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INDICE
OBJETIVOGENERAL..pag
OBJETIVOS ESPECIFICOS....pag
FUNDAMENTO TEORICO.pag
CONDICIONES NECESARIAS PARA LLEVAR A CABO LA FERMENTACION..pag
BIOLOGA DE LAS FERMENTACIONES. .pag
FASES EN LA FERMENTACINpag
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LA LEVADURA.pag
REQUERIMIENTOSpag
COMPOSICIN DEL EXTRACTO DE LEVADURA
PRODUCIDO MEDIANTE AUTOLISIS..pag
VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICApag
TEMPERATURApag
PH .pag
AJUSTE DEL PH pag
AIREACIN..pag
INHIBIDORES .pag
CONCENTRACIN INICIAL DE AZCARES pag
MATERIALES Y METODOS .pag
MATERILAES Y REACTIVOS ..pag
PROCEDIMIENTO PARA LA FERMENTACION .pag
REACTIVOS pag
MATERIALES ..pag
METODO pag
DETERMINACIN DEL TTULO DEL LICOR DE FEHLING ..pag
DETERMINACIN DE AZCAR REDUCTOR DE LA MUESTRA .pag
MATERIALES .pag


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REACTIVOS ..pag
PROCEDIMIENTO DESTILACIN ..pag
PRESENTACION DE RESULTADOS .pag
RESULTADOS DE LA FERMENTACIN ..pag
CARACTERSTICAS D EL SUTRATO .pag
NUTRIENTES ADICIONADOS .pag
TITULACION PARA DETERMINAR AZUCARES REDUCTORES ..pag






















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FERMENTACION ALCOHOLICA A PH REGULADO Y
TEMPERATURA CONSTANTE USANDO COMO MATERIA PRIMA
EL MELON

1. OBJETIVO GENERAL

- Evaluar la fermentacin alcohlica a ph regulado y a temperatura
constante.

2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Determinar mediante fermentacin alcohlica los parmetros que rigen
su proceso.
- Determinar la cantidad y concentracin necesaria para regular su Ph.
-Determinar y regular la densidad adecuada para llevar a cabo la
fermentacin.
- Determinar la cantidad de nutrientes ( levadura, urea, etc ) para llevar
a cabo la fermentacin.
-Determinacin de los azucares reductores.

3. FUNDAMENTO TEORICO

CONDICIONES NECESARIAS PARA LLEVAR A CABO LA FERMENTACION
La fermentacin alcohlica , es un proceso biolgico de fermentacin en plena
ausencia de aire (oxgeno - O2), originado por la actividad de algunos
microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general
azcares: como pueden ser por ejemplo
la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el
almidn, etc.) para obtener como
productos finales: un alcohol en forma
de etanol , dixido de carbono (CO2) en
forma de gas y unas molculas de ATP
que consumen los propios
microorganismos en su metabolismo
celular energtico anaerbico. El etanol
resultante se emplea en la elaboracin
de algunas bebidas alcohlicas, tales
como el vino, la cerveza, la sidra, el
PRACTICA
N1


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cava, etc.
La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa
anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno
para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para
sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la
fermentacin. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son
microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran
medida al sabor de los productos fermentados
.
Una de las principales
caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes
completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por
esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico.
BIOLOGA DE LAS FERMENTACIONES.
Aproximadamente el 96% de la produccin del etanol mediante fermentacin a
nivel industrial se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae. El
etanol se produce en la ruta de gluclisis, especficamente en la va anaerbica, en
la que el piruvato producido se convierte en acetaldehdo y etanol. La reaccin
global es la siguiente:


El rendimiento terico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49
gramos de CO . Aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en biomasa
y el rendimiento en etanol y CO alcanzan el 90% del valor terico. El ATP formado
se utiliza para las necesidades energticas de la clula.
FASES EN LA FERMENTACIN:

1 fase (primeras 24 horas), predominan levaduras no esporogeneas, que
resisten un grado alcohlico 4-5. Son sensibles al anhdrido sulfuroso.

2 fase,(2-4 da), predomina el Sacharomyces cerevisiae que resiste hasta un
grado de alcohol entre 8 y 16. En esta fase es cuando se da la mxima capacidad
fermentativa

3 fase, sigue actuando Sacharomyces Cerevisiae junto a Sacharomyces Oviformis.
Tambin pueden existir otros microorganismos procedentes principalmente de las
bodegas y de los utensilios, suelen ser hongos entre los que destacan Penicillium,
Aspergilus-Oidium,...

Otras-sustancias-generadas-en-la-fermentacin-son:
-cido-actico
-cido-lctico
-cido-pirvico-y-acetaldehido
- cido succnico
Azucares + levaduras ==> Acohol etlico + CO2 + Calor + Otras sustancias


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REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LA LEVADURA

Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se le han aadido los nutrientes
apropiados. La solucin acuosa que contiene los nutrientes necesarios se
denomina medio de cultivo. Lo nutrientes existentes en el medio de cultivo dan a
la clula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca ms
clulas semejantes a ella misma. Adems de las fuentes de energa, que pueden
ser substancias orgnicas o inorgnicas, o luz, el medio de cultivo debe de tener
fuentes de carbono, de nitrgeno y macro y micro nutrientes respectivos.
Un medio de cultivo ptimamente equilibrado es obligatorio para considerar la
mxima produccin. La composicin de los medios de cultivo debe ser
constantemente adaptada a los procesos de fermentacin. En general los
requerimientos bsicos de nutrientes para los microorganismos y las formas
comunes de satisfacerlos en los cultivos se enuncian en la siguiente tabla.






Requerimientos




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Composicin del extracto de levadura producido mediante autolisis


VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICA
TEMPERATURA
La temperatura es el factor de influencia decisiva para las actividades de las
levaduras. La temperatura ms adecuada para su reproduccin y la fermentacin
oscila entre 22 C a 27 C y se reproduce con mayor rapidez cuando la temperatura
es de 25 C. A temperaturas superiores a 30 C, las levaduras pierden capacidad
para desdoblar los azcares y al aproximarse a 40 C dejan de crecer y
reproducirse (Alvarez, 1991, 112). En una fermentacin alcohlica nunca se debe
superar temperaturas de 32 C durante el periodo fermentativo ya que se corren
varios riesgos(Madrid, Marzo de 1991).
Inactivacin de las levaduras responsables de la transformacin de los
azcares en alcohol y CO .
Prdida de alcohol por evaporacin con merma de grado alcohlico.
Iniciacin de fermentaciones indeseables.
La influencia de la temperatura sobre el poder fermentativo, medida del porcentaje
de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir, es diferente. Cuando se
fermenta a temperatura baja o moderada las fermentaciones son lentas, pero el
grado alcohlico alcanzado es generalmente mayor que a temperaturas elevadas o
superiores a los 30 C 35 C (Surez, 1990, 211).
Adems las fermentaciones alcohlicas efectuadas a 25 C obtienen mejores
resultados que las efectuadas a 30 C ya que:
El crecimiento de microorganismos determinado, muestra que a 25 C la levadura
se desarrolla un 25.5% ms que a 30 C; El consumo de slidos solubles, sacarosa y


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grado alcohlico a 25 C es de 42.8 %, 71.0 % y 7.3 GL respectivamente mientras
que a 30 C es de 36.4%, 63.8 % y 6.0 GL(Merchan y Castillo, 1999, 120).
El buen desarrollo de la fermentacin esta en parte ligado a la necesidad de evitar
que las levaduras sean sometidas a temperaturas demasiado elevadas. La
experiencia ha demostrado que son tanto ms sensibles a la elevacin de
temperaturas cuanto ms vieja sea la poblacin, lo que constituye una causa de
ralentizacin y a veces de parada de la marcha fermentativa, mientras quedan en el
medio azcares aun no transformados en alcohol.
A partir de 30 C se puede considerar que las levaduras reducen progresivamente
su actividad, hasta cesarla completamente cuando se aproxima a los 40 C. El
hecho de tratar de mantener la temperatura a un nivel razonablemente bajo no
aspira solamente a la mayor regularidad de la fermentacin y mayor grado
alcohlico, si no que tiende a frenar la perdida por volatilizacin de una fraccin
importante de compuestos aromticos (Surez, 1990, 211).
pH

El crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentacin no se ve afectado por
la variacin de pH entre 3.5 y 6.0 en el medio, pero a valores de pH entre 3.05 hasta
3.50 en el medio, se logra alcanzar un mximo de rendimiento de acuerdo a la
formacin de producto y crecimiento de la levadura (Aleixandre, Noviembre de
1998).
En una fermentacin alcohlica, el pH vara normalmente entre un mnimo de 2.8 y
un mximo de 3.8, rango que depende bsicamente de la composicin del medio a
ser fermentado (De Rosa, 1998, 194). Se establece que el pH en valores menores
que 3.0 en un proceso fermentativo, se presenta el fenmeno de inhibicin por pH,
el cual se debe al efecto que esta variable tiene sobre los centro activos de las
enzimas. Estos centros presentan actividad en un determinado estado de
ionizacin y este estado vara en funcin del pH el medio. Por lo tanto, la actividad
enzimtica es funcin del nmero de centros activos y estos, dependen del pH del
medio. Por otra parte, este fenmeno puede interpretarse por el importante efecto
que el pH del medio tiene sobre la estructura y la permeabilidad de la membrana
celular
Ajuste del pH
o Adicin de cido tartrico o de cido ctrico: Los dos nicos cidos que se
pueden usar tanto tecnolgicamente como legalmente, son el cido
tartrico y el ctrico.
o Desacidificacin: Los desacidificantes utilizables tcnicamente en las
fermentaciones son: el carbonato de calcio, el bicarbonato de potasio y el
tartrato neutro de potasio.


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AIREACIN
Durante mucho tiempo se pens que las levaduras eran microorganismos
anaerobios estrictos, es decir, deba realizarse la fermentacin en ausencia de
oxgeno. Sin embargo, es un hecho errneo ya que requieren una cierta aireacin.
Esta oxigenacin se consigue en los procesos previos a la fermentacin y mediante
remontados de aireacin en la elaboracin de tintos (habitualmente se realizan
nada mas arrancar la fermentacin y a las 24 h. despus, remontados tpicos de la
escuela bordolesa).
Una aireacin sumamente excesiva es totalmente absurda ya que, entre otras
consecuencias en el vino, no obtendramos alcohol sino agua y anhdrido carbnico
Debido a que las levaduras, cuando viven en condiciones aerbicas, no utilizan los
azcares por va fermentativa sino oxidativa, para obtener con ello mucha ms
energa.
INHIBIDORES
Es importante evitar la presencia de inhibidores en el mosto como restos de
productos fitosanitarios y cidos grasos saturados de cadena corta.
CONCENTRACIN INICIAL DE AZCARES
No podemos pensar en fermentar un mosto con una concentracin muy elevada de
azcares. En estas condiciones osmfilas las levaduras simplemente estallaran al
salir bruscamente el agua de su interior para equilibrar las concentraciones de
solutos en el exterior y en el interior de la clula, es decir, lo que se conoce como
una plasmlisis.
Esta es la base de la elaboracin de mostos concentrados estables
microbiolgicamente (Be >29), si bien determinadas especies de levaduras como
Saccharomycodes Ludwigii y Schizosaccharomyces pombe, entre otras, son
capaces de resistir.









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4. MATERIALES Y METODOS
Pruebas preliminares












MATERILAES Y REACTIVOS
- Vasos de Precipitado
- Probetas
-Corchos
- Botella
- Mangueras
- Termometro
-Refractometro
- Balanza
-Acido Citrico
- Carbonato de Calcio
- Levadura
-Azucar
-Urea
- Tubos de ensayo
- Centrifugadora
- Horno
- 2 Melones





Activacion de la levadura a 35C
con solucin de azcar al 5 %
PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO
Desarrollo de la fermentacin a
temperaturas de 25C hasta
estabilizar los solidos solubles
totales
Determinacion de parmetros en
funcin del tiempo: grados Brix,
solidos solubles, ph
Se tomaran muestras cada hora
durante 24 horas, hasta conseguir
que los grados Brix y ph, sean
constantes.


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5. PROCEDIMIENTO PARA LA FERMENTACION

Se hace el lavado de la fruta (meln), se procede a
cortar, licuar y filtrar.
Al momento de realizar la filtracin se deber anotar
el peso de la biomasa inicial.
Se hace una medicin inicial de los grados Brix y se
aade 130 gr de azcar y 3 gr de cido ctrico para que
llegue a 20 grados Brix.
Se ajusta la densidad aadiendo 3 gr de cido ctrico, 3 gr de urea y
aproximadamente 5gr de levadura.
Seguidamente se introduce este lquido a un reactor (botella de damajuana) el
cual tiene dos salidas por la parte superior una para sacar las muestras y otra
para se pueda liberar el CO2 producido en la fermentacin. Se debe mantener a
una temperatura de 35C.
Se sacaran 4 muestras cada hora, luego cada 24 hr hasta que los grados brix, ph
y la densidad sean constantes.
Tratamiento de cada muestra:
A cada muestra se la debe centrifugar por 5 min.
Luego se debe medir: el ph, la densidad y los grados brix.
Seguidamente se debe decantar el tubo de ensayo, quedando solo en la
parte inferior la biomasa. Se pesa este tubo de ensayo con la biomasa y
luego se introduce en el horno a 100C por 10 min aproximadamente
hasta tener un peso constante.
Al cabo de una semana se hace la destilacin del lquido fermentado en el
reactor.












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PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES POR
LICOR DE FEHLING

Reactivos
Solucin de glucosa al 2 por mil
Solucin A (Cprica)
Solucin B (Sdica)

Azul de metileno (reactivo indicador)

Agua destilada

Materiales
Baln de 500mL
Bureta de 25,00mL
Pipeta aforada de 5,00mL
Pipeta graduada de 5,0mL
Probeta de 50mL
Pinza de madera
Mechero Bunsen
METODO
Determinacin del Ttulo del Licor de Fehling
En el baln se colocan 5,00mL de solucin A, 5,0mL de solucin B (Licor de
Fehling) y 50mL de agua destilada. En bureta solucin de glucosa al 2 por mil. Se
calienta a ebullicin sobre mechero Bunsen agitando constantemente el baln con
un movimiento giratorio para evitar proyecciones de lquido. Se deja caer la
solucin azucarada gota a gota manteniendo el lquido en ebullicin y movimiento.
Evitar el agregado de gran volumen de lquido que enfre el Licor de Fehling y
provoque la formacin de un precipitado coloidal amarillo de xido cuproso y
difcil sedimentacin. La operacin est terminada desde el momento en que el
lquido sobrenadante sea completamente incoloro. Para facilitar la determinacin
del punto final, se agrega una a dos gotas de azul de metileno como reactivo
indicador pero sin retirar el baln del fuego.
El indicador es reducido y decolorado por los azcares cuando todo el cobre es
precipitado. En este momento se anota el gasto de glucosa (G)
Para hallar el ttulo del Licor de Fehling se procede de la siguiente forma:



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2 gr de glucosa --------------- 1000 ml
T ---------------- G

Conviene repetir dos a tres veces la valoracin con glucosa y promediar los gastos
para la determinacin del ttulo, siempre que estos sean concordantes.
Determinacin de azcar reductor de la muestra
Luego de obtener el ttulo se procede a la determinacin sobre muestra muestra.
Para eso se debe decolorar con carbn decolorante ( si fuese necesario) y
proceder de igual forma que en la determinacin del ttulo con la variante que en
bureta ahora ir nuestra muestra decolorada. Una vez obtenido el gasto de
muestra necesaria para decolorar al licor de Fehling (G), se procede de la
siguiente forma:
G ml de muestra --------------------- T
1000 ml ---------------------- X

Cuando se trabaja con mostos, cuyos contenidos de azcar se encuentra entre 150
a 250 g/L, se efecta siempre una dilucin de 100 veces, para esto hacemos dos
diluciones sucesivas de 10 veces cada una. En este caso F=100. Esta dilucin la
colocamos directamente en la bureta, no es necesario decolorar.
Los gastos de nuestra o dilucin deben ser mayores que 5,00mL, sino hay que
diluir.
MTODO PARA LA DETERMINACIN DEL CONTENIDO ALCOHLICO DE ETANOL
POR EL MTODO DE DESTILACIN SIMPLE








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Fundamento del mtodo
La muestra se somete a destilacin simple en condiciones especficas y en el
destilado se determinan los grados brix (porcentaje de etanol en volumen),
utilizando un refractometro.

Materiales
Cocina electrica
Probeta de 250 ml
Aparato de destilacin
Baln aforado de 250 ml
Reactivos
Agua destilada
Procedimiento - Destilacin
En un baln aforado de 250 ml adicionar la
muestra y llenar hasta la marca.
Instalar el equipo de destilacin.
En el baln de destilacin verter la muestra, a continuacin lavar el baln
que contena la muestra con agua destilada
Comenzar la destilacin con un calentamiento regulado y continuo.
Recoger el destilado en el mismo baln en que se midi la muestra, ste
baln debe estar sumergido en agua con hielo para evitar prdidas debido a
la alta volatilidad del etanol.
La destilacin termina cuando se han completado las partes del baln
que recibe el destilado retirando.
Medir el grado de alcohol














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6. PRESENTACION DE RESULTADOS
RESULTADOS DE LA FERMENTACIN
TABLA N 1
Tiempo Hora de
medicin
Fecha

Ph Temperatura Densidad Cociente
de
sacarosa
B
Peso de
biomasa
1

12 pm 21/04 4 35 C 1.056 18.7 0.763 gr

2
1 pm 21/04 4 33 C 1.044 18.3 0.766 gr

3
2 pm 21/04 4 34 C 1.044 18.3 0.770 gr

4
3 pm 21/04 4 35 C 0.97 15.4 0. 784
gr

5
11 am 24/04 4 35 C 0.98 6.8 0.803 gr

6
11 am 25/04 3.5 34 C 0.98 6.9 0.811 gr

7
1 pm 25/04 3 33 C 0.98 7.7 0.827 gr

8
8 am 28/ 04 3 35 C 1.0 7.3 0.868 gr

9
9 am 29/04 3 35 C 1.0 7.3 0.894 gr

CARACTERSTICAS DEL SUTRATO
Caractersticas
(MELON)
Inicial Final

Volumen

2000 ml

1455 ml

Densidad

1.023
gr/cm3

1.011
gr/cm3

Grados Brix
( antes de la
fermentacin)

10.5

20

Grados Brix
( despus de la
fermentacin)

---

7.3
( constante)

PH

5.5

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NUTRIENTES ADICIONADOS:

NUTRIENTES CANTIDAD

Azcar

130 gr
Urea terica
( 2 gr / litro)

3 gr
Levadura terica
( 3 gr / Litro)

5 gr
Acido ctrico
(regulador de Ph)

3 gr

TITULACION PARA DETERMINAR AZUCARES REDUCTORES

MUESTRA

GASTO DE
TITULACION

GLUCOSA ( titulo)

12.5 ml

MUESTRA

4.9 ml ( gasto)

Para nuestro caso el titulo seria:

Para la determinacin de azucares reductores en la muestra.

=


=