RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y ESCHERICHIA COLI

EN AGUAS MEDIANTE LA TCNICA DE FILTRACIN

UTILIZANDO PLACAS PETRIFILM.
Espinosa V.1, Meier C.E.2, Prez J.I.2
1 3M Argentina. Olga Cossettini 1031 Cap. Fed. - Argentina. vespinosa@mmm.com
2 Zormex S.A. Constituyentes 4740 Cap. Fed. - Argentina. zormex@fibertel.com.ar
Introduccin
La tcnica de filtracin, en comparacin a la de Nmero Ms Probable (NMP), tiene la
ventaja de requerir menor cantidad de medios de cultivo y optimizar el espacio en las es-
tufas de incubacin. La utilizacin de las placas Petrifilm agrega a estas, las ventajas de
no requerir la preparacin de medios, de reducir los tiempos de incubacin y el espacio
en estufas. Adems no es necesaria la confirmacin de colonias y permite la posibilidad
de informar un recuento de Escherichia coli.
Objetivos
El objetivo del presente trabajo fue comparar los resultados de coliformes y E. coli en
muestras de agua obtenidos mediante la tcnica de filtracin utilizando las placas Petri-
film y el mtodo de referencia de la APHA. Para esto se analizaron 37 muestras en parale-
lo mediante ambos mtodos. 31 de estas muestras fueron inoculadas artificialmente con
cepas de E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis
Inoculacin de Muestras
Se prepararon repiques de las cepas utilizadas en caldo triptosa soja, que fueron incuba-
dos a 35 0,5C durante 18 2 horas. Se prepararon diluciones decimales en agua pep-
tonada al 0,1 % y de acuerdo al inculo que se deseaba utilizar se eligi la dilucin y el
volumen a sembrar. Se utiliz como matriz agua de red inactivada con tiosulfato de sodio
(0,1 mL de una solucin 3% por cada 120 mL). Para conocer el inculo terico se sembr
el volumen inoculado en una placa a la que se agreg agar para recuento en placa y se
incub a 35 0,5C durante 40-48 horas.
Mtodo APHA 9222 B
Se filtraron 100 mL de cada muestra a travs de una membrana de 0,45 m de poro utili-
zando un equipo Microfil de Millipore. La membrana fue colocada sobre una placa con
agar LES Endo. Las placas fueron incubadas invertidas a 35 0,5C durante 22-24 horas.
Se contaron las colonias tpicas y atpicas y se sembraron al menos 5 colonias tpicas y 5
atpicas en caldo Brila para confirmar la presencia de coliformes. Los tubos de caldo Brila
fueron incubados a 35 0,5C durante 48 3 horas. Para la deteccin de E. coli los
tubos de caldo Brila con produccin de gas fueron sembrados en caldo EC y estos fueron
incubados a 44,5 0,2C durante 24 2 horas. Los tubos de caldo EC con produccin
de gas fueron sembrados en agar EMB, las placas fueron incubadas a 35 0,5C durante
24 2 horas. Al menos una colonia tpica fue sembrada en agar nutritivo y este fue incu-
bado a 35 0,5C durante 24 2 horas. Se sembraron las pruebas del IMViC en caldo
triptona, caldo MR-VP y agar citrato de Simmons.
Los resultados fueron expresados en ufc en 100 mL de muestra.
Coliformes: Si no se detectan coliformes se informa: < 1 ufc en 100 mL de muestra. Si no
se confirma el total de colonias sospechosas de coliformes se aplica la ecuacin corres-
pondiente para calcular el total de colonias de
coliformes.
Escherichia coli: Si no se detecta E. coli se informa No se detecta en 100 mL de mues-
tra. Si se confirma al menos una colonia sospechosa como E. coli se informa: Se de-
tecta en 100 mL de muestra.
Mtodo Placas PetrifilmMR
Paso 1: Las placas son hidratadas
con 1 mL de agua destilada estril
Paso 5: Se colocan 100 mL de la
muestra de agua en el vaso de
filtracin estril
Paso 2: Las placas hidratadas son
almacenadas en refrigeracin
durante al menos 1 hora para que el
gel pueda gelificar.
Paso 6: Se aplica vaco al equipo
de filtracin
Paso 7: Se retira la membrana y se coloca en la parte inferior de la placa
Petrifilm (el gel queda en la parte superior)
Paso 4: Se coloca un vaso de
filtracin estril
Paso 8: Las placas son
incubadas a 35 1C
durante 24-48 horas.
Paso 9: Lectura de placas:
E.coli: colonias azules
asociadas a gas; Coliformes:
Colonias rojas y azules
asociadas a gas.
Expresin de los resultados:
ufc en 100 mL de muestra
para Coliformes o E.coli.
Paso 3: Se coloca una membrana de 0,45 m de poro sobre el equipo de
filtracin
Anlisis Estadstico
El anlisis estadstico de los resultados se realiz con los datos de coliformes;
se utilizaron aquellos cuyos valores eran > 1 ufc en ambos mtodos (31 datos).
Previo al anlisis estadstico se calcul el logaritmo de los datos. Se aplic la
prueba estadstica de t-Student utilizando el programa Minitab, arrojando los
siguientes resultados:
Two-sample T for APHA vs Petrifilm
N Mean StDev SE Mean
APHA 31 1,470 0,430 0,077
Petrifilm 31 1,466 0,428 0,077
Difference = mu (APHA) - mu (Petrifilm)
Estimate for difference: 0,003774
95% CI for difference: (-0,214272. 0,221820)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,03 P-Value
= 0,972 DF = 59
-
TABLA I. RESULTADOS DE COLIFORMES Y Escherichia coli MEDIANTE LOS MTODOS APHA Y PETRIFILM
INOCULACIN DE MUESTRAS RESULTADOS
COLIFORMES Escherichia coli
ENSAYO MICROORGANISMO
CONCENTRACIN
TERICA
(UFC/100 mL)
CONCENTRACIN
TERICA DE
COLIFORMES
(UFC/100 mL)
APHA
(UFC/100 mL)
PETRIFILM
(UFC/100 mL)
APHA
(EN 100 mL)
(*)
PETRIFILM
(UFC/100 mL)
E. coli 1 1
E. faecalis 1
1 2 2 D 2
E. coli 15 2
E. faecalis 5
15 16 11 D 11
E. coli 22 3
E. faecalis 8
22 19 25 D 25
E. coli 29 4
E. faecalis 10
29 32 28 D 28
E. coli 29 5
E. faecalis 15
29 35 25 D 25
E. coli 29 6
E. faecalis 20
29 26 22 D 22
E. coli 29 7
E. faecalis 31
29 24 37 D 37
8 E. coli 4 4 < 1 3 ND 3
9 E. coli 7 7 8 7 D 7
10 E. coli 14 14 7 7 D 7
11 E. coli 14 14 11 12 D 12
12 E. coli 14 14 13 12 D 12
E. coli 20 13
K. pneumoniae 18
38 36 40 D 24
E. coli 20 14
K. pneumoniae 18
38 31 35 D 19
E. coli 47 15
P. aeruginosa 37
47 48 40 D 40
E. coli 47 16
P. aeruginosa 37
47 54 48 D 48
E. coli 57 17
P. aeruginosa 44
57 53 58 D 58
E. coli 57 18
P. aeruginosa 44
57 59 63 D 63
E. coli 10 19
K. pneumoniae 47
57 59 62 D 18
E. coli 10 20
K. pneumoniae 47
57 64 65 D 16
E. coli 94 21
P. aeruginosa 66
94 81 89 D 89
E. coli 94 22
P. aeruginosa 66
94 78 76 D 76
23 E. coli 9 9 5 5 D 5
24 E. coli 9 9 8 11 D 11
E. coli 15 25
K. pneumoniae 21
36 39 35 D 12
E. coli 15 26
K. pneumoniae 21
36 33 35 D 10
27 E. coli 33 33 28 27 D 27
28 E. coli 33 33 27 26 D 26
E. coli 5 29
K. pneumoniae 88
93 109 103 D 4
E. coli 5 30
K. pneumoniae 88
93 99 89 D 4
E. coli 9 31
K. pneumoniae 97
106 110 107 D 15
E. coli 9 32
K. pneumoniae 97
106 109 103 D 11
33 Sin inculo --- --- < 1 < 1 ND < 1
34 Sin inculo --- --- < 1 < 1 ND < 1
35 Sin inculo --- --- < 1 < 1 ND < 1
36 Sin inculo --- --- < 1 < 1 ND < 1
37 Sin inculo --- --- < 1 < 1 ND < 1
(*) Debido a que el mtodo APHA no permite cuantificar, se expresa el resultado como se detecta (D) o no se detecta (ND) en 100 mL.
Resultados y Discusin
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla I.
El anlisis estadstico muestra que para un nivel de confianza del 95 % ambos mtodos no presentan diferencias significativas en los recuentos de
Coliformes. Ver Grfico I
Los resultados de E. coli no pudieron ser comparados estadsticamente ya que con el mtodo de la APHA se obtuvieron resultados cualitativos. Sin
embargo hubo coherencia de resultados en la deteccin de este microorganismo entre ambos mtodos. En la muestra 8 no se detect la presencia de
coliformes y E. coli mediante el mtodo de la APHA, lo cual puede deberse a que se trataba de un inculo muy pequeo (4 ufc en 100 mL).
Conclusiones
El mtodo de recuento de coliformes y E. coli en aguas mediante las placas Petrifilm puede ser utilizado como un mtodo alternativo ms rpido y
sencillo que el tradicional, con la posibilidad de realizar un recuento de E. coli en 24-48 horas.
Referencias Bibliogrficas
1. American Public Health Association (APHA). Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater. 20th Edition. 1998.
2. 3M Petrifilm E.coli/coliform count plate. Interpretation Guide. 2001
APHA
P
e
t
r
if
ilm
2,0 1,5 1,0 0,5
2,0
1,5
1,0
0,5
S 0,0728923
R-Sq 97,2%
R-Sq(adj) 97,1%
Grfico I: Petrifilmvs APHA
Petrifilm = 0,02306 +0,9817 APHA
MICROBIOLOGA