INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DEL ORIENTE

DEL ESTADO DE HIDALGO

NOMBRE
Anilu Hernndez Olvera
Ingeniera en Industrias Alimentarias
MATERIA
Microbiologa
ASESOR
Q.F.B Francisco Monter J
PRACTICA 8
PRUEBAS DE DIFERENCIACIN BIOQUMICA

PRACTICA No. 8
PRUEBAS DE DIFERENCIACIN BIOQUMICA

Objetivo.
Realizar algunas pruebas bioqumicas en medios de cultivo con sustratos
especficos que permitirn demostrar actividades metablicas de bacterias y
levaduras y comprenda la importancia de las pruebas bioqumicas para la
caracterizacin e identificacin de estos microorganismos.
Introduccin
Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de
manera detallada su actividad bioqumica, porque otras caractersticas no son
suficientemente distintivas o diferenciales.
En el laboratorio disponemos de numerosas tcnicas para la caracterizacin
bioqumica de una especie. Adems de los productos finales de los procesos
metablicos, tambin se necesita conocer con detalle como se producen estos
cambios, como ocurren paso a paso las reacciones qumicas, cules enzimas
intervienen, cuales son los productos intermediarios adems de que se deben
reconstruir las secuencias de las reacciones bioqumicas que tienen lugar
dentro de la clula. En general el microorganismo se cultiva en medios que
contienen una sustancia nutritiva especfica o sustrato y despus de la
incubacin del cultivo se examina para ver los cambios qumicos que hayan
ocurrido.
Las pruebas bioqumicas observan los niveles de estos desordenes y pueden
ser utilizadas para detectar varias condiciones metablicas diferentes. Las
pruebas bioqumicas consisten en distintos exmenes qumicos aplicados a
medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar
distintos microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la
actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un
medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los
cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en
estudio.
De la amplia variedad en pruebas bioqumicas, nosotros utilizaremos 6, las
cuales son:
1. MEDIO TSI ( TRIPLE AZUCAR, HIERRO)
2. MEDIO CITRATO DE SIMMONS
3. MEDIO LIA(LISINA HIERRO AGAR)
4. MEDIO UREA
5. MEDIO FENILALANINA( AGAR FENILALANINA)
6. MEDIO MIO( MOTILIDAD, INDOL, ORNITINIA)
Material, Equipo y Reactivos
Especificaciones
1 Gradilla
1 Probeta de 100 ml.
Vasos de precipitados de 250 ml
1 Asa de siembra
.
1 Tubo con 7 ml de medio MIO (Movilidad, Indol,

Ornitina)
1 Tubo con 7 ml de medio TSI (triple azcar
hierro) solidificados en forma inclinada
1 Tubos con 7 m* de caldo urea
1 Tubo con 7 ml de medio LIA
2 Tubos con 7 ml medio de citrato de Simmons
solidificados en forma inclinada
1 Parrilla de agitacin
3 Matraces Erlen meyer de 50 ml
1 Mechero
2 Tubos con 7 ml de medio SIM (Sulfuro, Indol,
Motilidad)
2 tubos con 7 ml de leche tornasolada
Medidas de seguridad:
Las establecidas para un laboratorio de Microbiologa.
Uso de bata de laboratorio, limpia y abrochada.
Desarrollo:
1. Una vez que se aisl una bacteria de preferencia entero bacteria se
procede a sembrar como le indique el profesor en cada uno de los
tubos.
2. Incubar a 37C durante 24 48 horas.
3. Reportar resultados.
4. Identificar gnero y especie.
Cuestionario:
1. Explique el fundamento de cada una de las reacciones que ocurren en
cada una de las pruebas de identificacin bioqumica.
2. Escribe cada una de las reacciones que ocurren en las pruebas de
identificacin bioqumica.
Resultados.
MORFOLOGIA COLONIAL:

Caractersticas
Color
Forma
Elevacin
Margen
Superficie
Densidad
Consistencia

EMB
Rosa
Regular
Monticular
Circular
Lisa
Densa
Suave

S110
Blanco
Irregular
Monticular
Circular
Rugosa
Densa
Dura

PDA
Blanco
Irregular
Monticular
Circular
Lisa
Densa
Suave

MORFOLOGIA MICROSCOPICA
La primera tincin realizada del medio PDA se observo levaduras. Como en la
siguiente figura.

Al observar las tinciones de las colonias en SyS pudimos ver cocos Gram
negativas.
Como se muestra en la figura.

Pruebas bioqumicas:
OXIDASA

SyS
Caf
Irregular
Monticular
Circular
Lisa
Suave

MEDIO.
S110
PDA
SyS
EMB

OXIDASA.
NEGATIVA
NEGATIVA
POSITIVA
POSITIVA

UREA
Negativo
MIO
Movilidad: Positiva
Ornitina: Positiva
LIA
Lisina: positiva
TSI
Alcalino/Acido: K/A
Acido sulfdrico: Negativo
Produccin de gas: Negativo
CS
Produccin de gas
Color metlico

Discusin de resultados
La importancia de la identificacin bioqumica de un microorganismo es muy
importante ya que se debe de tener en cuenta todas sus caractersticas es por
eso que se debe de saber que es la reaccin que se hace o realiza en cada
prueba para as determinar que es lo que puede realizar, sintetizar y poder
usarla para nuestro bien en los trabajos que as lo requieran.
Conclusiones.
En esta prctica logramos identificar mediante tinciones y adems pruebas
bioqumicas el tipo de microorganismo que estamos estudiando o tratando de
identificar a travs de sus caractersticas bioqumicos, estos mtodos deben
ser bsicos para un ingeniero en industrias alimentarias debido a que debe
controlar e identificar constantemente microorganismos con los que vaya a
trabajar
Cuestionario:
1. Explique el fundamento de cada una de las reacciones que ocurren
en cada una de las pruebas de identificacin bioqumica.

OXIDASA
La oxidasa, es una prueba que se usa para poner de manifiesto el sistema
citocromoxidasa, que se encuentra en organismos aerobios, anaerobios
facultativos y ocasionalmente en microaerfilos, careciendo los anaerobios
estrictos de esta. El mtodo ms frecuento es el indirecto, se realiza en un
trocito de papel de filtro, de forma que colocamos una gota del reactivo de
Kovacs en el papel y posteriormente tomamos parte de nuestra colonia con el
asa de siembra, que frotaremos sobre el papel. El resultado ser positivo se se
produce una reaccin de color a los pocos segundos.
UREA
Pone de manifiesto la actividad de la enzima ureasa, para degradar la urea en
dos molculas de amoniaco. El medio lleva como indicador Rojo fenol, que se
torna amarillo cuando es negativo y rosa cuando es positivo. Hay que tener
precaucin por que tambin puede ocurrir que no se produzca cambio de
coloracin, en este caso es negativo. el medio posee un color rosceo.
CS
Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como
nica fuente de carbono y compuesto amoniacales como nica fuente de
nitrgeno. El medio contiene citrato sdico, fosfato de amonio y azul de
bromotimol como indicador; este se tornar azul cuando el medio se basifica.
Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio
(degradacin del fosfato amnico) lo que provoca que este se alcalinice y el
indicador vire azul.
LIA
Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). el medio contiene como
indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio
se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo.
- Si es productora de c. sulfhdrico, en cuyo caso el precipitado negro nos
impedir ver si es LDC + o -.
- Si es productora de gas.
TSI
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido
sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales
se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro.

El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance

osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio
del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego
con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro
MIO
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de
extracto de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes
cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin
de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la
ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el
prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de
color
prpura
y
en
medio
cido
es
amarillo.
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:
movilidad,
presencia
de
ornitina
decarboxilasa
e
indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento
que
difunde
mas
all
de
la
lnea
de
inoculacin.
La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio.
Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una
condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol
vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la
actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina
presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje
del
indicador
hacia
el
color
prpura.
El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que
contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de
agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado
positivo.

2. Escribe cada una de las reacciones que ocurren en las pruebas de

identificacin bioqumica.
CITRATO DE SIMONS: Medio utilizado para la diferenciacin de
enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de
carbono y energa.
UREA: Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la
actividad uresica. Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae
MIO: Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su
movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol.

LIA: Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente

Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la
produccin de cido sulfhdrico.
TSI: Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias,
en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de
cido sulfhdrico.

Bibliografa
http://perso.wanadoo.es/microdominguez/a.htm
http://www.solomanuales.org/manuales_microbiologia-manuall215570.htm
http://www.buenastareas.com/ensayos/Pruebas-Bioquimicas/321533.html