIBIOTICOS USADOS PARA GERMENES GRAM POSITIVOS Y
GRAM NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE AMBULATORIO
GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOS
Oxacilina(ox) Ampicilina(am)
Eritromicina(e) Cefuroxima(cxm)
Clindamicina(cc) Ampicilina + sulbactam(sam)
Cefoxitim(fox) Gentamicina(gm)
Sulfas(sxt) Norfloxacina(nor)
Ciprofloxacina(cip) Nitrofurantoina(fm)
Vancomicina(va) Sulfas(sxt)



8. OBSERVACIONES
Primero se ingresa al laboratorio con las normas de bioseguridad
correspondiente
El docente explica tericamente la clase para que logremos la practica
El docente habla sobre las pruebas de sensibilidad bacteriana
En conjunto realizamos la prctica y podemos observar que la urea tomo un
color rosado en vez del color amarillo.
Se realiza trabajo en equipo para observar en el microscopio.
Se termina el laboratorio con responsabilidad y dejando todo limpio

9. CONCLUSIONES
Se concluy que para la observacin de las bacterias en el microscopio es
importante saber enfocar la placa y que la tincin este correctamente
realizada
Las medidas de bioseguridad son muy importantes a la hora de tener
contacto con medios de cultivos
Se concluy que es importante saber manejar los materiales y tener
conocimiento para realizar el angiograma
Se concluy que trabajar en equipo hace que sea ms rpido el trabajo
Se concluy que la contaminacin puede influir en nuestros medios de cultivo

10. RECOMENDACIONES
Tener las medidas de bioseguridad adecuadas , tomar la prctica de la
manera ms responsable y tener en cuenta que se est trabajando con
bacterias
Aplicar con cuidado las tcnicas de inoculacin de cultivos para tener un
resultado excelente



11. RESULTADOS

1. MUESTRA DE ED
Gram positivo
Diplococo
Bioqumicas: Catalasa positiva, ureasa negativa SH
2
negativo, movilidad positiva
Nombre de la bacteria:
Antibiograma:
Agar sangre Agar macconkey
Nitrofurantoina(fm) 28mm Nitrofurantoina(fm) 20mm
Vancomisina (va) 24mm Vancomisina (va) 23mm
Cfl 30mm Cfl 8mm
Ampicilina + sulbactam(sam) 10mm
Cefuroxima (cxm) 16mm

2. MUESTRA DE DS
Gram negativo
Bacilo
Bioqumicas: Catalasa negativo
Nombre de la bacteria: echerichiacoli
Antibiograma:
Agar sangre Agar macconkey
Nitrofurantoina(fm) 36 mm No hubo crecimiento
Cfl 34mm No hubo crecimiento
Cefuroxima (cxm) 38mm No hubo crecimiento
Ampicilina + sulbactam(sam) 6mm No hubo crecimiento



3. MUESTRA DE CE

Gram negativo
Bacilos
Bioqumicas: catalasa negativo
Nombre de la bacteria: shigella
Antibiograma:
Agar sangre Agar macconkey
Nitrofurantoina(fm) 28mm Cfl 6mm
Cfl 6mm Cefuroxima (cxm) 19mm
Cefuroxima (cxm) 18mm Ampicilina + sulbactam(sam) 16mm
Ampicilina + sulbactam(sam) 10mm Nitrofurantoina(fm) 28mm

Se realizara un informe con los resultados obtenidos, de acuerdo al formato
utilizado y se contestara el siguiente cuestionario

12. CUESTIONARIO

Que es la concentracin inhibitoria mnima?
Es la medida de la sensibilidad de una bacteria a un antibitico. Es la mnima
cantidad de Antimicrobiano que es capaz de impedir el crecimiento de un
microorganismo en unas condiciones normalizadas. Es el mtodo habitual utilizado
en los laboratorios de Microbiologa Clnica. Para llevarlo a cabo es necesario
utilizar cepas control (de referencia) con el fin de que los resultados sean
reproducibles y comparables. Este mtodo nos ofrece informacin sobre la
sensibilidad de las bacterias S (sensible), I (intermedia) y R (resistente).
o Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de
un tratamiento a la dosis habitual.
o Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No
es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de
tratamiento.
o Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir
efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o
aumento de la posologa).(1)
Que es la concentracin bacteriana mnima?
Es la mnima cantidad de antibitico capaz de destruir el 99.9 % de una muestra
inoculada en condiciones estandarizadas(2)
Que significa sensibilidad y resistencia a un antibitico?
Sensibilidad significa que los microorganismos son inhibidos con concentraciones de
las sustancias antimicrobianas que pueden lograr en trminos clnicos dosis
generalmente recomendadas
Resistencia significa que el organismo no se inhibe por las concentraciones
clnicamente posibles de un agente antimicrobiano (3)
Que caractersticas debe de tener un medio de cultivo en el que se realizan
pruebas de sensibilidad
Debe ser de un medio enriquecido y especializado como mullerhinton 2 agar + 5 %
de sangre de cordero (4)
Por qu esta rosado el agar urea y luego cambia amarillo?
Porque hubo contaminacin al momento de colocar en el tubo de ensayo y a parte no
se la realizo a tiempo.(7)



13. BIBLIOGRAFIA

1. Toodsanford y Davidshon, el laboratorio en el diagnostico clnico, Ed
MARBAN 20 eD, Espaa, 2005.
2. Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud , OPS, Ed.
Panamericana
3. Alvarez, M. Victori, Boquet, Ernesto y colaboradores, Manual de tcnicas en
microbiologa clnica
4. . Benetucci JA. (2001). Sida y enfermedades asociadas: Diagnostico, Clnica y
Tratamiento. Editorial CARCOS. 2a edicin. Argentina. Cp. 5. pp. 305-
310.
5. . Da Silva C, Porto E y Vaccari M. (1998). Gua para identicacao de fungus,
Actinomicetos. Algas de inters medico. Editorial SAVIER. Sao Paulo, Brasil.
pp 110.
6. Microbiologia general y bucal, informes de
laboratorio,http://campus.usal.es/~micromed/Practicas_odontologia/unidade
s/labv/LabMicro/Antibiograma.html
7. Dictar O, Maiolo E, and Veron T. (2000). Mycoses in the transplanted
patient. Medical Micology. 38: 251-258.
8. Stuart, C; Stratum, E; Rustigian, R. (1945). Further Studies on Urease
Production by Proteus pand related organims. Journal Bacteriology. 49: 437-
444.




14. ANEXOS

Colocacin por parte del compaero Carlos Estrada

Obtencion de UFC en agar sangre pero no en macConkey

Urea y sim

Es necesario que el aza tome un color rojo para que no haya contaminacin

Placas listas para observar en el microscopio

Observamos bacilos en la placa 3 de agar sangre

Placa 1 con diplococos

Placa 2 en agar sangre

Placa 2 en agar macConkey