Guias de Prácticas Bioquimica

Perodo
20142015
GUAS DE PRCTICAS
BIOQUMICA DE ALIMENTOS
Bioq. Mara Jos Andrade MSc.

Laboratorio de Qumica Analtica
Perodo 2014-2015
LABORATORIO DE QUMICA ANALTICA

Prctica N 1
PREPARACIN DE SOLUCIONES Y EXTRACTOS
1. OBJETIVOS:
Aplicar los conceptos de soluciones y realizar su preparacin a distintas concentraciones
Preparar extractos con diferentes muestras de vegetales para la aplicacin de los diferentes anlisis estudiados
en Bioqumica.
2. BASES CONCEPTUALES
EXTRACTOS
Se hacen para obtener un concentrado de principios activos. Existen extractos secos y lquidos. Los secos se usan para
elaborar pastillas.
Los extractos lquidos, principalmente de plantas, son la preparacin de una planta que se disuelve normalmente con
agua, se realiza una evaporacin del lquido excedente, o se hacen extracciones repetidas del mismo lquido hasta que
se obtiene la concentracin precisa. En los extractos slidos o secos se hace una evaporacin total del extracto o
tintura. En los extractos se pueden producir prdidas de aceites voltiles.
La fuerza del extracto se establece como que un gramo del vegetal seco equivale a1 centmetro cbico del lquido
(extracto).
En el laboratorio de bioqumica de alimentos se utilizan extractos acuosos y etanlicos segn el anlisis que se desea
realizar. El solvente depender de lo que se desea extraer, para seleccionar el solvente se debe tomar en cuenta la
polaridad de la sustancia a cuantificar.
La extraccin consiste en triturar finamente el tejido y colocarlo con el solvente, agitar para permitir la liberacin de las
sustancias de inters, centrifugacin para separar la fase slida (pellet) de la fase lquida (en la que se encuentra el
solvente y todo lo soluble en l), se continua con la filtracin para separar el la fase lquida de la slida. Finalmente se
conserva las muestras en congelacin o refrigeracin, segn el tiempo que transcurrir hasta su anlisis.
Para la preparacin de extractos debe tomarse en cuenta la adicin de reactivos que permiten la separacin de
compuestos especficos, por ejemplo, para la extraccin de enzimas debe aadirse al solvente PMSF que es un reactivo
que permite la separacin de las enzimas ligadas a las membranas celulares, de no colocarse el reactivo no se lograra
una total extraccin enzimtica.
Como solvente puede usarse agua destilada, solucin buffer o tampn, acetona, ter, etanol, entre otros.
REACTIVOS Y EQUIPAMIENTO DE LABORATORIO: Leer las secciones 1.2, 1.3, 1.4 y 1.5 del libro: ZUMBADO, H.
(2002) ANLISIS QUMICO DE LOS ALIMENTOS MTODOS CLSICOS. INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS
UNIVERSIDAD DE LA HABANA. Se realizar una evaluacin del contenido de estas secciones.

Prctica N 1
3. MATERIALES
Equipos
Tubo Falcon
Pescabuzo
Buzo magntico
Tubos eppendorf
Vaso de precipitacin
Pipeta 20ml
Muestras de alimentos indicadas para cada grupo
Centrfuga refrigerada
Micropipeta
Licuadora
Balanza
Reactivos
NaOH
H2O2
Sacarosa al 15 %
Buffer pH 7
4. MTODO
I) PREPARACIN DE SOLUCIONES
Normalidad:
1. Preparar 50 mL (o el volumen indicado para cada grupo) de una solucin 0,1 N de NaOH
2. Conservar la solucin en un frasco plstico.
3. Rotular
Molaridad:
1. Preparar 100 mL (o el volumen indicado para cada grupo) de una solucin 600 mM H2O2. El frasco del
reactivo tiene 10v/v y densidad 1,11 g/mL
2. Conservar la solucin en un frasco mbar en refrigeracin.
3. Rotular
Porcentaje:
1. Preparar 25 mL (o el volumen indicado para cada grupo) de una solucin de sacarosa al 15%
2. Conservar la solucin en un frasco de vidrio.
3. Rotular
II) PREPARACIN DE EXTRACTOS
1. Licuar el tejido congelado de la muestra designada a cada grupo, con pulsos de 5 segundos hasta que se
triture sin descongelarse.
2. Pesar 10 gramos de muestra y colocar en un tubo Falcon.
3. Aadir 15 mL de buffer pH 7 (proporcionado por el laboratorio).
4. Colocar un buzo magntico y agitar durante 15 minutos en refrigeracin (4C) y oscuridad.
5. Retirar el buzo usando un pescabuzo.
2

6.
7.
8.
9.
Prctica N 1
Centrifugar a 4C durante 15 minutos a 5500 rpm en la centrfuga refrigerada.

Filtrar y recoger el filtrado en tubos eppendorf. Distribuir con micropipeta.
Rotular: grupo, muestra, fecha de elaboracin.
Congelar a -18C hasta su posterior anlisis.
5. CUESTIONARIO DE INVESTIGACIN
-
Cundo empleara solventes como buffer o solucin tampn y en qu ocasiones ter? Especifique sus
ejemplos.
Qu solventes se utilizan para extraer: clorofila, antocianinas, protenas sricas, carotenoides?
Resolver:
Calcular la normalidad de 2,5 L de disolucin que contiene 25 mL de HCl sabiendo que su concentracin
es del 37 % y su densidad es de 1,25 g/mL.
Se prepara una solucin disolviendo 5 mL de H2SO4(c) (densidad del reactivo 1,98 g/mL; pureza 98%) en
un matraz volumtrico de 500 mL y diluyendo a volumen. Calcular la molaridad y normalidad de la
solucin.
6. BIBLIOGRAFA
-
AYRES, Gilbert H. 1991. Anlisis Qumico Cuantitativo. Editorial Harla.

BADUI, Salvador. 2006. Qumica de Alimentos. Cuarta Edicin. Editorial Pearson Educacin. Mxico.
UNIVERSIDAD TECNOLGICA EQUINOCCIAL

FACULTAD CIENCIAS DE LA INGENIERA
RESULTADOS PRCTICAS DE LABORATORIOS
LABORATORIO: QUMICA ANALTICA
PRCTICA No. 1
TEMA: PREPARACIN DE SOLUCIONES Y EXTRACTOS
INTEGRANTES:
FECHA
GRUPO No.
REPORTE DE RESULTADOS:
NORMALIDAD
MOLARIDAD
PORCENTAJE
CLCULOS
DISCUSIONES
EVALUACIN (10p):
Reporte de resultados /6p
Revisado por (Sello y firma):
Observaciones (Para uso exclusivo del encargado de

laboratorio):
Trabajo prctico / 3p
Entrega de material / 1p

Prctica N 2
CUANTIFICACIN DE PROTENAS (MTODO DE BIURET)

DESNATURALIZACIN DE PROTENAS
PRECIPITACIN ISOELCTRICA DE LA CASENA DE LA LECHE
1. OBJETIVOS
Cuantificar la concentracin de protenas en tejidos vegetales utilizando el mtodo de Biuret.
Reconocer agentes desnaturalizantes de protenas.
Separar la casena de la leche por precipitacin isoelctrica.
2. INTRODUCCIN
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se
aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad
especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos
propsitos.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en:
a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV,
b) para la formacin de derivados qumicos, o
c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.
Mtodo de Biuret
2+
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu y los grupos NH de los enlaces peptdicos en
2+
medio bsico. 1Cu se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la
cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas
sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de
protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
Desnaturalizacin de protenas
La desnaturalizacin de protenas es consecuencia de algn factor externo como acidez del medio,
temperatura, entre otros y no afecta a la estructura primaria. Hay casos excepcionalmente raros en los que
una protena desnaturalizada no pierde su funcin biolgica.
Agentes desnaturalizantes son aquellos factores qumicos o fsicos que producen la desnaturalizacin de las
protenas. Entre los ms comunes estn: temperatura, pH, polaridad del disolvente y fuerza inica.
Precipitacin isoelctrica de protenas
Dependiendo del pH del medio en el que se encuentren los aminocidos pueden tener carga negativa,
positiva o compensada. Por tanto la carga de una protena va a depender del tipo de aminocido que la
forman y del pH del medio en que se encuentre.
El punto isoelctrico (pI) es el pH para el cual la protena presenta carga neta compensada, y en el mismo la
solubilidad es mnima a pH>pI la carga que presenta la protena es negativa y el pH < pI la carga ser
positiva.
Modificando el pH del medio se pueden neutralizar las cargas, haciendo la carga neta igual a cero, gracias a
esto es posible purificar las protenas. Alcanzando el punto isoelctrico se precipitarn, en el caso de la
casena se precipita a un pH de 4.8 por lo cual re requiere acidificar el medio.
3. MATERIALES
Materiales:
5

Prctica N 2
Baln aforado de 10 mL
Pipeta
Tubos de ensayo
Auxiliar de pipeteo
Tubos eppendorf
Buzos magnticos
Pescabuzos
Varilla de agitacin
Soporte universal
Bureta
1 Sobre de leche descremada en polvo
1 huevo
Equipos
Vortex
Espectrofotmetro
Centrfuga minispin
Plancha de agitacin multiposiciones
Estufa
Potencimetro
Reactivos
H20 destilada
Reactivo de Biuret
BSA
HCl concentrado
Solucin de NaCl saturada
NaOH concentrado
4. MTODOS
I) Preparacin de la solucin patrn de albmina srica bovina (BSA):
Preparacin solucin madre: 10 mL; 3 mM de BSA (peso molecular 67000).
Preparar esta solucin en un baln de 10 mL.
Mantener en oscuridad (envolver en folia de aluminio) y refrigerar mientras no se est usando.
II) Curva de calibracin BSA:
Colocar en los tubos de ensayo numerados del 1 al 5 los reactivos en el orden indicado en la tabla:
Tubo
BSA
Biuret
H2O(d) (L)
No.
(3 mM) (L)
(L)
1
175
25
1000
2
150
50
1000
3
100
100
1000
4
50
150
1000
5
0
200
1000
Volumen final de reaccin en cada tubo: 1200 uL
Vortear los tubos e incubarlos por 10 minutos a temperatura ambiente (cubrirlos con film
6

trasparente)
Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotmetro.
Elaborar la curva de calibracin expresando la concentracin de protena como mM BSA
III)
Prctica N 2
Cuantificacin de protena en una muestra
Colocar 1000 uL de muestra y 1000 uL de reactivo de biuret

Vortear y dejar reposar por 10 minutos a temperatura ambiente
Transferir aun eppendorf de 1000 uL y centrifugar en una minicentrfuga por 5 minutos
Filtrar y medir la absorbancia del sobrenadante a 550nm
Realizar la medicin por duplicado.
Calcular la concentracin de protena sabiendo que el extracto contiene 0.1 g tej./ml
Si la absorbancia de la muestra no se encuentra entre valores de 0.200 y 0.800 se deber repetir la medida
aumentando el volumen de extracto y completando con H2O(d), siempre manteniendo el volumen final de
reaccin.
Si por el contrario, la absorbancia supera los 0,800 se deber colocar menor volumen de extracto, siempre
completando el volumen final de reaccin.
IV)
Desnaturalizacin de protenas
Separar la clara de un huevo y colocar una cantidad aproximada de 1 mL en 4 tubos de ensayo.

Al tubo nmero 1 aadir 2 mL de cido clorhdrico concentrado; a los nmero 2, dos ml de
disolucin saturada de cloruro de sodio; a los nmero 3, dos ml de solucin de hidrxido sdico
concentrado; y calentar suavemente (60C / 15 min) a los nmero 4 en un bao trmico, sin
aadir nada.
Anotar los resultados para cada serie de tubos.
Completar el cuadro en la hoja de resultados
V) Precipitacin isoelctrica de la leche
3.
Preparar 300 mL de leche descremada (segn la relacin que indique el fabricante) utilizar agua
corriente.
Diluir 50 mL de la solucin anterior con agua destilada a 250 mL agitar, tomar 5 mL y almacenar a
4C.
Aadir un buzo y medir el pH con agitacin constante
Con ayuda de una bureta aadir HCl 1% hasta alcanzar un pH de 4,8 o hasta observar que
aparezcan grumos.
Dejar reposar a temperatura ambiente por 10 a 15 minutos
Transferir a un tubo falcon y centrifugar durante 10 minutos a 8C
Filtrar en un papel filtro previamente pesado
Dejar secar en la estufa durante 30minutos a 40C
Pesar y calcular la cantidad de casena obtenida.
CUESTIONARIO DE INVESTIGACIN
Consulte los siguientes conceptos de espectrofotometra: Scan (Barrido) y Rate (cintica).

Cmo se prepara el reactivo de Biuret?
7

4.
-
Prctica N 2
En qu tipo de procesos es importante la desnaturalizacin de protenas y por qu?

BIBLIOGRAFA

TEMA: CUANTIFICACIN DE PROTENAS (METODO DE BIURET), DESNATURALIZACIN DE PROTEINAS, PRECIPITACION ISOELECTRICA DE LA
PRCTICA No. 2
CASEINA DE LA LECHE
INTEGRANTES:
FECHA
GRUPO No.
Curva de calibracin:
# Tubo
1
2
3
4
5
Muestra problema
CONCENTRACIN
(mM)
Absorbancia (550 nm)

Medida 1
Medida 2
ABSORBANCIA (550 nm)

2
3
Promedio ()
Concentracin
PROMEDIO ()
4
Observaciones/Discusiones
CLCULOS
Desnaturalizacin de protenas:
Muestra
# Tubo
CLARA DE HUEVO
Tratamiento aplicado
HCl (c)
NaCl (c)
NaOH (c)
Temperatura
Precipitacin isoelctrica de la leche:

MUESTRA
PESO PAPEL FILTRO
EVALUACIN (10p):
Observaciones/Discusiones
CANTIDAD DE CASENA OBTENIDA
OBSERVACIONES/DISCUSIONES

laboratorio):
10

Prctica N 3
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA PEROXIDASA

1. OBJETIVOS:
-
Determinar la actividad de la enzima peroxidasa en muestras de alimentos
Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metablicos a velocidades
compatibles con la vida, contribuyendo adems a su regulacin.
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidacin de ciertos compuestos dadores de hidrgeno, como fenoles
(guayacol, pirogalol) y aminas aromticas (o-fenilendiamina) por medio de perxidos (
). El substrato oxidable ms
usado es el guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa:
GUAYACOL
(incoloro)
TETRAGUAYACOL
(color ladrillo)
La velocidad de formacin del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad enzimtica por lecturas
espectrofotomtricas de las absorbancias en relacin con el tiempo.
La peroxidasa presenta como grupo prosttico un grupo Hemo, cuyo tomo central de hierro forma complejos con
diferentes compuestos, como los cianuros y la hidroxilamina, inhibindose su actividad enzimtica.
La actividad enzimtica depende del vegetal (los rbanos picantes son especialmente activos), del substrato oxidable
que se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se trabaja.
Como la mayora de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisan mayor
temperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la propiedad peculiar de la regeneracin enzimtica.
Este fenmeno consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad despus de un cierto
tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo parcial,
con prdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, producindose luego una reversin de la
protena a su estado normal por recombinacin de sus grupos hidrgenos o sulfhidrlicos.
Este efecto del calor sobre la actividad peroxidsica es muy importante en la industria de alimentos y la regeneracin
enzimtica de la peroxidasa puede causar serios problemas en los caracteres organolpticos. Se ha demostrado en el
laboratorio que esta actividad enzimtica puede detenerse totalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de
manera que sobre 30" la regeneracin es muy dbil generalmente.
La investigacin de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o blanqueo de verduras y
tambin en el control de pasteurizacin de la leche. As, a la temperatura de pasteurizacin, la lactoperoxidasa se
inactiva, pero se regenera; en cambio, si la leche es sobrecalentada (ms de 80-85C) la peroxidasa pierde su actividad
11

Prctica N 3
en forma definitiva.
3. MATERIALES
Tubos de ensayo
Muestras de alimentos especificadas para cada grupo
Puntas de micropipeta
Equipos
Micropipeta
Vortex
Espectrofotmetro
Reactivos
H2O2
Buffer pH 7
Guayacol 0,25%
4. MTODO
I) Medida de la actividad enzimtica
Numerar 4 tubos del 1 al 4
Colocar las soluciones tal y como se indica en la tabla:
EXTRACTO DE CAMOTE
REACTIVO
Buffer pH 7
Extracto
Guayacol 0,25%
H2O2
VARIACIN DEL EXTRACTO

Tubo 1 (uL)
Tubo 2 (uL)
Tubo 3 (uL)
900
850
800
50
100
150
500
500
500
300
300
300
Volumen final de la reaccin: 1750 uL
Tubo 4 (uL)
750
200
500
300
REACTIVO
Buffer pH 7
Extracto
Guayacol 0,25%
H2O2
VARIACIN DEL SUSTRATO

Tubo 1 (uL)
Tubo 2 (uL)
Tubo 3 (uL)
750
800
950
200
200
200
500
500
500
300
200
100
Volumen final de la reaccin: 1750 uL
Tubo 4 (uL)
1000
200
500
50
Vortear e inmediatamente medir la absorbancia de la reaccin a 470 nm

Anotar las lecturas de absorbancia a 470 nm cada 15 segundos durante 2 minutos.
Graficar las lecturas de absorbancia vs. los tiempos para obtener as la ecuacin de la reaccin.
SE RECOMIENDA TENER PREPARADOS TODOS LOS TUBOS CON LAS SUSTANCIAS DESCRITAS EXCEPTO H2O2
QUE DEBE COLOCARSE EN EL MOMENTO PRECISO PARA HACER LA MEDICIN.
II) Efecto de la temperatura
Hervir un eppendorf con extracto durante 10 minutos.
Realizar la medida de actividad enzimtica con este extracto (Igual al procedimiento realizado previamente)
12

Prctica N 3
III) Clculos
Clculo de la actividad enzimtica relativa de POX:
- Calcular el cambio de absorbancia por minuto.
- Unidad de actividad enzimtica OD/min.
Clculo de la actividad enzimtica especfica de POX:
- Dividir la actividad relativa para la concentracin de protena (determinada por el mtodo de Biuret en la prctica
anterior).
Cmo se determina experimentalmente la velocidad mxima de una reaccin enzimtica?

La actividad enzimtica de PPO (Polifenoloxidasa) y PO (Peroxidasa) cambia segn el estado de madurez y
condiciones de almacenamiento? Por qu?
Qu aplicaciones tiene la determinacin de la actividad enzimtica en alimentos?
Qu otras enzimas son importantes en el estudio de alimentos?
6. BIBLIOGRAFA
-

Biblioteca digital de la universidad de Chile. Determinacin de actividad de peroxidasa y de su regeneracin.
Mdulo dos.
13

PRCTICA No. 3
TEMA: MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA PEROXIDASA
INTEGRANTES:
FECHA
GRUPO No.
EVALUACIN (10p):

laboratorio):
14

Prctica N 4
CARBOHIDRATOS I PARTE: RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS

LIPIDOS Y EMULSIONES
1. OBJETIVOS:
Identificar glcidos (carbohidratos) y reconocimiento de la hidrlisis de un enlace de un disacrido
Conocer por medio de la elaboracin de mayonesa la formacin y caractersticas de las emulsiones como
ejemplo de un sistema coloidal en los alimentos.
Los carbohidratos se clasifican en monosacridos, oligosacridos y polisacridos. Un monosacrido, es una unidad,
ya no se subdivide ms por hidrlisis cida o enzimtica, por ejemplo glucosa, fructosa o galactosa.
Los oligosacridos estn constituidos por dos a diez unidades de monosacridos.
Desde el punto de vista qumico, los carbohidratos son polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas o compuestos que los
producen por hidrlisis cida o enzimtica. Esto es solo parcialmente cierto, pues en solucin acuosa, las estructuras de
polihidroxialdehdos o de polihidroxicetonas, permanecen en pequea proporcin en equilibrio con sus formas cclicas,
que son las ms abundantes.
MONOSACARIDOS
Muchas reacciones de los monosacridos, son debidas a la pequea cantidad de forma abierta, acclica, en equilibrio con
las estructuras cclicas. Algunas reacciones que requieren una concentracin inicial mayor fallan, el fallo se debe a que la
forma aldehdica no tiene concentracin suficiente para que se produzca la reaccin, no obstante los monosacridos
presentan una variedad de reacciones que se producen bien, las reacciones son la tpicas de las funciones presentes,
carbonilo e hidroxilo y por supuestos a interacciones entre ambos grupos.
Los monosacridos se pueden encontrar como cetosas o aldosas. Las aldosas reciben el nombre genrico de "azcares
reductores", reducen oxidantes suaves como los reactivos de Tollens (espejo de plata), Fehling y Benedit (Precipitado
Rojizo de Cu2O). Todo esto se debe a la presencia de la estructura abierta en el equilibrio de la ciclacin.
DISACARIDOS
Un disacrido, es un carbohidrato formado por dos unidades de monosacridos. Estas unidades estn unidas mediante
un enlace glicosdico. Cuatro disacridos naturales ms importantes son la sacarosa, la celobiosa, la lactosa y la
maltosa.
Sacarosa.- El azcar de mesa, sacarosa, es un disacrido formado por fructosa y glucosa, es el disacrido ms
abundante en el reino vegetal. La sacarosa no es reductora, pues el enlace entre los dos monosacridos est formado
por los hidroxilos de los carbonos anomricos.
POLISACARIDOS
Son polmeros naturales, macromolculas, formadas por monosacridos, cientos de unidades enlazadas y a veces estn
constituidas por miles de unidades. Dos ejemplos tpicos de polisacridos son el almidn y la celulosa.
Almidn.- Reserva energtica de las plantas y alimento. Se encuentra en forma en forma de pequeos granos
constituyentes de las plantas, especialmente en semillas y tejido vegetales embrionarios, en tubrculos de papa, semillas
de arroz, maz o trigo. Ellos sirven de nutrientes para el proceso germinativo y en general para el desarrollo de las
plantas.
El almidn est constituido por unidades de D(+)-glucosa enlazadas -1,4. Nuestras enzimas hidrolizan los almidones
hasta sus unidades constituyentes de glucosa, la cual, sirve a nuestro organismo de nutriente y es utilizada para
diferentes transformaciones metablicas.
Al tratar el almidn con agua caliente, este se separa en dos fracciones: una dispersable, que se conoce como amilasa y
15

Prctica N 4
otra no dispersable, que es la mayoritaria, que se conoce como amilopectina.

EMULSIONES Y LPIDOS
Las emulsiones son sistemas coloidales constituidos por dos lquidos, los cules no se disuelven el uno en el otro. De los
dos lquidos, uno se encuentra disperso en pequeas gotas dentro del otro. Si los dos lquidos se juntan y se mezclan, al
dejarlos en reposo, se separan en dos capas; pero si se aade un emulgente, la emulsin es ms estable, y tarda mucho
ms tiempo en separase en las dos capas.
De forma general una emulsin posee los siguientes componentes:
Fase Dispersa o interna: Consta de las gotas suspendidas
Fase Continua o externa: Fase en la que estn suspendidas las gotas
Emulsionantes: Conocidos tambin como agentes emulsionantes, emulgentes o surfactantes; son utilizados
para mantener las gotas de un lquido suspendidas en otro lquido siendo originalmente los dos lquidos
inmiscibles.
Las mezclas Aceite en una fase continua de agua (Ac / Ag) y Agua en una fase continua de aceite (Ag/Ac) son los tipos
de emulsiones ms comunes.
Las emulsiones tienen diversas funciones importantes en los alimentos: algunos alimentos estn en la naturaleza como
emulsiones; otros son por s mismos agentes emulsionantes y la consistencia o estructura de algunos alimentos
preparados depende del desarrollo y mantenimiento de una emulsin. Las emulsiones se utilizan como vehculos para
adicionar agentes aromatizantes, para diluir ingredientes y para ocultar olores o sabores no deseables. Las emulsiones
alimentarias pueden presentarse de forma natural, como en la leche o ser preparadas en alimentos como la mayonesa y
las masas pasteleras.
Para identificar los tipos de emulsiones pueden determinarse de varias maneras, todas basadas en el hecho de ms las
propiedades de su fase externa que la fase interna; una de las maneras se basa en el uso de la solubilidad en agua, en
colorantes y su capilaridad en el papel de filtro.
3. MATERIALES
Equipos
Tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Cpsulas de porcelana
Aceite comestible
Vinagre
Sal
Azcar
Colorante artificial
Esptulas
Muestras indicadas para cada grupo
Bao trmico
Pipeta
Auxiliar de pipeteo
Batidora
Licuadora
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Prctica N 4
Balanza
Reactivos
Fehling A y Fehling B
Glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa, almidn al 1%
Lugol
HCl al 10%
4. MTODOS
RECONOCIMIENTOS DE GLCIDOS
I) Investigacin de azcares reductores mediante Reaccin de Fehling:
Enumerar 5 tubos de ensayo y colocar:
Tubo 1: 0.5 mL de glucosa
Tubo 2: 0.5 mL fructosa
Tubo 3: 0.5 mL sacarosa
Tubo 4: 0.5 mL maltosa
Tubo 5: 0.5 mL almidn.
Aadir a cada tubo 0.5 mL de Fehling A y 0.5 mL de Fehling B. El lquido del tubo de ensayo adquirir
un fuerte color azul.
Calentar los tubos en un bao de agua hirviendo hasta observar cambio de color.
La reaccin ser positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo.
La reaccin ser negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azul-verdoso
Estos resultados nos indican que la glucosa tiene carcter reductor.
II) Investigacin de azcares no reductores
Tomar 0.5 mL de solucin de sacarosa y aadir 0.5 mL de cido clorhdrico al 10%.
Calentar en un bao de agua hirviendo durante un par de minutos.
Dejar enfriar y realizar la Prueba de Fehling.
La reaccin positiva indica que se roto el enlace O-glucosdico de la sacarosa.
IV) Investigacin de almidn por reaccin del Lugol:
Este mtodo se usa para identificar polisacridos. El almidn en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol
(disolucin de yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta caracterstico.
Enumerar 4 tubos de ensayo y colocar:

Tubo 1: 0.5 mL de glucosa
Tubo 2: 0.5 mL fructosa
Tubo 3: 0.5 mL sacarosa
Tubo 4: 0.5 mL almidn.
Aadir 5 gotas de lugol.
Si la disolucin del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reaccin es positiva.
Adicionalmente, calentar el tubo positivo de la reaccin con lugol (almidn) y luego introducir en un vaso con
agua fra.
Observar y volver a calentar.
FORMACIN DE EMULSIONES:
I FASE: FORMACION DE LA EMULSIN
Colocar el emulgente (una yema de huevo) en una taza redonda honda de plstico.
Agregar una pizca de sal, pizca de azcar y una cucharada de vinagre tibio
Mezclar bien con una batidora hasta obtener una suspensin uniforme
17

Prctica N 4
Agregar una media cucharada de aceite sin dejar de batir hasta cuando ya no se observe aceite libre sobre la
superficie de la suspensin
Dejar en reposo por 20 minutos
Repetir esta ltima operacin con adicin de otro media cucharada de aceite
Repetir dos veces con una cucharada de aceite y una vez con 2 cucharadas simultneas de aceite
Agregar una cucharada de vinagre tibio y aplicar el batidor hasta lograr una mezcla completa
Repetir una vez ms la adicin de batido y reposo con dos tandas de 1 o 2 cucharadas de aceite.
II FASE: EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LAS EMULSIONES
Rotular 2 tubos de ensayo y colocar 2 gramos de la mayonesa preparada por cada grupo y en otro tubo la muestra
designada a cada grupo.
Introducir los tubos en un bao trmico cuando el agua est hirviendo
Observar si existe la formacin de fases (una acuosa y orgnica).
Medir la altura de ambas fases mientras permanecen caliente (en caso de que se formen)
Anotar los resultados.
III FASE: IDENTIFICACIN DE EMULSIONES FRECUENTES EN ALIMENTOS
Colocar una pequea cantidad de emulsin (10 g) preparada en una cpsula de porcelana y otra de la muestra
de cada grupo.
Colocar 3 gotas de colorante artificial (no remover)
Observa si la superficie de la emulsin se colorea
Identificar si es una emulsin Ac/Ag o Ag/Ac
Si la emulsin es Ac/Ag el colorante se dispersa.

Si la emulsin es Ag/Ac el colorante no se extiende, lo repele.
Qu tipo de emulsiones se usan en la industria alimentaria?
Qu enzima logra en el aparato digestivo la hidrlisis de las grasas?
Qu significa el trmino cualescencia?
Qu establece la Ley de Stokes?
Qu otras pruebas pueden emplearse para identificar azcares reductores? Describa brevemente cada uno de
ellos.
Cmo se puede determinar la presencia de edulcorantes en productos alimenticios?
6. BIBLIOGRAFA
18

PRCTICA No. 4
TEMA: CARBOHIDRATOS I PARTE: RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS. LIPIDOS Y EMULSIONES
INTEGRANTES:
FECHA
GRUPO No.
RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS
Muestra
Glucosa
Fructosa
Sacarosa
Maltosa
Almidn
Glucosa
Fructosa
Sacarosa
Almidn
Sacarosa
REACCIN
RESULTADO
CLASIFICACIN
Fehling
Lugol
Hidrlisis cida de la
sacarosa + Fehling
DISCUSIONES
19
EFECTO DE LA TEMPERATURA (FASE II)

ALTURAS
MUESTRAS
FASE:
OBSERVACIONES/DISCUSIONES
FASE:
TUBO 1:
TUBO 2:
IDENTIFICACIN DE EMULSIONES FRECUENTES EN ALIMENTOS (FASE III)

MUESTRAS
COLORACIN
SI
NO
RESULTADOS
Ac/Ag
Ag/Ac
Cpsula 1:
Cpsula 2:
DISCUSIONES
EVALUACIN (10p):

laboratorio):
20

Prctica N 5
ANTIOXIDANTES: DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL

CUANTIFICACIN DE CIDO ACRBICO EN ZUMOS DE FRUTAS
1. OBJETIVOS:
Determinar la capacidad antioxidante de alimentos mediante el mtodo ABTS
Determinar la concentracin de cido ascrbico en zumos de frutas mediante yodometra.
Las oxidaciones son reacciones qumicas de transferencia de electrones entre un agente oxidante y un reductor. Bajo
determinadas condiciones estas reacciones redox pueden generar molculas altamente inestables capaces de
reaccionar con oxgeno o con otras molculas generando un desbalance redox, en el cual las oxidaciones se propagan a
molculas vecinas.
4.1.
Antioxidante
Es una molcula capaz de retardar o prevenir la oxidacin de otras molculas, impidiendo o terminando las oxidaciones
en cadena. Aunque las reacciones de oxidacin son cruciales para la vida, tambin pueden ser perjudiciales; por lo tanto
las plantas y los animales mantienen mltiples sistemas antioxidantes, tales como glutatin y otros tioles, vitamina C, y
vitamina E, as como enzimas tales como la catalasa, superxido dismutasa y varias peroxidasas. Por su parte en los
vegetales los polifenoles son muy importantes como antioxidantes.
En los ltimos tiempos la determinacin del contenido de antioxidantes se ha empleado como una herramienta para
promover el consumo y sumarle valor agregado a productos de origen natural.
4.2.
Caracterstica principal de los antioxidantes
La principal caracterstica de un antioxidante es su capacidad para atrapar los radicales libres. Los radicales libres y
especies reactivas de oxgeno estn presentes en los sistemas biolgicos de una gran variedad de fuentes. Estos
radicales libres pueden oxidar cidos nucleicos, protenas, lpidos o el ADN y pueden iniciar la enfermedad degenerativa.
Compuestos antioxidantes como los cidos fenlicos, polifenoles y flavonoides inhiben los mecanismos de
oxidacin que conducen a enfermedades degenerativas.
4.3.
La actividad antioxidante se ha expresado de diversas maneras:

-
Incluyendo el porcentaje del reactivo utilizado,

la tasa de inhibicin de oxidacin, entre otros.
Una forma ms fcil de presentar la actividad antioxidante de los alimentos sera hacer referencia a un
patrn de referencia comn, por ejemplo Vitamina C, Trolox, etc.
La reaccin del ABTS se basa en la siguiente, presencia de hemoglobina:
La frmula del ABTS es

21

Prctica N 5
ABTS significa: 2,2- AZINIBIS(3-ETILBENZOTIAZONIL-6-SULFONICO)

Al igual que el DPPH, la determinacin del porcentaje de inhibicin del ABTS se basa en la ecuacin:
La preparacin del reactivo ABTS sigue el siguiente protocolo:

Ensayo de decoloracin del radical catin ABTS*+
1) Preparar 5ml de 7mM de ABTS (PM= 548.68) con 2.45mM K2S2O8 (PM=270) en H2O (concentraciones finales).
2) Dejar en la oscuridad de 12-16 h A temperatura ambiente, sin agitacin. (Se forma el radical ABTS*+).
3) Es estable por 2 das en la oscuridad a temperatura ambiente. Para conservarlo ms tiempo colocar en
eppendorf de 1ml y guardarlo a -18 C (luego 4 meses sigue utilizable).
4) Cuando se vaya a usar, descongelar un eppendorf e ir sacando con una pipeta alcuotas para diluir con etanol
llegando a 0.700+/- 0.05 de Abs a 734nm. (Con 200 L se preparan aproximadamente 25 ml). Es muy
importante que la dilucin se realice en agitador magntico, cuando se llegue a una absorbancia cercana se
deja agitando por lo menos 45 min. para estabilizar el reactivo. Luego de ese tiempo comprobar que la Abs no
se apart demasiado y que la misma sea estable, si se movi mucho de 0.700 corregir con pequeas
cantidades de ABTS o diluir con piceta con etanol y dejar estabilizar un rato ms. Puede pasar que la Abs sigue
variando luego de 45 min, dejar un rato ms agitando.
VITAMINAS
El ser humano, es incapaz de sintetizar la vitamina C (cido ascrbico) por lo que debe ingerirla a travs de los
alimentos. La vitamina C es sensible a la luz, al oxgeno y a la temperatura, por ello es recomendable el consumo de
frutas y verduras crudas o poco cocidas. Por estas razones, ser un objetivo la aplicacin de tecnologas que permitan
retener el mximo contenido de vitamina C durante el procesado y almacenamiento del producto.
El AsA es especialmente sensible a la oxidacin cuando la reaccin est catalizada por iones metlicos como el Cu2+ y
el Fe3+. El calor y la luz aceleran el proceso, y factores como el pH, la concentracin de oxgeno y la actividad de agua
influyen en la velocidad de reaccin.
La vitamina C es muy sensible y se destruye cuando el producto es sujeto a condiciones adversas de manipulacin y
almacenamiento. La prdida de esta vitamina aumenta en largos tiempos de almacenamiento, altas temperaturas, baja
humedad relativa, dao fsico del producto y dao por fro.
Las funciones del cido ascrbico estn basadas en sus propiedades de xido-reduccin: acta como cofactor
enzimtico y puede reaccionar fcilmente con radicales libres actuando como antioxidante y pasando el mismo a ser un
radical ascorbilo (monodehidroascorbato), que rpidamente se descompone para producir cido ascrbico y cido
dehidroascrbico. Mediante estas reacciones, la vitamina C captura radicales libres potencialmente txicos como los
radicales superxido o hidroxilos.
Los frutos y hortalizas que tienden a ser las mayores fuentes de vitamina C son, entre otros: el pimiento (rojo) y los
ctricos, las fresas, la coliflor, el repollo.
22
Prctica N 5
Fuente
Vitamina C (mg/100 g)
Acerola
1600
Guayaba
300
Grosella negra
200
Pimiento rojo
190
Perejil
130
Kiwis
90
Brcoli
80
Grosella
80
Coles de Bruselas
80
Caqui
60
Papaya
60
Fresa
60
Naranja
50
Limn
40
Meln
40
Coliflor
40
Pomelo
30
Por su importancia nutricional, el cido ascrbico ha sido ampliamente cuantificado en las plantas, sin embargo, su
funcin en la clula no ha sido totalmente dilucidada.
Se usar yodo (I2) para oxidar la vitamina C. Cuando todo el cido ascrbico haya sido oxidado, el exceso de yodo
reacciona con el indicador almidn para formar el complejo caracterstico yodo-almidn de color azul oscuro. Con este
procedimiento se puede determinar la masa (mg) de vitamina C por mililitro de bebida de frutas.
3. MATERIALES
Equipos
Eppendorf
Tubos de ensayo
Erlenmeyers
Pipetas
Auxiliar de pipeteo
Buretas
Muestras indicadas para cada grupo
Espectrofotmetro
Micropipeta
Campana de extraccin de gases
Balanza
Reactivos
23

Prctica N 5
Radical ABTS
Solucin patrn de cido ascrbico 1%
Solucin yodo 0,025N
Solucin almidn 1%
HCl 3M
4. MTODO
MEDIDA DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
-
Medir la Absorbancia del reactivo y dejarla como base para el clculo del % de reduccin del ABTS*+.
Rotular 5 tubos del 1 al 5
En cada tubo ensayo realizar las siguientes mezclas:
# DE TUBO CANTIDAD DE RADICAL ABTS (uL) CANTIDAD DE EXTRACTO (uL)
1
1000
10
2
1000
20
3
1000
30
4
1000
40
5
1000
50
Agitar y medir la absorbancia a 734nm luego de 6 min.

*El porcentaje de reduccin de la absorbancia debe estar entre el 20 y 80 % para que la medida sea vlida. *Agitar
siempre el reactivo.
Los resultados se expresan como % de reduccin del ABTS+ por masa de tejido, tomando como base la Abs del
reactivo.
CUANTIFICACIN DE CIDO ASCRBICO
Exprimir las frutas hasta obtener aproximadamente 100 mL de jugo.
Filtrar el jugo en filtro de tela.
Pesar un erlenmeyer limpio y seco.
Utilizando una pipeta volumtrica, se transfieren 10mL de la bebida a un erlenmeyer limpio y seco.
Pesar el volumen de jugo aadido
Aadir 20 mL de agua destilada, 5 gotas de HCl 3M (catalizador) y 10 gotas de solucin de almidn al 1%.
Valorar la bebida en el erlenmeyer aadiendo despacio y con agitacin la solucin de yodo, hasta que el
indicador vire a un color azul. (No se da un cambio dramtico en la coloracin).
Anotar el volumen de yodo utilizado.
Realizar la determinacin por triplicado. Con los datos obtenidos se puede determinar la masa (mg) de vitamina
C por mL de bebida de frutas.
Clculo de la concentracin de cido ascrbico en la muestra aplicar la siguiente frmula:
g AsA = V(I2 consumido) x N(I2) x 100
peso de muestra
Qu es el cido dehidroascrbico?
Qu es el ciclo de Halliwell Asada?
Cmo se prepara el radical ABTS ?
24

Prctica N 5
Qu es el trolox?Por qu se utiliza como patrn para determinar la capacidad antoxidante total?

Qu son los mtodos DPPH, FRAP y ORAC?
6. BIBLIOGRAFA
Blokhina, O.; Virolainen, E. y Fagerstedt, K. (2002). Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprovation
stress: a review. Annals of Bot.. 91, 179-194.
Brand-Williams, W.; Cuvelier, M.E. y Berset, C. (1995). Use of free radical method to evaluate antioxidant
activity. Lebensm. Wiss. Technol. 28, 2530.
25

PRCTICA No. 5
TEMA: ANTIOXIDANTES: DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL. CUANTIFICACIN DE CIDO ACRBICO EN ZUMOS DE FRUTAS
INTEGRANTES:
FECHA
GRUPO No.
CURVA DE CALIBRACIN PATRN ABTS
CANTIDAD
RADICAL ABTS (uL)
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
CANTIDAD DE
TROLOX (uL)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
ABSORBANCIA
(734 nm)
CLCULOS
DISCUSIONES
26
# TUBO
1
2
3
4
5
CANTIDAD DE
RADICAL ABTS (uL)
CANTIDAD DE EXTRACTO
(uL)
1000
1000
1000
1000
1000
% DE REDUCCIN
MUESTRA
MUESTRA
ABSORBANCIA (734 nm)

MUESTRA
MUESTRA
MUESTRA
10
20
30
40
50
CLCULOS
DISCUSIONES
CUANTIFICACIN DE CIDO ASCRBICO

27
MUESTRA
PESO DE LA MUESTRA (g)

1
VOLUMEN DE I2 CONSUMIDO (mL)

1
PROMEDIO ()
DESVIACIN
ESTNDAR ()
REPORTE DE
RESULTADOS ()
CLCULOS
DISCUSIONES
EVALUACIN (10p):

laboratorio):
28

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Bioq. Mara Jos Andrade MSc.

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Centrifugar a 4C durante 15 minutos a 5500 rpm en la centrfuga refrigerada.

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Cuantificacin de protena en una muestra

Colocar 1000 uL de muestra y 1000 uL de reactivo de biuret

Separar la clara de un huevo y colocar una cantidad aproximada de 1 mL en 4 tubos de ensayo.

V) Precipitacin isoelctrica de la leche

Consulte los siguientes conceptos de espectrofotometra: Scan (Barrido) y Rate (cintica).

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En qu tipo de procesos es importante la desnaturalizacin de protenas y por qu?

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Absorbancia (550 nm)

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Precipitacin isoelctrica de la leche:

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Determinar la actividad de la enzima peroxidasa en muestras de alimentos

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Vortear e inmediatamente medir la absorbancia de la reaccin a 470 nm

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otra no dispersable, que es la mayoritaria, que se conoce como amilopectina.

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Enumerar 4 tubos de ensayo y colocar:

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La actividad antioxidante se ha expresado de diversas maneras:

Incluyendo el porcentaje del reactivo utilizado,

La frmula del ABTS es

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