[LABORATORIO N5 MICROBIOLOGIA AMBIENTAL]

Practica n4: Recuento total de microorganismos en

placa Petri. Expresin de resultados, caractersticas
de colonias. Siembra de microorganismos de medio
solido a liquido (Caldo)

INTEGRANTES:

Juan Reynaldo Ranilla Yanac

PROFESOR:

Prof. Martin Martinez

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1. Objetivos

Determinar la carga microbiana para evaluar su calidad higinico sanitaria

Realiza la caracterizacin de colonias.
Aprender la tcnica de siembra de los microorganismos de un medio solido
lquido utilizando un asa de siembra.
Observar el comportamiento de las bacterias en medio lquido.

2. Introduccin Fundamento

Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras lquidas u

homogeneizadas).
- Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento.
Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no
puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un indicador de las
caractersticas higinicas generales del alimento.
- Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio limitado en
nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos fermentados) y de las
condiciones de incubacin (mesfilos, psicrfilos) los microorganismos analizados sern
miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de
microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en
ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer
recuentos de anaerobios totales.
- Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del proceso.
- Hay cuatro tcnicas biolgicas bsicas tcnicas de recuento de viables:.
a)
b)
c)
d)

Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count).

Determinacin del nmero ms probable.
Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables.
Contaje microscpico directo.

1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del
alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el
mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las
caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como
en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la
flora psicotrofa. Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en

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una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando
concentraciones progresivamente ms diludas de la muestra.
2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros
con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se
coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber
sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la
epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie especficamente
los cidos nucleicos).
3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct Epifluorescence
Filter Technique (tcnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta tcnica las
bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se
trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teir las clulas
bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para
destruir las clulas somticas). La deteccin de los microorganismos ha de hacerse
mediante microscopa de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la
epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias
que son ms fcilmente dtectables.
4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de agarcultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio.
5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan
gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el
crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin.
6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales
o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la
incubacin se hace el recuento.
7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo
estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede
hacer con 3 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto.
8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o
resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto
es medible. Usado en medios lquidos (lcteos).
9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se
forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.
10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un volumen
determinado y se recuentan las bacterias.

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MORFOLOGA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS

Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de una
Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque vara de tamao
generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo microorganismo o
bien un grupo de microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias
que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color
caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es
constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la
forme.
Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y
combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven
para identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, adems de stas
caractersticas se requiere tambin estudiar la fisiologa y propiedades inmunolgicas
de las bacterias para poder realizar una identificacin completa. La morfologa colonial
es comparable a una estadstica ya que se deriva de una clula individual pero es la
caracterstica de la masa celular.
Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las especies
y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios milmetros.
Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En la figura 2 se pueden observar
varias formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia
seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega
al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar..
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con
muescas concntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede
aparecer con textura granular o amorfa.

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3. Procedimiento
A. Calculo de recuento estndar en placa

Seleccionar dos placas que contengan 30-300 colonias para un recuento

evidente y facilitado.
Empleando el contador de colonias hallamos la media aritmtica de los 2
recuentos y lo multiplicamos por el factor de dilucin.
Si se tienen 2 diluciones consecutivas entre 30 y 300 se toma el promedio
de los 2 recuentos.
Si el nmero de colonias de 2 diluciones continuas estn dentro del rango
de 30 300 se reporta el recuento estndar de menor valor.
B. CLCULO AL ESTIMADO DEL RECUENTO STANDARD EN PLACA

Si las placas en todas las diluciones muestran ms de 300 colonias. Se

divide la Placa Petri en 8 con un marcador y se multiplica el nmero de
colonias obtenidas en la octava parte por el nmero de divisiones y por el
factor de dilucin.(unidades UFC/gr)

C. CARACTERIZACIN DE COLONIAS
Realizamos la caracterizacin de colonias
Inoculamos 12 tipos de bacterias diferentes y las llevamos a un caldo
nutritivo.
Luego de incubarlas, las llevamos al refrigerador.

D. PREPARACIN DEL CALDO NUTRITIVO Y EL CALDO BMI (los prepar el

profesor)
Las muestras de suelo se cultivan en el caldo BMI.

Inoculacin de muestra bucal se cultiva en el caldo nutritivo.

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4. Resultados experimentales
Siembra de solido a lquido (caldo BHI)

Colonia 1
Colonia 2
Colonia 3
Colonia 4
Colonia 5

Colonia 6

Colonia 7

Colonia 8
Colonia 9

Boca

observaciones
Nulo crecimiento de colonias, el BHI se
mantiene igual como se dej.
Poca turbidez, ligero crecimiento de
colonias en la superficie y base.
Alta turbidez, poco crecimiento de colonias
en la superficie y base.
Alta turbidez, poco crecimiento de colonias
en la superficie y base
Regular turbidez, formacin de una colonia
en forma de algodn, por debajo de la
superficie del BHI
Poca turbidez, abundante crecimiento en la
superficie, colonia de aspecto seco y
slido.
Poco crecimiento de colonias en la
superficie y en la base del tubo, alta
turbidez.
Regular turbidez, no existe crecimiento de
colonias en la superficie ni en la base.
Regular turbidez, no existe crecimiento en
la superficie, poco crecimiento de la
colonia en la base del tubo.
Regular turbidez, no hay formacin de
colonias en la superficie del BHI, existe
abundante crecimiento de colonias en la
base del tubo.

Mano

Poco crecimiento de la colonia, solo creci

alrededor del tubo. Alta turbidez.

Coliforme:

Alta turbidez, abundante crecimiento de

colonias en la superficie color crema, no
tiene sedimento.

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Caracterizacin de colonias
Colonia 1
Colonia 2
Colonia 3
Colonia 4
Colonia 5
Colonia 6
Colonia 7
Colonia 8
Colonia 9
Colonia 10
Colonia 11

Forma
Circular
Fusiforme
Puntiforme
Circular
Circular
Irregular
Puntiforme
Circular
Rizoide
Circular
Rizoide

Superficie
Plana
Acuminada
Acuminada
Plana
Papilado
Plana
Plana
Plana
Papilar
Papilar
Acuminado

Borde
Circular
Circular
Circular
Redondeada
Lubular
Redondeada
Redondeado
Redondeado
Ondulado

color
transparente
Opaco
blanquecino
Transparente
Opaco
Blanquecino
Blanquecino
Transparente
Opaco
Opaco
opaco

5. Discusiones observaciones

6.

El recuento nos determina la vida til del producto a examinar

En (
se observa una contaminacin externa, eso se debe por utilizar
instrumentos no esterilizados

Recomendaciones

Usar instrumentos esterilizados

Hacer las siembras cerca de un mechero para evitar contaminacin externa

7. Bibliografia

http://www.unavarra.es/genmic/recuento%20microorganismos.htm
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/iesvicen/depart/biolog/pdf/p16.pdf
http://microdonto.files.wordpress.com/2009/03/morfologia-de-las-coloniasbacterianas.pdf
Material fotogrfico: lisseth vergaray baiss

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Resultados (Boca Mano)

8. Anexos