PRCTICA 1: BOMBEO DE PROTONES POR LAS LEVADURAS

Jair Cern 1139872

JosLpez Candelo1245560
JessAntonio Acosta
Universidad del Valle, Santiago de Cali Entrega: septiembre 30 del 2014


RESUMEN
El bombeo de protones es uno de los mecanismos utilizados por diferentes
organismos, el cual, a partir de gradientes de concentracin, permite el ingreso de
glucosa, para la produccin de energa (ATP), para este caso el modelo, con el que se
pretendi analizar la relacin que existe entre el bombeo de protones y la produccin
de energa, fue la levadura (Saccharomycescerevisiae). Para hallar esta relacin, se
someti a la levadura, en tres soluciones diferentes, la primera, levadura y glucosa,
segunda levadura glucosa desacoplante (DNP) y por ultimolevadura glucosa y inhibidor
( azida de sodio), en donde la solucin , de solo sustrato seria usada como control para
detectar cmo se desempea la levadura en condiciones normales, y asi observar,
como afecta la presencia de un inhibidor y un desacoplan en la generacin del
gradiente y la formacin de energa (ATP). Para esto se registro el pH en las tres
soluciones preparadas en un intervalo de tiempo, aadiendo glucosa, para la solucin
levadura y glucosa, el pH inicial, registrado antes de adicionar glucosa fuepH= 4.31 y la
medida final de pH= 3.58 y su pH = 0.73 y cuyo valor[H+][2.14*10^-4], para la
solucin levadura, glucosa y (DNP), el pH inicial fue de pH = 4.43 y su pH final fue de
pH= 4.19, con un disenso de pH = 0.24 con su respectiva [H+] liberados en el
descendi cuyo valor es de [H+] = [2.74*10`-5]y por ultimo en el caso de la solucin de
levadura, azida de sodio el pH inicial ( antes de aadir la glucosa) fue de pH = 5.00 y su
pH final de pH = 4.66 con un descenso de pH= 0.34 cuya [H+] = [1.18+10^-5]. Estos
resultados se compararon donde se hallo que el gradiente [H+] es vital, para el ingreso
del sustrato (glucosa) para la produccin de energa (ATP) y en donde se encontr una
mayor proddcion de enrgia fue en glucosa seguida por (DNP) y por ultimo azida de
sodio.
Palabras clave: glucosas (DNP), (Azida de sodio), trasporte de electrones, gradiente de
concentracin,ATPasa, ATPsintasa.




INTRODUCCION
Las levaduras son organismos simples,pertenecientes al grupo de hongos unicelulares,
hetertrofos, capaces de desarrollarse en condiciones anaerbicas y aerbicas, segn
sea la cantidad de oxigeno, pueden realizar oxidacin de azucares, llevndolos hasta
agua y CO2 para generar energa, mediante enzimas ubicadas tanto en la membrana
plasmtica y la membrana mitocondrial, este mecanismo es denominado bombeo de
protones, cuya funcin primordial es generar un transporte de protones H+ con el fin
de generar un gradiente de concentracin, denominados gradientes electroqumicos a
travs de un transporte activo a partir de la hidrlisis de ATP, lo cual va muy ligado a
procesos de transporte de nutrientes, iones y metabolitos, modificando el pH al
exterior de la clula.(Salvik1994)

La levadura fue uno de los primeros organismos, que se usaron para, el estudio de la
formacin del gradiente, debido a su complejidad simple,A nivel estructural las
levaduras poseen en su membrana plasmtica una protena que es una bomba ATPasa
de H+ que consume casi el 25% del ATP que produce la clula. Esta bomba se copla por
la hidrlisis del ATP por un bombeo de protones hacia a fuera de la clula, al igual que
otro tipo de bombas de membrana esta inhibe concentraciones de un producto o una
sustancia de un lada y lo pasa al otro. Esto produce un gradiente electroqumico que
genera un trasporte de nutrientes al interior celular.( Karp, Gerald)

Adems de la membrana plasmtica, la cual posee un papel muy importante, debido a
que est en contacto con el medio externo y es la que se encarga de permitir paso de
sustancias al interior o la contencin de las mismas para su procesamiento en la
mitocondria, la membrana plasmtica mitocondrial las levaduras al igual que muchos
otros organismos, poseen una bomba llamada ATPsintetasa, que es la encargada de
sintetizar ATP que al contrario de la ATPasa que con el flujo de protones rompe ATP,
este paso de H+ induce a su sntesis. A partir de esto, muchos de los cientficos
concluyeron que a que cuando hay disponibilidad de sustrato para la levadura u otro
organismo, se observara una disminucin progresiva de su concentracin en el medio
de cultivo con el tiempo y que sucedern cambios en el pH extracelular. (Fonaguera,
2007)

Los estudio apuntaban, a la manera, como un organismo generaba el gradiente de
concentracin, si bien el hallazgo de la l enzima ATPasa, la cual genera un gradiente,
que es utilizado para el ingreso de diversas sustancias de importancia metablica como
la glucosa, el co-trasporte de glucosa mediado a travs de una protena se considera
como transporte facilitado. Una vez en el interior de la clula, la glucosa es utilizada
para producir energa, necesaria para la vida misma de la clula, y tambin implicada
en mantener los gradientes. (Berg, 2008)

Se realizaron estudios, poniendo como sustrato glcidos, encontrando que juegan un
papel muy importante, en la generacinen la generacin de energa y la formacin del
gradiente, para permitir que el sustrato ingrese(el glcido) sea metabolizado a partir
de un proceso conocido como oxidacin de azcares, aqu, tiene lugar en una serie de
reacciones denominadas ciclo del cido ctrico, que es la va final comn para la
oxidacin de las molculas energticas: carbohidratos, cidos grasos y aminocidos. En
condiciones aerobias, el piruvato generado a partir de la glucosa sufre una
descarboxilacin oxidativa para dar acetil-CoA. En los eucariotas, las reacciones del
ciclo del cido ctrico transcurren en el interior de la mitocondria, en tanto que la
glicolisis tiene lugar en el citoplasma. El ciclo del cido ctrico toma electrones del
acetil-CoA y los utiliza para formar NADH y FADH
2
(transportadores de electrones), los
cuales rinden nueve molculas de ATP cuando se oxidan mediante el O
2
en la
fosforilacin oxidativa. (Montoya, H. 2008) Los electrones liberados en la reoxidacin del
NADH Y FADH2 fluyen a travs de una serie de protenas de membrana denominada
cadena de transporte de electrones, para generar un gradiente de protones a travs de
la membrana, este gradiente se puede representar como gradiente de pH ( El pH
externo es 1,4 unidades menor que el interno). (Quesada, S. 2007) Entonces estos
protones fluyen a travs de la ATP sintasa para producir ATP a partir de ADP y fosfato
inorgnico. Como es descrito, la fase final de la fosforilacion oxidativa se lleva a cabo
por medio de la ATPsintasa, un ensamblaje que sintetiza ATP y que esta propulsado
por la vuelta de flujo de protones a la matriz mitocondrial. (Berg, 2008)
Al generarse la hidrolizacin del ATP por accin de la enzima presente en este sitio, se
genera un gradiente electroqumico entre el interior y el exterior, este impulsa el
funcionamiento de la bomba generando el transporte activo de las sustancias, aunque
esto no solo depende del potencial elctrico que el proceso genera, tambin depende
de las propiedades de permeabilidad de la membrana. Este proceso (movimiento de
iones H
+
) se puede confirmar con la medicin del pH del medio extracelular despus de
agregarle una sustancia que active estos procesos, en este caso la Glucosa. (Sadava ,
2010)Estos procesos son de dependencia, ya que para que los iones H
+
se muevan
necesitan tener disponible el ATP, el cual se produce tras la oxidacin y fosforilacin de
la glucosa, este sistema de dependencia puede verse al medir los cambios de pH en el
exterior celular tras haberse tratado con ciertos agentes que inhiben o desacoplan este
ciclo en la cadena respiratoria de la mitocondria(s) presentes, limitando o cortando
definitivamente la produccin de ATP, ya sea por el desacoplamiento de la glucosa al
momento de ser oxidada, la fosforilacin del ADP o la inhibicin total de la enzima al
momento de hidrolizar el ATP .(Salvik 1994)
A partir del cambio de la concentracin de iones hidrgeno en el medio extracelular
(pH), producto de la adicin de glucosa a una suspensin de Levadura
(Saccharomycescerevisiae) se pretendi comprobar la presencia de las bombas de
protones, estableciendo la relacin entre el bombeo de protones y el transporte de
nutrientes como la glucosa en la generacin de energa metablica con la cadena
respiratoria mitocondrial. Adems de verificar el efecto o la accin de inhibidores y
desacoplantes tales como azida de sodio y 2,4-dinitrofenol respectivamente sobre el
gradiente de concentracin en H+, junto con las consecuencias, quie implica la
obstruccin del gradiente. . (Berg, 2008)
MATERIALES Y MTODOS

El mtodo experimental consisti en la preparacin de una solucin control formada
por glucosa (5mL), levadura (5mL) y agua destilada (35mL). Posteriormente, se midi,
usando un pHmetro, el pH de la solucin control en intervalos regulares de tiempo
(Tabla 1). Las mediciones realizadas del minuto 0 al 6, se realizaron con el fin de
obtener una lnea basal y utilizarla para calcular pH al final de cada prueba.
Para conocer el efecto del 2,4-dinitrofenol (DNP) en el bombeo de protones en la
levadura, se prepar una mezcla entre la suspensin de levadura (5mL), agua destilada
(35mL) y DNP (0,2mL). Luego de obtener la lnea basal del pH para esta prueba, en el
minuto 6, se agreg glucosa (5mL) y se sigui midiendo el pH en intervalos regulares
de tiempo (Tabla 1).
Por ltimo, para conocer el efecto de la azida de sodio en el bombeo de protones en la
lavadura, se realiz un procedimiento como el descrito para el DNP, cambiando los
0,2mL de DNP por 0,5mL de azida de sodio.
La siguiente formula se utiliz para calcular las concentraciones de iones H
+
en cada
una de los experimentos:

RESULTADOS

En la primera prueba, donde se adicion glucosa a la suspensin de levadura,
obtuvimos un valor de pH ms alto si se compara con las pruebas con 2,4-DNP y azida
de sodio. La primera prueba constituye un control, y las pruebas con 2,4-DNP y azida
de sodio, muestran el efecto de estos compuestos sobre el pH extracelular cuando se
adiciono glucosa (tabla 1).







Tiempo (minutos)
pH
Respuesta a la
disponibilidad
de glucosa
Efecto del
2,4-
dinitrofenol
Efecto de la
Azida de
sodio
0 4,46 4,32 4,88
3 4,34 4,38 4,93
6 4,31 4,43 5,00
11 4,10 4,44 4,78
16 3,92 4,38 4,79
21 3,82 4,34 4,80
26 3,73 4,30 4,78
31 3,69 4,28 4,73
41 3,62 4,21 4,70
51 3,58 4,19 4,66
pH
0,73 0,24 0,34

Tabla1.Cambio del pH en el medio con la adicin de glucosa y pruebas de 2,4-
dinitrofenol y Azida de sodio. Donde a partir de los 6 min en los cuales se adiciono
glucosa se calculo el pH
Con los datos registrados el la anterior tabla se puede observar la curva para cada una
de las pruebas, esta representacion nos muertra la tendencia que tiene el pH en
funcion del tiempo en minutos. Se comprueba que el efecto mas marcado fue en la
prueba control. Mientras que en las pruebas con DNP y azida de sodio las variaciones
de pH fueron mas bajas (figura 2).




Figura 1. Grfica de la relacin entre pH y el tiempo de tratamiento control de glucosa
y de 2,4-dinitrofenol y Azida de sodio.



Para calcular la concentracin de H+ que se gener en el bombeo de protones, en las
tres pruebas, se realiz mediante la frmula de pH=-log -base 10) [H+], despejando,
nos dice que: [H+] = 10^-p, para luego calcular el H: [H+ final] [H+inicial]





Tabla 3: Donde se observa una mayor efectividad de la levadura en presencia de
glucosa, seguido por el desacoplante 2.4 Dinitrofenol y por ltimo el efecto del azida
de sodio como inhibidor, indicado que ambos tienen un efecto sobre el bombeo de H+,
que repercute en la formacin de la energa, se calcul cuantas veces fue ms efectivo
con respecto al bombeo de la prueba de disponibilidad de sustrato, dando que para
2.4 dinitrofenol fue 7.8 veces ms efectivo la prueba de disponibilidad de glucosa, 18
veces ms efectivo disponibilidad de glucosa, que azida de sodio.
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60
p
H

tiempo ( en minutos)
glucosa (control)
2,4-dinitrofenol
azida de sodio
Linear (glucosa (control))
Linear (2,4-dinitrofenol)
Linear (azida de sodio)
Levadura en disponibilidad
de glucosa
Efecto del 2.4 Dinitrofenol Efecto del Azida de sodio
H = 2.14*10^-4 H= 2.74*10^10-5 H= 1.18*10^-5



Figrura 2: complicacin de H, que se obtuvieron a partir de la presencia de sustrato
(glucosa), entre las pruebas, destacndose la cantidad de protones H+ que fueron
liberados al medio externo por parte de las clulas de la levadura, para la
incorporacin de sustrato, que en este caso es glucosa, adems, se observa claramente
el efecto negativo que tiene el 2.4 Dinitrofenol y la azida de sodio sobre el bombeo de
protones H+ .

Se pretendi saber en ultima, que porcentaje inhiba la adicin de DNP y el azida de
sodio en el bombeo de protones, para ello se uso la prueba de glucosa mas levadura
como control, el clculo se hizo mediante
([ ][ ] )
[ ]
% de efecto de inhibicin
Lo cual para la prueba de DNP se obtuvo un % de inhibicin del 87%
aproximadamente y para el azida de sodio 96% de inhibicin en el bombeo de
protones a partir de la presencia de sustrato.(glucosa)
DISCCUSION
Los gradientes de concentracin, son importantes para la incorporacin de sustratos,
estos gradientes son por medio de una diferencia en la concentracin de protones
entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembranal, a esto se le conoce como
teora quimiosmotica. Este proceso es vital, para poder generar una sntesis de ATP,
dichos protones son provenientes de la cadena respiratoria, gracias a la fuerza
electromotriz de los electrones, permiten que los protones pasen de la matriz
mitocondria hacia el espacio intermembranal, de esa manera se aumentan las
0
0.00005
0.0001
0.00015
0.0002
0.00025
Levadura en
disponibilidad
de glucosa
Efecto del 2.4
Dinitrofenol
Efecto del Azida
de sodio
Concentracion de H+ en el medio
extracelular
Concentracion de H+ en el
medio extracelular
concentraciones de protones en el espacio intermembranal, y dicha diferencia
permite la incorporacin de sustrato para generar energa.
El gradiente que se crea tiene dos componentes, uno de concentracin y otro
elctrico, por lo que recibe el nombre de gradiente electroqumico. Como la
membrana interna es tan impermeable, los protones no pueden pasar simplemente a
travs de ella, deben hacerlo a travs de una protena especfica (canal), esta protena
es la subunidad F
o
de la ATP-sintasa. El acople entre el transporte de electrones y la
sntesis de ATP en la cadena respiratoria, a partir de ADP + Pi, se conoce con el nombre
de fosforilacin oxidativa. Para que sta ocurra, debe existir un gradiente
electroqumico, el cual depende del funcionamiento de la cadena respiratoria, que es
la responsable de crearlo Existen muchos agentes que pueden alterar la sntesis de ATP
asociada a la cadena respiratoria. De acuerdo con su mecanismo de accin, pueden
encontrarse desacoplantes e inhibidores como el 2,4-dinitrofenol y la azida de sodio
respectivamente.. (Berg, 2008)
En las levaduras, Saccharomycescerevisiae, al igual que en las clulas vegetales y las
bacterias, el transporte de solutos hacia el interior de la clula depende de un
gradiente electroqumico de H
+
. Este gradiente es generado por bombas de protones
presentes en la membrana plasmtica que expulsan H
+
de la clula y de ese modo
generan un gradiente, con una mayor concentracin de H
+
en el medio extracelular
que en el medio intracelular; durante este proceso la bomba de H
+
tambin crea un pH
cido en el medio que circunda la clula Glucolisis. (Berg, 2008)
Tal como se explica antes para los procesos de respiracin celular es necesario generar
un gradiente de diferencia tanto de concentracin como elctrica lo que hace posible
que molculas como la glucosa entren en una estructura tan impermeable y
especializada como lo son las membranas.
Especficamente en el proceso de entrada de glucosa a la clula se utiliza la energa
que proviene del mismo proceso de bombeo de protones, para ello deben incorporar
la glucosa en contra de su gradiente de concentracin en coordinacin con un protn
que ingresa a favor del gradiente de concentracin; para este proceso se utiliza una
protena de tiposimporte la cual coordina estos dos procesos
simultneamente.Cuando la protena emerge en su conformacin inicial posee unos
centros expuestos los cuales captan 3 protones que permiten la unin con la molcula
de glucosa. Dicha unin con la glucosa desencadena otro cambio conformacional el
cual expone los sitios de unin de la protena y el sustrato a la parte interna de la
clula. Este proceso devuelve a el equilibrio (la protena) ya que se necesita una
molcula de glucosa y un protn para restablecer la conformacin original del
transportador lo que permite que se comience de nuevo el ciclo (bombeo) (Taizet al,
2006).
El proceso de respiracin se inicia en si en el momento que la glucosa se encuentra
dentro del citoplasma de la clula en este caso de la levadura, donde de inmediato la
glucosa es oxidada por medio de la glucolisis, en donde da como resultado energtico
dos molculas de ATP, y es generado productos comocidopirvico. El cual es muy
importante ya que entra a la mitocondria por medio de transporte activo, e
inmediatamente es oxidado mediante un complejo enzimtico de piruvato
deshidrogenasa, que da como resultado a acetil-CoA, CO
2
y NADH. En donde el acetil-
CoA ingresa al ciclo de krebs y se oxida nuevamente generando CO
2
, NADH y FADH
2
en
donde los ltimos dos mencionados son agentes reductores. El NADH y el FADH
2
total
ingresan enel ciclo de la cadena respiratoria la cual se da en la mitocondria y es la
encargada de producir ATP, como paso siguiente entregan sus electrones a las
protenas transportadoras de los complejos, las cuales reciben el nombre de
citocromos; en el caso del complejo I toma el NADH y el complejo II toma el FADH
2
, lo
que causa que electrones se desplacen entre citocromos, tambin hay transporte de
protones de la matriz de la mitocondria a el espacio intermembranal a travs de la
membrana (Quesada, 2007). Los electrones se transportan hasta el aceptor final, el
cual es conocido como complejo IV. Este complejo posee cuatro citocromos, donde
cada uno posee dos tomos de Cu los cuales cumplen una funcin de captadores. Ms
especficamente los electrones entran uno a uno en el complejo a travs del
citocromo, y a su vez son captados o retenidos por los tomos de cobre y a su vez de
unen a un ncleo de hierro que est presente en un grupo hemo el cual es
perteneciente a el complejo IV. A su vez las molculas de oxgeno son atradas por el
ncleo del grupo hemo, ya que son electronegativos y esto significa que tienden a
unirse con los electrones acumulados, pero pese a esto la transferencia se da bajo
condiciones muy especiales y solo ocurre cuando hay cuatro electrones acumulados,
esto se debe a que el oxgeno busca la estabilidad y si no estn los 4 quedara
inestable. Como paso siguiente el oxgeno(despus de que ha aceptado los cuatro
electrones), se une con dos protones que provienende la matriz mitocondrial,
generando como resultado una molcula de agua (Melo &Cuamatzi, 2007). Y como se
ha mencionado anteriormente las membranas son de carcter impermeable a los
iones, los que hace que los protones que vuelven a entrar en la matriz, pasando a
travs de unas protenas que cumplen con funcin de canales de protones las cuales se
llamanATPsintetasa.la energa resultante por efecto de este proceso utiliza como
sintetizador o precursor de ATP a partir de ADP y fosfato. Este proceso se
denominafosforilacion oxidativa (Quesada, 2007).
Una vez el ATP ha sido sintetizado, es utilizada por la enzima ATPasa-P la cual esta
ubicada en la membrana plasmtica, para llevar a cabo el proceso de hidrlisis de ATP.
Pero para iniciar el proceso la protena requiere primero ser protonada, ya que su
conformacin inicial no le permite interactuar con el ATP. Para ello, la enzima toma
protone del lado interno(citoplasmtico), adquiriendo as una propiedad quinsica que
le permite tomar el -fosfato del ATP y fosforilar un sustrato especfico, que en este
caso es ella misma, haciendo un proceso de transferenciade fosfato a un residuo de
aspartato. Haciendo un compuesto llamado fosfoaspartato, el cual es obtenido a partir
de un intermediario clave en la catlisis enzimtica, ya que la ATPasa-P adquiere una
conformacin en la que libera el protn al medio extracelular comenzando de nuevo
con el proceso del ciclo de hidrlisis (Berget al., 2008)
Podemos concluir que el ciclo es de carcter monotransporte con caractersticas de
tipo electrognico, ya que involucra el movimiento en esencia de un solo protn, que
al estar en el medio extracelular genera una diferencia de cargas entre el medio intra
y extracelular usando como muro la membrana plasmtica, es decir, en esencia
mantiene un gradiente electroqumico que comprende tambin caractersticas como
la acidificacin del medio interno celularpor la presencia de cidos metablicos, y un
potencial elctrico diferente, por la liberaciones de H+ al medio externo, convirtiendo
la clula en una especie de turbina hidroelctrica que genera energa a partir de un
proceso de aprovechamiento a partir de esta diferencia y la generacin de este
gradiente electroqumico(Voet&Voet, 2004).
Durante la prueba realizada con el 2,4-dinotrofenol se observ que la mezcla
experiment un incremento del pH, por las caractersticas de la sustancia
desacoplante.El efecto del 2,4-dinitrofenol es un agente desacoplante que no genera
un gradiente de pH pero si deja que continu funcionando la cadena de transporte de
electrones (hasta el O
2
), ocasionando la inhibicin de la produccin de ATP, (Abate, J
1999)
Los agentes desacoplantes cuando se aaden a las mitocondrias, inhiben la produccin
de ATP, al mismo tiempo que permiten el transporte de e
-
a lo largo de la cadena
respiratoria hasta el O
2
(Mathews, Van Holde, & Ahern, 2002). El PK
a
del grupo OH del
DNP es tal que se encuentra normalmente disociado al pH intracelular. Pero, cuando
ingresa una molcula de DNP aproximndose a la membrana interna desde el exterior
se protona, debido al pH ms bajo presente en el espacio intermembranal. Con la
protonacin aumenta la hidrofobicidad del DNP, permitiendo que este difunda en la
membrana y la atraviese por efecto de masa. Una vez dentro de la matriz mitocondrial,
el aumento del pH hace que el OH fenlico se desprotone. De esta forma, el agente
desacoplante transporta H
+
de vuelta a la matriz, evitando el canal F
0
, y por tanto, sin
sntesis de ATP (Mathews et al., 2002). El efecto final del DNP es el de disipar el
gradiente protnico necesario para la sntesis de ATP por parte de la ATPsintasa, y por
tanto, reduciendo la cantidad de ATP disponible para la realizacin de los procesos
metablicos de la clula (como el bombeo de protones y el cotransporte de la glucosa
asociado a este)(Campbell, M. Farrell, S 2004). La propiedad desacoplante del 2,4-
dinitrofenol permite que lo iones del hidrogeno que estn impedidos por la membrana
gracias a su impermeabilidad, logren atravesarla, haciendo que se homogenice el
gradiente de concentracin, y con esto, se detenga la sntesis de ATP pero no el
transporte de electrones en la cadena respiratoria hasta el O
2
. Debido a que el 2,4-
dinitrofenol transporta protones H
+
al interior de la clula, la energa de los electrones
se disipa y no generan ATP (Abate, J 1999).
Para el caso de la prueba de azida, observando la grafica 1, el comportamiento de la
muestra que la influencia de azida de sodio es totalmente diferente a la prueba de
levadura y glucosa y levaduraDNP y glucosa, inicialmente empez cdesde un ph mayor
que, las otras dos pruebas realizadas, fenmeno que se explica porque la azida en su
forma anionica tiene un caracter bsico, lo que explica porque el pH experimental fue
mayor en comparacin con la prueba de levadura y glucosa y con la muestra con DNP.
(Melo, V 2006)

En este caso, la azidaactua como un inhibidor, por lo tanto se unen al complejo
IV(encargado de la transferencia de electrones desde el citocromo c al oxgeno) de la
cadena de transporte electrnico y bloquean el transporte electrnico, por ello estos
compuestos reducidos se acumulan antes del punto de bloqueo y compuestos
oxidados despus del bloqueo, por eso no se puede dar el bombeo de protones y no se
forma el gradiente de protones y el pH permanecer casi constante durante el tiempo,
lo que conllevara a que no se de la produccin de ATP. El mecanismo por el cual inhibe
consiste en formar un enlace covalente con el cofactor Hemo a
3,
este se da la
acumulacin de especies reducidas y oxidadas y no se produce la fuerza proton motriz
para la sntesis de ATP.

Mirando el disenso en la tabla 1 pH 0.34, con respecto al DNF, tuvo un mayor
descenso, aprocimada mente bajo 3 decimas, la pregunta radicaba en, porque sigui
bajando el pH si, en teora dice que la azida inhibe en la cadena de transporte de
electrones, un papel crucial para analizar esta caracterstica, son las cualidades
metablicas de la levadura (Saccharomycescerevisiae), la cual es que pueden
desarrollar se en medios tanto anaerbicos como aerbicos, la azida inhibe de tal
manera que el aceptor de los hidrgenos sea diferente al oxigeno, en este caso las
clulas de levadura, pueden llevar a cabo un tipo de catabolismo parcial, las
fermentaciones, donde el aceptor de los hidrgenos del poder reductor es una
molcula orgnica. (Devlin, T. 2004) En este caso, el esquema especifica la ruta
fermentativa de produccin de etanol. Durante el proceso, tambin se produce una
descarboxilacin del piruvato hasta acetaldehdo, como paso previo a la formacin de
alcohol (Nelson y Cox 2006).

Sin embargo, al comparar los resultados con el control de glucosa y levadura (Figura 2),
la cual no presenta ningn obstculo en la generacin de gradiente para la produccin
de energa, se observa que el proceso aerobico, ejercido en esas condiciones normales
es mucho ms efectivo que si se le inhibe, en el citocromo c como sucede en la prueba
con azida. Esto va muy ligado a los costos energticos, mientras que en la levadura y
glucosas se forma el gradiente de H+ de forma optima para el ingreso a la celula de
glucosa para que posteriormente sea metabolizada, los costos energticos para el caso
que las clulas de levadura utilicen la vida de la fermentacin son altos. Nelson y Cox
2006).
Esto se pudo determinar tas analizar los pH que se observan en la tabla 1, estos
fueron comparados entres para analizar cuanto fue la [H+] que fueron liberados al
medio externo en el proceso de bombeo de protones , para la prodicin de la energa
(ATP) por parte de la ATPsintasa. Para el primer caso de glucosa y levadura, se aprecia
que, en el decrecimiento del pH desde que se adiciono glucosa fue de pH=)0.73 y en
este decrecimiento de pH el [H+] (tabla 2) , la cual fue muy superior con respecto al
la prueba con azida de sodio, a pesar de que tiene un pH = 0.34 (tabla 1), se esperara
que la produccin del bombeo de H+, fuera la mitad, pero debido a que el pH inicial y
pH final mucho ms bsico que los pH inicial y final de la prueba de glucolisis y
levadura (tabla 1), el [H+] = 1.18*10^-5 (tabla 2), adems azida interfiri con el
aceptor optimo, la cual es el oxigeno, recurriendo las clulas de la levadura a una
molculaorgnica como aceptor de los hidrgenos lo que incide de manera negativa
en el bombeo, al compararlas, la prueba de levadura y glucolisis bombeo 18 veces ms
protones de H+ liberados al medio externo, que las levaduras tratadas con azida,
debido a que En esas condiciones, el NADH+H
+
no puede ser utilizado por la clula para
transformarlo en ATP, sino que su funcin celular consiste simplemente en recibir los
protones y los electrones desprendidos en otras reacciones celulares. (Lodish, H 2005)
Una vez conseguido esto, su papel se agota, y lo que la clula necesita es regenerar el
NAD
+
, cuya sntesis es costosa, para seguir realizando su metabolismo. (Nelson y Cox
2006).
Comparando los resultados obtenidos para la prueba de DNP y levadura con glucosa ,
con la prueba control de levadura y glucosa(Figura 2), se observo un pH menor que
el de la prueba de levadura y glucosa (tabla 1) con una [H+] ) 2.74*10^-5 (tabla 2), el
bombeo de H+ fue superior en 7.8 veces ms efectivo cuando solo hay presencia de
glucosa y levadura (firgura 2), debido a que en DNP acta es a nivel de la produccin
del ATP en la atpsintasa mitocondrial debido a que la accin de DNP, produce que la
fuerza proton-motriz que se establece en la membrana mitocondrial interna, se disipe
continuamente, causando que la energa no se forme en la molcula de ATP si no se
libera en forma de calor, y como consecuencia hay disminucin en el gradiente.(Nelson
y Cox 2006).
Concluimos que el efecto del inhibidor que ataque la cadena de transporte de
electrones, como en el caso de la azida de sodio, repercute, en gran medida en el
bombeo de protones de H+, que si no se afecta la cadena de transporte de electrones,
caso que ocurri con el DNP pero de igual forma ambos resultados son devastadores
en las clulas de levadura, pues no permite generar un gradiente optimo para la
generacin de energa (ATP), situacin que se comprueba en los % de inhibicin
obtenidos con 87% para DNP y 96% aproximadamente para azida de sodio.
Concluimos que las clulas de la levadura cuando no hay disponibilidad de oxigeno,
estas recurren al proceso de fermentacin, pero no es tan efectivo, el bombeo de H+
para la creacin de un gradiente que permita crear energa.
El 2,4-DNP afecta el bombeo de protones realizado por la levadura, hecho que se
evidencia por una menor reduccin del pH extracelular (pH) comparado con el
control. Se puede concluir que al influir en el bombeo de protones, el DNP reduce la
capacidad de la clula para transportar glucosa.
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