ANLISIS DE FLUJOS METABLICOS: LA PROGRAMACIN MATEMTICA COMO PUENTE

ENTRE LA BIOLOGA Y LA INGENIERA

METABOLIC FLUX ANALYSIS: MATHEMATICAL PROGRAMMING AS CONNECTION BETWEEN
BIOLOGY AND ENGINEERING
CARLOS A. MARTNEZ RIASCOS

RESUMEN: Se presenta el anlisis de flujos metablicos como una forma de caracterizar el comportamiento metablico de
un microorganismo en una condicin ambiental especfica, la cual elimina las incertidumbres que permanecen a pesar de los
anlisis genmicos y protemicos, y genera la informacin necesaria para diversos estudios como los de ingeniera gentica.
Tambin se presentan algunas estrategias para la formulacin del problema de optimizacin, el cual implica la cuantificacin
de flujos metablicos y para la solucin del mismo; finalmente, mediante dos estudios de caso se muestra como el MFA
requiere consideraciones especficas y genera informacin diferente en cada aplicacin, pero el problema de optimizacin no
lineal es una constante en este tipo de anlisis.

PALABRAS CLAVE: Anlisis de flujos metablicos, carbono marcado, programacin matemtica.

1. INTRODUCCIN1
La ingeniera metablica, definida como
el mejoramiento no aleatorio del metabolismo
empleando modificaciones en las reacciones
bioqumicas mediante las tecnologas de
recombinacin de ADN,
comenz a
desarrollarse desde 1973 cuando, por primera
vez, un gen clonado fue obtenido [1]. Dentro de
un desarrollo de ingeniera metablica, el
anlisis de flujos (MFA: Metabolic Flux
Analysis)
permite
caracterizar
el
comportamiento
metablico
de
un
microrganismo o clula y definir las
modificaciones
genticas
necesarias,
o
confirmar el efecto de modificaciones
realizadas; de esta forma, el MFA es una etapa
fundamental en el ciclo de la ingeniera
metablica (Fig. 1).
Inicialmente, la cuantificacin de flujos
metablicos se soport en balances de
metabolitos y cofactores (ATP, ADP, NADH,
NADPH, etc.), pero los balances de metabolitos
no generan sistemas matemticos determinados
Carlos A M Riascos: camartinezri@unal.edu.co, Profesor Asociado,
Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental, Universidad
Nacional de Colombia, Bogot.

cuando se consideran reacciones reversibles o

vas metablicas cclicas o paralelas [2], y los de
cofactores generan incertidumbre en cuanto a la
inclusin de todas las reacciones que los
involucran. Actualmente esas dificultades se han
resuelto empleando informacin obtenida
mediante experimentos con sustrato marcado
para lo cual se emplea espectroscopa de masas
acoplada a cromatografa gaseosa GC-MS o
resonancia magntica nuclear NMR.
Anlisis
Caracterizacin del metabolismo

Sntesis

Proyecto

Alteraciones genticas

Definicin de cambios

Fig. 1. El ciclo de la ingeniera metablica.

El uso de experimentos con sustrato

marcado aumenta drsticamente la dimensin y
complejidad del problema matemtico a
resolver: los balances de metabolitos generan
sistemas con decenas de ecuaciones lineales
(una ecuacin para cada metabolito que se
balancea), mientras que los balances de carbono

marcado generan sistemas con centenas y hasta

miles de ecuaciones no lineales, haciendo
necesario el uso de tcnicas de programacin
matemtica para su resolucin.

conocimiento de las reacciones bioqumicas que

puede realizar el microrganismo y la
formulacin de los balance de metabolitos y de
marcacin, estos balances conforman las
restricciones del problema de optimizacin.

Este trabajo presenta las caractersticas

del problema de cuantificacin de flujos
metablicos, as como algunas estrategias
desarrolladas para la formulacin matemtica y
para la resolucin.

S
r1
A r3

2. CUANTIFICACIN DE FLUJOS
METABLICOS

B
r4

CO2

La estimacin de los flujos metablicos

(velocidades
de
reaccin)
permite
la
caracterizacin fluxmica del microrganismo en
determinada
condicin
ambiental
una
fotografa del comportamiento del metabolismo
en la condicin actual. Esta caracterizacin es
especfica y puede ser empleada con diferentes
fines, como definir modificaciones genticas o
confirmar el efecto de modificaciones
realizadas, estimar rendimientos tericos,
identificar nodos de control (reacciones que
controlan la velocidad del metabolismo), etc.
3. FORMULACIN MATEMTICA DEL
PROBLEMA
La imposibilidad de medir directamente
los flujos metablicos, o de calcularlos
analticamente, empleando las mediciones de los
flujos extracelulares y los balances, hace
necesaria la formulacin de un problema de
optimizacin para su estimacin. El problema de
optimizacin es un problema de estimacin de
parmetros, donde los flujos intracelulares son
los parmetros, la prediccin de los flujos
extracelulares y de la marcacin en los
productos, que dependen de los flujos
intracelulares, debe ajustar los valores medidos;
esta estrategia de estimacin de parmetros es
conocida como error en las variables [3].

del

La prediccin de los flujos extracelulares

patrn de marcacin requiere el

CO2

r2

C
r5
Cextracelular
Fig. 2. Red metablica para presentacin de la metodologa.

3.1 Balance de metabolitos

El balance de metabolitos se basa en la
consideracin de estado estacionario o
pseudoestacionario, el cual implica que a pesar
del crecimiento de la biomasa la concentracin
de los metabolitos intracelulares se mantiene
constante. Esta suposicin ha sido validada con
estudios
experimentales
y simulaciones
dinmicas [4], y dentro de los balances se
traduce como: la velocidad de las reacciones que
generan un metabolito es igual a la velocidad de
las reacciones que lo consumen; para el
metabolito B del ejemplo presentado en la Fig. 2
el balance es:
dB
r3 r4 0
dt

(1)

donde ri es el flujo o velocidad en la reaccin i.

Para simplificar la formulacin del
problema matemtico, la totalidad de los
balances se puede formular con una nica
ecuacin matricial:
GT r 0

(2)

donde G es la matriz estequiomtrica, con los

coeficientes de cada metabolito en cada
reaccin, y r es el vector con los flujos de las
reacciones.

de masa slo se diferencian en la cantidad de

tomos de 13C, mientras que los de posicin
consideran el nmero de tomos 13C y la
posicin de ellos en la molcula.

3.2 Caracterizacin del patrn de marcacin

3.3 Balances de marcacin

La estimacin del patrn de marcacin

en los productos requiere un modelo para
predecir la incorporacin del 13C en los
diferentes metabolitos. Mltiples formulaciones
han sido propuestas para este modelamiento; las
ms sencillas como los balances de marcaciones
fraccionarias [5] que genera n balances para
cada metabolito, donde n es el nmero de
tomos de carbono, y los balances de
isotopmeros de masa que genera n+1 balances
para cada metabolito slo incluyen informacin
parcial por lo que no son adecuadas para todos
los anlisis; mientras que las formulaciones ms
complejas como las basadas en las unidades
elementales de los metabolitos (EMU:
Elementary Metabolite Unit) [6], y los balances
de isotopmeros de posicin [7], los ltimos
genera 2n balances para cada metabolito e
incluye toda la informacin de la red
metablica.

As como los balances de metabolitos,

los de marcacin se sustentan en la suposicin
de estado estacionario o pseudoestacionario, que
se traduce en que el estado de marcacin de
cada metabolito (definido por la fraccin de sus
isotopmeros) es constante; para desarrollar el
balance de marcacin es necesario conocer la
correspondencia entre los tomos de carbono de
reactivos y productos en cada una de las
reacciones de la red metablica. Considerando
que los tomos de carbono de los metabolitos en
las reacciones 3 y 4 de la red de la Fig. 2. se
relacionan como se presenta en la Fig. 4.

Isotopmeros de posicin
000
1

100
2

010
3

110
4

001
5

101
6

Isotopmeros de masa
011
7

111
8

CO2
A
abc

B
ab

C
ab

Fig. 4. Ejemplo para formulacin de balances de isotopmeros.

12

C Atoms

13

C Atoms

Fig. 3. Caracterizacin isotopomrica de una molcula con 3 carbonos.

El trmino isotopmero viene de la

combinacin de los trminos istopo e ismero
y define las diferentes posibilidades de
marcacin de una molcula. Para una molcula
con 3 tomos de carbono existen 8 isotopmeros
de posicin y cuatro isotopmeros de masa,
como se observa en la Fig. 3. Los isotopmeros

La abundancia del isotopmero 2 del

metabolito B (AB,2) se incrementa en funcin de
la velocidad de la reaccin 3 y la abundancia de
los isotopmeros 2 y 6 del metabolito A
(AA,2+AA,6), pero este incremento se compensa
con el consumo, que depende de la abundancia
del isotopmero, para el cual se est
desarrollando el balance, y de la velocidad de la
reaccin 4; de esta forma, el balance ser:
balance de AB,2 : ( AA,2 AA,6 )r3 AB,2 r4 0

(3)

Los 2n balances de isotopmeros para un

metabolito se pueden agrupar en una ecuacin
matricial.

 r IMM
j

j ,S-B

IDVS

r IDVB 0

B,l l

(4)

donde rj y rl son los flujos en los grupos de

reacciones que producen y consumen el
metabolito B, respectivamente; S es el sustrato
que genera B en cada reaccin, gB,l es el
coeficiente estequimtrico de B en la reaccin l,
y IMMj,S-B es la matriz de mapeamiento de
isotopmeros que relaciona los isotopmeros de
los metabolitos sustrato (S) y producto (B) en la
reaccin j.
Entre otras formulaciones para los
balances de marcacin est la de cummeros,
bondmeros y marcaciones fraccionarias, las
marcaciones fraccionarias definen la fraccin de
13
C en cada posicin atmica.
3.4 El problema de optimizacin
El problema de estimacin de
parmetros, que se formula para la
cuantificacin de los flujos en la red metablica,
cuando se emplea balances de isotopmeros y
mediciones del patrn de marcacin con
GC-MS es:
2

algunos trabajos de investigacin [8]. Por lo

anterior la estrategia de solucin requiere
cuidado especial para lograr resultados
coherentes.
4. ALGUNAS ESTRATEGIAS DE
SOLUCIN
Como se present en la seccin anterior,
los problemas de cuantificacin de flujos
metablicos son problemas de optimizacin no
lineal, en los que se ha observado la existencia
de ptimos locales y se han probado diversas
estrategias de solucin.
4.1 Algoritmos evolutivos
Los algoritmos evolutivos que hacen
parte de los mtodos de optimizacin
bioinspirados; groso modo, simulan la evolucin
a partir de una poblacin inicial con la mayor
diversidad posible (generada aleatoriamente),
esta poblacin evoluciona por seleccin de los
mejores individuos, y generacin de nuevos
individuos por cruzamiento entre los existentes
o mutacin.

aq ,exp aq ,cal
rp ,exp rp ,cal
min

q
p
q
p

s.t. G T r 0
balance de metabolitos
h( IDVi rj ) 0

balance de isotopmeros

aq ,cal f ( IDVi )

marcacin en los productos

(5)

0 rj

donde aq es la abundancia de los isotopmeros

de masa de los productos, que se calculan a
partir de la distribucin de los isotopmeros de
los metabolitos intracelulares; es la desviacin
estndar de una medicin, y los subndices exp y
cal distinguen los valores experimentales y
calculados.
Como se ha planteado, los balances
isotopmeros hacen que el problema sea
lineal y, por consiguiente, con posibilidad
ptimos locales, lo cual se ha verificado

de
no
de
en

Fig. 5. Estrategia de convergencia de los algoritmos evolutivos.

La principal ventaja de los mtodos

evolutivos es que, por no usar derivadas, no
sufren las dificultades causadas por la existencia
de ptimos locales, en contraste, no garantizan
la obtencin rigurosa de la solucin ptima. La
Fig. 5 ilustra la estrategia de convergencia de un
algoritmo evolutivo para un problema con una

sola variable de optimizacin. En esa figura se

puede observar como slo los mejores
individuos de una generacin (los de menor
valor para la funcin objetivo) son
seleccionados para hacer parte de la siguiente,
pero el nmero de individuos en cada
generacin debe ser constante por lo que nuevos
individuos deben ser adicionados. Los nuevos
individuos permiten buscar la solucin en zonas
no exploradas (especialmente los generados por
mutacin) e intensificar la bsqueda en las
zonas ya exploradas (los generados por
cruzamiento).
4.2 Algoritmos de optimizacin local y global
con mtodos determinsticos

Para garantizar la obtencin del ptimo

global empleando mtodos determinsticos, se
han propuesto varias opciones entre las que se
encuentra el algoritmo Branch and Bound
(B&B) espacial [3], el cual genera lmites para
la solucin global (bounding) y divisin del
espacio de bsqueda (branching). Para un
problema de minimizacin el lmite superior de
la solucin global (UB) es la mejor solucin
local obtenida, mientras que el lmite inferior
(LB) se obtiene con la solucin de una
aproximacin convexa del problema. Por su
parte, la divisin del espacio de bsqueda
garantiza la exploracin de todas las regiones
del espacio y mejora el ajuste de la
aproximacin convexa, Fig. 7.

A diferencia de los algoritmos

evolutivos, los mtodos determinsticos hacen la
bsqueda desde un nico punto inicial y definen
la direccin de bsqueda con base en la
informacin obtenida a partir de las derivadas.
Esta forma de bsqueda es la principal ventaja
de estos algoritmos: les permite convergir de
forma eficiente a una solucin ptima, pero
tambin su principal desventaja: pueden
convergir a ptimos locales, la Fig. 6 ilustra la
convergencia de los mtodos determinsticos.

Fig. 7. Convergencia global por B&B espacial. La divisin del espacio

de bsqueda en el punto xb, genera dos subregiones, con aproximaciones
convexas ms ajustadas al problema original (NLP).

4.3 Algunos softwares disponibles

Fig. 6. Estrategia de convergencia de los algoritmos basados en

derivadas. Dado un punto inicial xk se define la direccin de bsqueda dk
e iterativamente se converge a la solucin sea un ptimo local o global.

En la actualidad existen diversos

softwares para la cuantificacin de flujos
metablicos, podemos citar OpenFLUX [6], Fiat
Flux [9] as mismo hay herramientas para otros
anlisis de fluxmica, como el anlisis de
balance de flujos (FBA) [10]; a pesar de eso, las
herramientas computacionales estn en continuo
desarrollo buscando resolver problemas como el
diseo ptimo de experimentos.

Tabla 1. Resumen de resultados para el metabolismo

central de S. cerevisiae.

5. ESTUDIOS DE CASO
5.1 Cuantificacin de flujos
metabolismo central de S. cerevisiae

en

el

La red metablica analizada considera

las vas metablicas principales: la va
glucoltica (EMP: Embden-Meyerhof-Parnas),
la va de las pentosas fosfato (PP) y el ciclo de
los cidos tricarboxlicos (TCA). Para la
cuantificacin de flujos se usaron mediciones
del consumo de glucosa, de la generacin de
biomasa y la caracterizacin de la biomasa, as
como experimentos con glucosa marcada en el
primer carbono (con carbono 13 en la primera
posicin: [1-13C]glucosa) y medicin de la
marcacin
en
los
aminocidos
por
espectroscopa de masa [5].
Para el seguimiento del carbono 13 se
emplearon
balances
de
marcaciones
fraccionarias que, aunque slo contienen parte
de la informacin, permiten resolver el
problema con un esfuerzo moderado en el
modelamiento.
Inicialmente este problema fue abordado
con el objetivo nico de estimar los flujos
metablicos [5] para lo cual se emple un
algoritmo evolutivo, posteriormente se analiz
la existencia de ptimos locales y se desarroll
un algoritmo B&B para garantizar la obtencin
de la solucin ptima global [8].
El anlisis de los resultados obtenidos en
los dos trabajos permite confirmar la existencia
de soluciones locales, que representan
distribuciones de flujos metablicos con
diferencias reales. As mismo, se confirm que
el mtodo B&B espacial permite garantizar la
optimalidad global pero con un gran esfuerzo
computacional; estos resultados se encuentran
resumidos en la Tabla 1 y la Fig.8.

Estrategia
NLP global
NLP local
Evolutivo

Func. Obj.
22,74
201,85
26,31

Flujos metablicos centrales

EMP
PP
TCA
34,37
43,74
62,14
47,17
29,85
64,23
33,64
44,16
59,89

Fig. 8. Distribuciones de flujos metablicos obtenidas para el

metabolismo central de S. cerevisiae. Izquierda, solucin global y centro
solucin local obtenidas por NLP con B&B espacial [8], y derecha
solucin obtenida por algoritmo evolutivo [5].

5.2 Cuantificacin de flujos en la produccin

de PHAs por Pseudomonas
A diferencia del estudio del metabolismo
central de S. cerevisiae, la generacin de PHAs
se realiza en una condicin de no crecimiento de
biomasa, pues la produccin del polmero es un
mecanismo para acumulacin de energa y
carbono cuando la ausencia de fsforo o
nitrgeno impide la generacin de biomasa.
Debido a que la produccin del polmero
a partir de glucosa requiere la generacin y
polimerizacin del acetil-coA, el principal
objetivo de este trabajo es identificar la va
metablica por la cual est siendo procesada la
glucosa pues la eficiencia en el uso del sustrato
(rendimiento sustrato producto) depende de la
va metablica empleada, se consideran la va
glucoltica (EMP), la va de Entner-Doudoroff
(ED) y la va de las pentosa (PP) como opciones
para el metabolismo. Respecto al rendimiento
sustrato producto, la metabolizacin de un mol
de glucosa por las vas EMP o ED genera dos
mol de Acetil-coA, mientras que por la va PP
slo se genera un mol.

Inicialmente se emple glucosa con 13C

en la primera posicin pues la aparicin del 13C
en el producto depende de la va metablica: si
el metabolismo se realiza por la va de EMP el
primer carbono de la glucosa estar presente en
una de las molculas de Acetil-coA generadas,
mientras que por las vas de ED y PP este
carbono se pierde por descarboxilacin del
piruvato o de la glucosa-6-fosfato, ver Fig 9.

2. Es fundamental considerar la marcacin

natural (1.07% del carbono en la naturaleza
es 13C) para obtener resultados coherentes: al
no considerar la marcacin natural se puede
obtener distribucin de flujos completamente
diferente, Fig. 10.
3. Se requiere especial atencin en la medicin
del patrn de marcacin, pues la estimacin
de la distribucin de flujos metablicos es
muy sensible a errores en estas mediciones.
4. La estrategia desarrollada, experimentos con
mezcla de glucosa natural y completamente
marcada, y medicin de la marcacin en el
producto derivado del acetil-coA, permite
estimar la distribucin del metabolismo entre
las vas PP y ED.

CO

AcCoA

AcCoA

AcCoA
CO AcCoA AcCoA
2

EMP
Fig. 9. Evolucin del
glucosa.

ED

VP

13

C proveniente de la primera posicin de la

Los resultados de este anlisis inicial

permitieron reducir a tres la posibilidades de
metabolizacin de la glucosa: la va ED, la va
PP o por la combinacin de las vas ED y PP;
considerando la diferencia en el rendimiento
obtenido por estas vas se hace necesario estimar
cuanto se metaboliza por cada va y como la
distribucin se afecta por las condiciones medio
ambientales.

Para el problema en cuestin, por un mol

de glucosa asimilada el flujo en la va PP puede
ser entre 0 y 3 mol, la Fig. 10 presenta la
prediccin de la fraccin de un isotopmero
considerando la marcacin natural (CMN) y sin
considerarla (SMN), para todo el rango de
posibles distribuciones de flujos metablicos. Se
puede observar que una misma fraccin est
relacionada con distribuciones muy diferentes
dependiendo de la consideracin o no de la
marcacin natural.

Para estimar la distribucin de los flujos

metablicos se emple una mezcla de glucosa
marcada en todos los carbonos ([U-13C]glucosa)
y glucosa natural, aprovechando el barajamiento
que sufren los carbonos al ser metabolizados por
la va de las pentosas [10]. El anlisis de este
estudio de caso permite observar que:
1. El balance de marcaciones fraccionarias no
suministra informacin suficiente por lo que
se debi emplear la formulacin con balances
de isotopmeros de posicin.

Fig. 10. Efecto de la marcacin natural en la prediccin.

Cuanto al metabolismo de Pseudomonas

se observ que la produccin de PHAs se hace

simultneamente por las vas PP y ED, y que la

distribucin de flujos en la red metablica no
depende del nutriente limitante, nitrgeno o
fsforo.
6. CONCLUSIONES
La cuantificacin de flujos metablicos
permite caracterizar el metabolismo en una
condicin especfica, generando informacin
para confirmar o definir modificaciones
genticas, en pro de mejorar la maquinaria
metablica del microrganismo.
Los experimentos con sustrato marcado
suministran la informacin necesaria para
resolver problemas de estimacin de flujos en
redes con vas metablicas cclicas o paralelas,
pero aumentan drsticamente la complejidad del
problema matemtico que se debe resolver.
La estimacin de los flujos metablicos
empleando sustrato marcado requiere la
formulacin de un problema de optimizacin
donde la funcin objetivo es la diferencia entre
los valores medidos y calculados, esa funcin se
debe minimizar ajustando el valor de los flujos
intracelulares, cumpliendo con los balances de
metabolitos y de marcacin.
La estrategia para estimacin de flujos
metablicos con sustrato marcado debe ser
diseada especficamente para cada problema,
esta estrategia incluye: la seleccin del sustrato,
la formulacin de los balances de marcacin, la
tcnica de medicin del patrn de marcacin y
la herramienta matemtica para solucin del
problema.
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